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研究文章

温阳定喘汤通过抑制M2型巨噬细胞驱动的成纤维细胞活化减轻哮喘气道重塑

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DOI：

10.3791/69737

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2026年3月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 2Department of Respiratory, The First Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine, 3Department of Clinical Pharmacy, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 4Department of Central Laboratory, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 5Department of Stomatology, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, 6Department of Magnetic Resonance, The Third Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University

本文内容

摘要

本文描述了一项关于温阳定喘汤通过抑制M2型巨噬细胞极化调控肺成纤维细胞纤维化的研究。

摘要

研究温阳定喘汤（WYDCT）对成纤维细胞功能、哮喘气道重塑及其潜在机制的影响。采用IL-4诱导RAW264.7巨噬细胞向M2型极化，随后用WYDCT处理极化后的巨噬细胞，以探究其对小鼠肺成纤维细胞的作用。将极化的RAW264.7细胞进行不同处理后，与成纤维细胞共培养，检测M1和M2型标志物水平、细胞形态及IL-6浓度，并分析STAT3蛋白表达水平。通过实时PCR、Western blot、CCK-8、EdU、免疫荧光和集落形成实验等多种方法，检测成纤维细胞的活力、增殖能力、集落形成能力、PCNA表达以及纤维连接蛋白、COL1A1和α-SMA的表达水平。结果显示，WYDCT可逆转IL-4诱导的RAW264.7细胞形态学改变，降低M2型标志物（Arg-1、CD206）和IL-6的表达水平，并减少RAW264.7细胞中STAT3的表达；而外源性补充IL-6可逆转WYDCT对M2型标志物的抑制作用。此外，WYDCT抑制肺成纤维细胞的活力和增殖，降低PCNA表达，并减少纤维化标志物（纤维连接蛋白、COL1A1、α-SMA）的表达，提示WYDCT可能通过抑制巨噬细胞M2极化，进而抑制肺成纤维细胞的活性、增殖和纤维化进程，其中IL-6/STAT3信号通路可能发挥关键作用。

引言

哮喘，也称为支气管哮喘，是一种呼吸道的持续性炎症性疾病1。该病常与过敏原暴露、低温以及物理和化学性质的刺激物有关，其特征是炎性细胞浸润、气道可逆性收缩、黏液分泌增多以及支气管痉挛2。目前，全球至少有3亿哮喘患者，且患病率逐年上升3。2015年，有40万人死于哮喘，使其成为一项严重的全球公共卫生问题4,5。中国也面临同样的问题，研究表明哮喘患病率为4.2%，约有4570万成年患者，疾病控制率较发达国家更低6,7。该疾病严重影响患者的生活质量，并给家庭带来沉重的经济负担。

气道重塑被认为是治疗难治性哮喘的关键因素8。因此，慢性持续性哮喘的治疗成为关键环节。临床实践中常采用吸入性糖皮质激素联合支气管扩张剂进行治疗，可有效缓解患者症状9。然而，这些治疗方法存在一定副作用，且对部分患者改善症状的效果可能有限。此外，停药后哮喘易复发。研究表明，在哮喘进展过程中，肺成纤维细胞的活化与气道重塑密切相关10。成纤维细胞活化后会发生表型转化，并分泌关键蛋白，驱动细胞外基质（ECM）沉积——这是气道重塑的核心病理特征。具体而言，纤连蛋白作为ECM组装的早期支架，促进其他基质成分的募集与黏附；COL1A1（I型胶原α1链）是ECM的主要结构蛋白，其过度积聚会导致气道壁增厚和僵硬；α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）是成纤维细胞向具有强收缩和分泌能力的肌成纤维细胞转化的标志，进一步加速ECM沉积和气道纤维化。

IL-6 是激活 STAT3 通路最重要的胞内信号因子11。升高的 IL-6 可激活 STAT3 通路。在哮喘小鼠肺组织中，STAT3 及其磷酸化 mRNA 和蛋白的表达均显著增加。IL-6/STAT3 信号通路是哮喘治疗的靶点之一。研究已证实，IL-6/STAT3 信号通路的激活与哮喘气道炎症相关，抑制该通路可减轻气道炎症12,13。IL-6/STAT3 还与巨噬细胞的 M2 极化相关。国外研究证明，IL-6 表达显著降低下游 STAT3 的激活，这与肝脏中肿瘤表面数量减少、增殖降低以及 M2 巨噬细胞数量减少相关14。

