新生小鼠口服灌胃及利用尤斯室功能评估肠道屏障完整性的方法

摘要

本文描述了：（1）从出生后第6天（DOL 6）起对新生小鼠进行口服灌胃给药；（2）通过Ussing chamber评估出生后第10天至断奶期（出生后第20天）幼鼠结肠上皮屏障功能的离体（ex vivo）检测方法，包括细胞旁路和跨细胞通透性的测定。

摘要

越来越多的证据表明，生命最初1000天在塑造肠道-微生物组轴中具有重要意义。这一生命早期窗口期对于长期生理轨迹和免疫适应的建立至关重要，可能影响个体对与菌群失调和屏障功能障碍相关疾病的易感性。要深入理解其潜在机制，必须全面评估关键生理参数，包括新生儿肠道的旁细胞和跨细胞通透性。评估这些参数对于阐明外源性分子的早期暴露如何影响肠道完整性和远期健康结局至关重要。因此，本文第一部分描述了在出生后第6天即可对小鼠幼崽进行目标分子的口服给药，同时最大限度地减少应激、损伤风险和同类相食行为。采用润滑且尖端圆钝的24G饲喂针，对体重不低于2.5 g的小鼠幼崽进行灌胃。第二部分概述了利用Ussing chamber（尤斯室）装置对出生后第10天至断奶期间幼崽结肠组织样本进行离体（ex vivo）旁细胞和跨细胞通透性的评估方法。使用专为小型活检组织设计的无针滑片，配合Ussing chamber固定新生小鼠结肠样本。在实验开始时，将旁细胞探针FITC-葡聚糖（4 kDa）和跨细胞标志物辣根过氧化物酶（44 kDa，VI型）加入系统的顶端室。于0分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟从基底外侧室采集样本，以定量探针的跨膜转运量。两种标志物的转运量均通过酶标仪进行直接（FITC）和间接（HRP）检测，依据标准曲线计算，并以通量（flux）形式表示。

引言

肠道屏障的完整性在维持整体健康中起着基础性作用，它通过协调黏膜免疫反应并调控肠上皮的选择性通透性来实现这一功能。该屏障系统控制营养物质的通过，同时阻止病原体、抗原和毒素进入体循环¹。这种界面的长期破坏与肠道通透性增加相关，通常被称为"肠漏"，目前已被确认不仅是一种结果，更是慢性炎症状态及多种肠外病理变化的驱动因素²。

例如，肠道屏障功能受损已被证实是炎症性肠病（IBD）、幼年特发性关节炎（JIA）和1型糖尿病（T1D）等自身免疫性和代谢性疾病的关键因素。这凸显了肠道屏障状态不仅是一个重要的生物标志物，同时也可作为治疗靶点，以尽可能早地阻止病理生理过程的启动，并防止急性炎症向慢性状态发展^3,4,5,6。

在此背景下，新生儿期代表了一个独特且高度敏感的发育窗口期，在此期间，肠道-微生物群界面的建立与成熟对终生的肠道及全身健康产生深远影响⁷。在这一早期阶段，肠上皮和免疫系统对内源性和外源性因素均表现出高度敏感性，在快....

方案

所有动物实验均依照适用的国家法规进行，并已获得法国高等教育、研究与创新部的批准 通过 APAFIS 平台（授权编号：APAFIS#23855）以及法国国家研究署（ANR）提供的资助：11-IDEX-0005-02、ANR-24-CE15-7152 和 18-IDEX-0001。所用试剂与设备列于下文 材料表.

1. 新生小鼠幼崽的灌胃

注意：以下方法改编自 Francis 等人的研究¹²。尽管原始方案允许在出生后第 2 天（DOL 2）起对小鼠幼崽进行灌胃，但本实验中灌胃操作未早于出生后第 6 天（DOL 6）进行，因为更早期操作的技术要求显著提高，使实验难度加大。此外，使用更年轻的幼崽会增加治疗最初几天内动物丢失的风险，从而需要更大的样本量，使研究更为复杂。

1. 灌胃溶液的配制与准备
   1. 分别称量每只幼鼠的体重。
   2. 调整灌胃溶液的浓度和体积，确保给予的总体积不超过每克体重20 µL。
      注：在标准条件下，出生第6天（DOL 6）的小鼠幼崽体重很少低于2.5 g。
   3. 使用注射器先用去离子水彻底冲洗24号圆头喂食针，再用70%乙醇冲洗，然后进行高压灭菌。
      注：建议每个处理组使用单独的喂食针，....

