一种使用关节滑膜炎的临床前模型 离体 具有保留功能与结构的人类滑膜组织

摘要

我们开发了一种人源ex vivo transwell系统，可用于评估滑膜的急性炎症、感染及结构变化。

摘要

关节炎是一种累及关节的炎症状态，可导致软骨损伤、疼痛及活动能力丧失。近期关节炎研究进展明确表明，关节囊（例如滑膜）是此类炎症的重要来源，但目前尚无能够复制关键滑膜结构的人体模型。为解决这一问题，研究人员开发了关节腔分析系统（Joint Space Analysis System, JSAS）。在患者接受全膝关节置换术（TKA）过程中，术中获取其前部滑膜组织。将滑膜组织解剖并切割成直径3 mm的活检组织芯。将组织芯置于Transwell上室，加入300 µl含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，Transwell孔径为5 µm或0.4 µm。在下室中加入600 µL培养基，并每2–3天更换一次。在高氧（50%）、大气/标准（约21%）和生理氧（5%）三种培养条件下，评估组织活力达7天。下室中添加的刺激物包括单核细胞趋化蛋白1（MCP-1/CCL2）、脂多糖（LPS）、N-乙酰半胱氨酸、S. aureus 和 B. burgdorferi。培养基用于ELISA检测，组织则保存用于甲醛固定石蜡包埋（FFPE）分析。在标准培养条件下，滑膜组织可维持完全活力达3天。刺激物可改变滑膜衬里层及衬下层细胞的结构与功能，包括固有巨噬细胞边界消失、衬下层扩张、致病性成纤维细胞上调，以及白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子α（TNFα）的产生。通过流式细胞术分析发现，免疫细胞和成纤维细胞可迁移至下室（5 µm孔径）。具有运动能力的 B. burgdorferi 可穿过0.4 µm孔径进入组织，而非运动型的 S. aureus 则不能。相关细胞因子表达量足以进行ELISA检测。JSAS是一种模块化系统，可用于研究人类滑膜的急性改变，在维持生物学相关结构与功能的同时，为临床前模型中复杂的三维结构研究提供了可能。

引言

关节炎影响了超过20%的美国成年人以及50%年龄超过65岁的慢性病患者¹。它也是全球范围内导致残疾的主要原因之一²。关节炎不仅包括软骨损伤，还涉及关节囊或滑膜的炎症（例如滑膜炎）。慢性滑膜炎可能是骨和软骨损伤过程中促炎性细胞因子的重要来源，在骨关节炎和类风湿关节炎中起着加剧作用^3,4。因此，了解滑膜内由免疫介导的变化，对于开发针对关节炎患者的新疗法甚至预防策略可能至关重要。

滑膜是一种由两层主要结构组成的有序组织：细胞化的表层（IntL）和衬层下层（SubL）。IntL 与滑液（SF）相接触，而 SubL 则生成滑液成分并含有血管结构⁵。在 IntL 中，存在巨噬细胞和成纤维细胞样滑膜细胞（FLS）。IntL 中的巨噬细胞为定居细胞，由 SubL 内的间质巨噬细胞局部更新而来⁶。这些定居滑膜巨噬细胞（RSMs）表现为 M2 型极化，表达 CD206 和 TREM2，具有上皮样形态，并表达紧密连接标志物。IntL 的这一亚结构可能在功能上和结构上对维持关节腔稳态起关键作用^5,

方案

患者知情同意及组织处理方案已获当地机构审查委员会（IRB）批准。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 组织获取与活检

1. 根据外科医生的手术安排，在术前确定患者。招募年龄在18至65岁之间、拟接受开放性关节手术（如全膝关节置换术（TKA）或胫骨结节截骨术（TTO，也称为Fulkerson手术））且未使用全身性免疫调节药物的患者。
   注意：理想情况下，应排除接受过一次以上关节镜手术或接受过一次以上糖皮质激素注射的患者，因为这些患者由于纤维化，术中组织获取失败率高于其他人群。鉴于感染传播风险，除非与研究结局相关，否则应暂缓招募有丙型肝炎或人类免疫缺陷病毒（HIV）感染史的患者。无论传染病状态如何，始终对新鲜人体组织采取安全操作规范。
2. 骨科医生按照标准操作程序进行关节切开和解剖。识别位于滑车沟近端前方的滑膜组织，使用电凝设备整块切除滑膜，避免解剖股内侧肌或靠近内、外侧髁区域。滑膜切除术对TKA的手术结局影响中性，在炎症状态下可能具有益处^9,10。将滑膜无菌转移至研究团队成员，并置于含冷的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）的无菌标本容器中，置于冰上。
   注意：若手术团队发现组织异常，或滑膜切除可能影响伤口闭合或手术结局，则应终止组织获取。后者在T....