被称为巨噬细胞的免疫细胞可分为不同的表型，即经典活化（M1）和替代性活化（M2），每种表型具有独特的功能15。M1巨噬细胞可诱导炎症反应和组织损伤，而M2巨噬细胞则促进细胞增殖，并有助于伤口愈合和组织修复。研究表明，哮喘中的气道重塑与M2巨噬细胞相关16。体外实验表明，使用IL-4诱导巨噬细胞向M2极化可显著增强α-SMA阳性细胞的增殖能力17。抑制M2巨噬细胞的极化是治疗哮喘气道重塑的有效策略。

哮喘在中医中属于“"Xiao Bing"”的范畴。哮病的病理因素主要为痰邪，痰的产生源于脏腑阴阳失调，并与外感病邪、饮食、病后等因素共同作用，影响津液运行，导致津液停滞、积聚而成。随着对中医药治疗哮喘机制的不断探索，越来越多的研究表明，中医药在缓解气道炎症、减少黏液过度分泌以及抑制气道重塑方面具有显著作用18,19。哮病以肺为主，累及脾肾。哮病患者肺气亏虚，卫外不固，导致肺气宣发失常，阳气长期反复受损，进而出现肺阳虚。阳气虚衰导致津液运行失常，凝聚成痰。久病发作，寒痰进一步影响脾肾之阳，形成肺脾肾阳虚、阴阳失调、体质偏盛或偏衰、津液运行异常的病理状态。肺不能宣发津液，脾不能运化水谷精微，肾不能蒸腾气化，终致痰浊内生、瘀血形成，表现为哮喘发作。因此，阳虚是哮病的根本病因，痰瘀互结为其主要特征。温阳定喘汤由12味中药组成，包括淫羊藿（15 g）、麻黄（制）（10 g）、人参（15 g）、黄芪（15 g）、银杏叶（15 g）、款冬花（15 g）、苦杏仁（15 g）、法半夏（10 g）、五味子（10 g）、地龙（10 g）、桃仁（10 g）和甘草（制）（10 g）。该方剂源于《"摄生众妙方"》中定喘汤的加减化裁，具有温阳益气、化痰活血、止咳平喘的功效。其临床疗效已得到证实，因而推动了当前针对该方剂干预哮喘气道重塑机制的实验研究。

与目前治疗哮喘的药物疗法（如吸入性糖皮质激素、β2受体激动剂以及靶向IgE或IL-5的单克隆抗体类生物制剂）相比，温阳定喘汤（WYDCT）可能提供一种多靶点且更安全的治疗策略。传统糖皮质激素虽能有效缓解气道炎症，但常伴随免疫抑制、激素失衡以及停药后复发等不良反应。生物制剂虽具有更高的特异性，但价格昂贵且仅适用于特定哮喘表型。相比之下，温阳定喘汤源自中医理论 "温阳化痰" 在临床和实验研究中已证明，其在调节免疫平衡、减轻气道炎症以及抑制气道重塑方面具有综合作用。20其多组分构成可能同时调节巨噬细胞极化、成纤维细胞活化和细胞因子释放，从而在哮喘病理方面提供更广泛且可能更持久的改善。

本研究中，温阳定喘汤（WYDCT）的水提物由12种草药按固定传统比例制备而成，浓缩至终浓度为1 g/mL（相当于生药量）的储备液，并经滤膜除菌后用于细胞培养。提取物使用浓度分别为50、100和200 µg/mL，该浓度范围根据前期细胞活力实验确定，旨在确保无细胞毒性的同时维持其药理活性。体外模型采用IL-4诱导的RAW264.7巨噬细胞向M2型极化，并与小鼠肺成纤维细胞（L929细胞）共培养，从而评估巨噬细胞旁分泌作用对成纤维细胞活化及纤维化相关反应的影响。上述实验细节为后续研究WYDCT在气道重塑中的剂量-效应关系及作用机制提供了可重复的技术框架。

基于上述研究结果，我们推测温阳定喘汤通过抑制巨噬细胞的M2极化及抑制成纤维细胞的活化，发挥其在哮喘中抗气道重塑的作用。

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方案

本研究遵循国际、国家和机构关于人道动物护理的指南，并符合相关法律法规。具体而言，所有涉及小鼠的操作均经齐齐哈尔医学院附属第三医院动物伦理护理委员会批准（AECC-2022-009）。小鼠饲养于标准实验室条件下，可自由获取食物和水，同时尽一切努力减少其痛苦。研究过程中始终设定并监测人道终点。

1. WYDCT 提取物的制备

温阳定喘汤的12味药材按传统比例称重：淫羊藿（15 g）、制麻黄（10 g）、人参（15 g）、黄芪（15 g）、银杏叶（15 g）、款冬花（15 g）、苦杏仁（15 g）、制 半夏 (10 g) 五味子 （10 g）、地龙（10 g）、桃仁（10 g）和制甘草（10 g）。

加入十倍体积的蒸馏水，混合物煮沸30分钟。提取重复进行两次，合并滤液。合并后的提取液在减压下浓缩至相当于1 g/mL的粗药物浓度。提取液经0.22 µm滤膜过滤，分装后于−20 °C保存。工作浓度（50、100和200 µg/mL）在使用前立即稀释配制。

2. 细胞培养与M2极化

将 RAW264.7 细胞（ATCC，美国）解冻后，以每10 cm培养皿1 × 10⁶个细胞的密度接种于10 mL DMEM培养基中，培养基中添加10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素。细胞在37 °C、含5% CO₂的湿润空气中培养24小时，直至达到80%–90%汇合度。

随后将培养基更换为含有20 ng/mL IL-4的新鲜DMEM，细胞继续培养24小时以诱导M2极化。培养结束后，细胞用PBS洗涤两次，随后用WYDCT提取物（10 mg/mL储备液稀释至指定终浓度）处理24小时。在IL-6补充实验中，于WYDCT处理期间加入50 ng/mL IL-6。

以0.1% DMSO处理的细胞作为阴性对照。在倒置显微镜下观察细胞形态，并采集代表性图像。

3. 小鼠肺成纤维细胞的分离与培养

根据批准的伦理规程对小鼠实施安乐死。取肺叶并置于冰冷的亨克平衡盐溶液中。去除可见的血管和结缔组织，将肺组织剪切成小块（约1 mm3）。

组织碎片在37 °C下用0.25%胰蛋白酶轻柔振荡消化40分钟，随后再用0.25%胰蛋白酶消化30分钟。细胞悬液在300 × g 离心5分钟，弃去上清液，沉淀物重悬于添加了10%胎牛血清的DMEM培养基中。

将悬液孵育100分钟，以使成纤维细胞贴壁，随后将细胞再次以300 × g离心5分钟，以提高纯度。纯化后的成纤维细胞被接种至适当的培养板中，在37 °C、含5% CO₂的湿润 atmosphere 中孵育，直至细胞融合度达到约80%。

4. 成纤维细胞与条件培养基的共培养

收集经处理的RAW264.7细胞的上清液，并在4 °C下以3000 × g离心10分钟。将成纤维细胞的培养基更换为收集的巨噬细胞条件培养基。在进行功能检测之前，将成纤维细胞置于含5% CO₂的湿润环境中，于37 °C孵育24小时。孵育结束后，收集成纤维细胞用于RNA和蛋白质提取，以进行后续的qRT-PCR和Western印迹分析。

5. 细胞活力（CCK-8 法）

将成纤维细胞以每孔 5 × 10³ 个细胞的密度接种于含 100 µL 培养基的 96 孔板中。细胞经指定处理 24 小时后，每孔加入 10 µL CCK-8 试剂，在 37 °C 下孵育 2 小时。使用酶标仪在 450 nm 处测定光密度（OD）。细胞活力计算公式为（处理组 OD / 对照组 OD）× 100%。所有实验均设置三个生物学重复。

6. 克隆形成实验

将细胞以每孔1 × 10³个细胞的密度接种于6孔板中，每种条件设三个重复孔。将培养板孵育10–14天，直至形成可见的克隆。克隆在室温下用0.1%结晶紫染色10分钟。染色后，对克隆进行洗涤并拍照。结合的染料用30%乙酸溶解15分钟，并在590 nm处测定吸光度。共进行了三次独立实验。

7. EdU 增殖检测

细胞按指定条件处理24小时。随后，向每孔加入100 µL 50 µM EdU，于37 °C孵育2小时。细胞用4%多聚甲醛固定30分钟，并用2 mg/mL甘氨酸淬灭5分钟。用含0.5% Triton X-100的PBS溶液对细胞进行通透处理，洗涤后加入Apollo染色液孵育30分钟。细胞核用Hoechst 33342（1×）复染30分钟。使用荧光显微镜观察并拍摄EdU阳性细胞。

8. IL-6 的 ELISA 检测

将RAW264.7细胞上清液在4 °C条件下以3000 × g离心15分钟。根据试剂盒说明书，使用碧云天ELISA试剂盒检测IL-6水平。使用酶标仪测定吸光度，并根据标准曲线计算IL-6浓度。