结果

优化氧气培养条件

生理状态下的组织灌注氧浓度约为6%-8%，而细胞培养的标准培养条件通常处于大气氧浓度（约21%）¹⁶。相比之下，高氧环境可能提高细胞培养的存活率，也可能产生毒性作用¹⁷。为了充分有效地利用JSAS，需尽早确定滑膜组织的存活能力；因此，在三种氧浓度条件下（生理氧浓度（5% O₂）、大气/标准氧浓度（21% O₂）和高氧浓度（50% O₂）），于第0、1、2、3、5和7天通过caspase-3免疫组织化学或免疫荧光法评估细胞凋亡情况。在标准培养条件下，细胞凋亡从第3天开始，并在第5天达到峰值。在高氧和低氧条件下，细胞凋亡在第1-2天即可观察到，并于第5天达到高峰。因此，后续实验选择标准培养条件（图5）。然而，根据具体研究需求，也可采用其他氧浓度条件，因为在第1和第2天的细胞凋亡水平与第0天相比仍保持相对稳定。

.......

讨论

本研究展示了关节滑膜组织培养系统（JSAS）的功能，特别是维持具有完整且功能可响应的关节滑膜结构的活体滑膜组织的能力。在大多数培养条件下，培养长达72小时后细胞死亡极少。为了评估滑膜结构的显微变化，本文描述了一种独特的组织学测量系统，用于量化滑膜表层（IntL）和滑膜下层（SubL）的结构改变。此类改变提示急性或慢性基础上的急性滑膜炎。当该量化方法与细胞水平和机制性分析相结合时，可能具有特别优势，因为传统分类系统依赖于淋巴细胞浸润及较长的时间进程⁵⁰。在近五十例患者中，不同组织间的组织形态计量学结果与ELISA结果具有一致性，无需对数据进行归一化处理即可比较患者间差异。除了可重复的组织形态计量分析外，JSAS还适用于免疫组织化学、流式细胞术和ELISA检测。本文未进行但显然具有应用价值的技术还包括：大量qPCR检测、将滑膜组织经酶消化制备为单细胞悬液后的流式细胞术分析、单细胞RNA测序以及空间转录组学。如果实验室已掌握从手术室招募患者并无菌获取组织的技术，JSAS还具有极高的成本效益。因此，主要费用仅限于试剂、常规实验设备和解剖工具。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 cm 培养皿	Corning	CLS430167
23srRNA RNAscope 探针	ACD/Biotechne	468211
24 孔板	Life Sciences	3524
3 mm 活检打孔器	Integra	12460406
50 mL 锥形离心管	N/A
70% 乙醇（用于消毒）	N/A
Borrelia burgdorferi	ATCC	35210	必须在对数生长后期使用以获得最大致病性
BSK-H 培养基	Sigma-Aldrich	B8291
CD68 抗体	Invitrogen	14-0688-82	1:1000
CO2 气体罐（标准条件）	N/A
Dulbecco 磷酸盐缓冲液（不含 Ca²⁺/Mg²⁺）	Thermofisher	14190144
胎牛血清	Biotechne	S11150	热灭活批次：F22100
镊子（无齿）	N/A
止血钳	N/A
加湿细胞培养箱（标准条件）	N/A
低氧培养箱	N/A
低氧气体罐（5% O2，5% CO2，其余为 N2，生理条件）	N/A
IL-4 抗体	Thermofisher	MA5-42470	1:100
iNOS 抗体	Thermofisher	PA1-036	1:100
眼科剪刀	N/A
脂多糖	Sigma-Aldrich	L2630
低糖 DMEM（含丙酮酸钠、L-谷氨酰胺）	Life Technologies	11885084
MMP9 抗体	Thermofisher	MA5-32705	1:1000
模块化培养室（高氧条件）	Emrbient, Inc	MIC-101
单核细胞趋化蛋白 1	Peptrotech	300-04-20UG
N-乙酰半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165	每次实验必须新鲜配制，并用等摩尔碳酸氢钠缓冲至 pH 7–7.4
OPG ELISA 试剂盒	Millipore	RAB0484	1:1 稀释
带每分钟升流量调节器的氧气罐	N/A
PDPN 抗体	Invitrogen	14-9381-82	1:100
碘化丙啶	Thermofisher	J66764.MC
RNAscope 多重荧光 V2 检测试剂盒	ACD/Biotechne	323100
sRANKL ELISA 试剂盒	MyBioSource	MBS262624	1:1 稀释
金黄色葡萄球菌 USA 300 耐甲氧西林菌株（MRSA）	ATCC	BAA-1717
SYBR Green	Thermofisher	S7563	10,000X 储存液
TNF 抗体	Thermofisher	PA5-19810	1:100
Transwell 小室 - 0.4 μm 孔径	Millicell	PICM01250
Transwell 小室 - 5 μm 孔径	Corning	CLS3421