9. 免疫荧光

成纤维细胞用预冷的丙酮固定10分钟，用PBS洗涤三次。细胞用0.1% Triton X-100处理10分钟进行通透，再用含1% BSA的PBS在37°C下封闭30分钟。随后，细胞在4°C下与抗PCNA一抗（1:100）孵育过夜。用PBS洗涤三次后，细胞在室温下与FITC标记的二抗（1:200）孵育1小时。细胞核用DAPI复染，洗涤后使用荧光显微镜成像。

10. qRT-PCR

使用Trizol试剂（Beyotime，中国）按照制造商说明书提取总RNA。采用cDNA合成试剂盒，以2 µg RNA和随机引物进行逆转录反应。PCR反应体系为20 µL，包含10 µL SYBR Green Master Mix、每种基因特异性引物各0.5 µL（终浓度为0.5 µM）以及1 µL cDNA模板。所用引物包括CD16、iNOS、Arg-1、CD206、fibronectin、COL1A1、α-SMA和GAPDH（序列已提供）。

热循环条件包括：95 °C 预变性 5 分钟，随后进行 40 个循环，每循环包括 95 °C 变性 30 秒、60 °C 退火 30 秒和 72 °C 延伸 30 秒。通过以 0.5 °C 递增从 60 °C 升温至 95 °C 进行熔解曲线分析，以验证扩增的特异性。

数据分析：采用2−ΔΔCT法计算相对表达量，并以GAPDH为内参进行标准化。引物序列如下：CD16（小鼠）：5′- AGGAGCTGAGGAGGAGGAGG-3′ 和 5′- TGAGGAGGAGGAGGAGGAGC-3′；iNOS（小鼠）：5′-TGCTCCCCAGGAGATGTTGT-3′ 和 5′-TGGTCTGGTAGGCTGTACGG-3′；Arg-1（小鼠）：5′- GCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3′ 和 5′- GGTGGCTTTGCTGGTCTGTC-3′；CD206（小鼠）：5′- GGCTTCTATGAGCTGGGTGA-3′ 和 5′- CTGGGCTTCTGGATGTTGTT-3′；纤连蛋白（fibronectin，小鼠）：5′-CGTGGTGAAGGTGTTTCTGC-3′ 和 5′-GAGGTCACAGTGGTCTTGCT-3′；COL1A1（小鼠）：5′-CCCTGGACACCTGGCTTT-3′ 和 5′-GCGGGTCACCTTCTCTTCTC-3′；α-SMA（小鼠）：5′-CTGGAACAGCACAGCTTCTC-3′ 和 5′-GGGACATAGCACAGCTTCTC-3′；GAPDH（小鼠）：5′- TGTGTCCGTCGTGGATCTGA -3′ 和 5′- CCTGCTTCACCACCTTCTTGAT-3′。

11. 蛋白质印迹

使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解细胞。采用BCA法测定蛋白浓度。进行SDS-PAGE时，每条泳道上样60 µg蛋白，在10%聚丙烯酰胺凝胶中以120 V电泳1.5–2小时进行分离。通过湿转法在100 V条件下电转1小时，将蛋白转移至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的TBS-T室温封闭1小时后，将膜与一抗（1:1000稀释）在4 °C孵育过夜。用TBS-T洗涤后，膜与HRP标记的二抗（1:5000稀释）室温孵育1小时。再次洗涤后，使用ECL化学发光试剂检测蛋白条带，并通过化学发光成像系统成像。使用ImageJ软件对条带强度进行定量，以GAPDH作为内参，对蛋白表达水平进行归一化处理。

12. 统计分析

数据采用 SPSS 17.0 进行分析。连续变量以均值 ± 标准差（SD）表示。两组之间的比较采用非配对 t 检验，多组之间的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 LSD 事后检验。以 p 值小于 0.05 为具有统计学意义。

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结果

WYDCT 对 RAW264.7 细胞来源巨噬细胞 M2 极化的影响

我们使用光学显微镜观察了RAW264.7细胞的形态。如图1A所示，IL-4刺激导致细胞伸长，与未处理的细胞相比，呈现出更长的纺锤形形态。此外，经IL-4刺激的细胞表现出胞质颗粒度增加，并对培养基质的黏附性增强。这些形态学变化表明，IL-4刺激对RAW264.7细胞的细胞结构和表型具有显著影响。

给予WYDCT后，RAW264.7细胞的细胞形态发生了逆转。随后通过qRT-PCR和Western blot分析检测M1型标志物（CD16、iNOS）和M2型标志物（Arg-1、CD206）的表达水平。值得注意的是，CD16和iNOS的mRNA及蛋白水平显著降低（p <0.001），而在IL-4处理的RAW264.7细胞中，Arg-1和CD206的mRNA及蛋白水平则升高（p <0.001）。重要的是，给予WYDCT后，这些基因...

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讨论

本研究旨在探讨WYDCT对哮喘中成纤维细胞活性及气道重塑的影响及其潜在机制。当前研究结果表明，WYDCT可抑制RAW264.7巨噬细胞的M2型极化，进而影响小鼠肺成纤维细胞的活力、增殖及纤维化过程。此外，IL-6/STAT3信号通路在介导这些效应中发挥了关键作用。

巨噬细胞极化是哮喘和纤维化发病机制中的关键过程21。M2型巨噬细胞以Arg-1和CD206的表达水平为特征，参与组织重塑和纤维化过程22。在本研究中，IL-4刺激诱导RAW264.7细胞发生形态学改变，表现为细胞伸长、胞质颗粒增多以及对培养基质的黏附性增强。这些变化提示M2型极化状态的形成23。然而，WYDCT处理逆转了上述形态学改变，表明其具有抑制M2型极化的能力。在巨噬细胞极化实验中，优化IL-4浓度（20 ng/mL）对于实现稳定的M2型极化至关重要。形态学变化及M2标志物（如Arg-1、CD206）的上调是成功极化的关键指标。若极化不完全，可通过调整IL-4浓度或延长孵育...

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致谢

我们诚挚感谢所有为本研究项目作出贡献的合作方。本工作得到了2022年黑龙江省省属高校基本科研业务费（编号：2022-KYYWF-0827）的资助，特此致谢。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Apollo 643 杂交试剂广州锐博生物有限公司C10371-2
Arginase-1 (E4U1I) 小鼠单克隆抗体 Cell Signaling Technology, Inc.43933T
BCA 蛋白浓度测定试剂盒碧云天生物技术有限公司P0012
BeyoBlot HRP 标记小鼠抗兔天然 IgG (H+L)碧云天生物技术有限公司A0210
二氧化碳培养箱上海力申科学仪器有限公司HF240
CD206/MRC1 (E6T5J) XP® 兔单克隆抗体Cell Signaling Technology, Inc.24595T
细胞计数试剂盒-8碧云天生物技术有限公司C0037
COL1A1 (E8F4L) XP 兔单克隆抗体 Cell Signaling Technology, Inc.72026T
二甲基亚砜碧云天生物技术有限公司ST038-100ml
DMEM 高糖培养基Grand Island 生物公司11965092
EDU碧云天生物技术有限公司ST067-250mg
FcγRIII/CD16 (F6K6G) 兔单克隆抗体 Cell Signaling Technology, Inc.71345T
胎牛血清Grand Island 生物公司A5256701
纤维连接蛋白/FN1 抗体 Cell Signaling Technology, Inc63779S
FITC 标记山羊抗小鼠 IgG (H+L)碧云天生物技术有限公司A0568
荧光定量 PCR 仪雅睿生物技术有限公司MA-6000
Hoechst 33342 活细胞染色液 (100X)碧云天生物技术有限公司C1029
iNOS (E1W4J) 兔单克隆抗体Cell Signaling Technology, Inc.70706SF
倒置显微镜广州明美光电技术有限公司MI52-N
LRRK2 T1348N 突变 RAW 264.7 细胞ATCCSC-6005
免疫染色通透缓冲液（含 Triton X-100）碧云天生物技术有限公司P0096-100ml
小鼠 IL-6 ELISA 试剂盒碧云天生物技术有限公司PI326
小鼠肺成纤维细胞武汉普诺赛生命科技有限公司CP-M006
PCNA (PC10) 小鼠单克隆抗体Cell Signaling Technology, Inc.2586T
青霉素-链霉素Grand Island 生物公司15140148
重组小鼠 IL-4碧云天生物技术有限公司P5916-5μg
重组小鼠 IL-6碧云天生物技术有限公司P5925-10μg
酶标仪雷度生命科学RT-6100
Stat3 (124H6) 小鼠单克隆抗体 Cell Signaling Technology, Inc.9139T
超净工作台济南博科生物技术有限公司BBS-SDC
SynGAP-α2 (E4Y6I) 兔单克隆抗体 Cell Signaling Technology, Inc.56927T
Thermo Fisher Scientific RIPA 裂解与提取缓冲液ThermoFisher89901
Trizol（总 RNA 提取试剂）碧云天生物技术有限公司R0016
β-肌动蛋白抗体Cell Signaling Technology, Inc.4967S

参考文献

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