结果

标准曲线绘制与孔浓度定量
从每孔的吸光度值中减去空白对照孔的平均值。以Y轴为吸光度值，X轴为浓度，使用GraphPad Prism软件中的“插值标准曲线（Interpolate a standard curve）”功能绘制标准曲线。若所有标准品点呈线性排列，“线性（Line）”模型可提供最佳拟合结果； alternatively，采用“S型四参数逻辑斯蒂模型（Sigmoidal, 4 PL, X is concentration）”可在非线性标准曲线插值时提供更高的灵活性与准确性（图6）。将待测样本的吸光度值（Y轴）填入标准品下方，通过结果表中的“插值得到的X平均值（Interpolated X mean values）”反推出各样本的浓度（图6）。

讨论

口服灌胃可对单个新生小鼠重复给予精确且剂量明确的管腔内给药。相比之下，虽然自主摄食是一种可行的替代方法，但每只动物需要更长的给药时间，且所给予的化合物剂量较低，给药精度也较差。¹²此外，灌胃给药可容纳比可行方法更大的体积 通过 可注射途径，有助于在较低浓度下实现更高的总剂量，从而在给药时最大限度地降低潜在毒性¹³消化道的转运进一步限制了该化合物的分布容积，这对于研究肠道通透性和屏障功能具有优势。然而，毒性会因发育阶段和分子类别而存在显著差异；因此，首次对新生动物施用任何处理时必须格外谨慎。对新生幼鼠进行灌胃是一项精细操作，需要经过专门训练，尤其是出生后10天（DOL 10）以内的幼鼠。建议使用含深色食用染料的PBS进行训练，成功灌胃后可在幼鼠胃部观察到明显的深色区域。若染料出现在胃以外区域，特别是咽喉或胸腔部位，则表明灌胃失败，应立即对幼鼠实施安乐死。此外，灌胃操作不应在麻醉状态下进行，因为溶液的正确递送依赖于幼鼠主动吞咽饲管，这也有助于降低对上食管括约肌造成损伤的风险。 和抽吸^.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
不含钙的10倍浓度DPBS && Mg	杜尔贝科氏	14200091
抗-HRP 抗体	Nordic Biosite	GTX10183	单克隆小鼠辣根过氧化物酶IgG [2H11]
双目放大镜	Olympus	SZ61	无需特殊要求。
黑色平底96孔板	ThermoFisher Scientific	137101	培养板必须为黑色，并适用于荧光检测。检测时需取下盖子。
BSA	默克	A4503
C57BL/6J 小鼠	查尔斯河实验室	632C57BL/6J
CaCl2	默克	2382
透明96孔透明平底高结合板	康宁	9018
D-(+)-葡萄糖	默克	G8270
蒸馏水 H2O
D-甘露醇	默克	M4125
精细镊子	FST	11445-12
精细剪刀	FST	14058-09
FITC-葡聚糖 4Kd	FD4	TdB Labs	对光降解敏感。
加热垫	Minerve	20 031 01
HRP	默克	P8375
MgCl₂2，6H2O	默克	M2670
Milli-Q H2O
P2300 EasyMount Ussing 系统 &和 Chambers	生理学仪器	EM6-C-CE	系统、腔室和滑块必须全部兼容。
P2306 Ussing Chamber 滑片	生理学仪器	PI-P2306	适用于不同大小和形态组织的滑块有多种型号可供选择。
QuantaBlu 荧光过氧化物酶底物试剂盒	ThermoFisher Scientific	15169
可重复使用喂养针，圆头	FST	18061-24	24 号，1.25 mm 尖端直径，圆头。使用前须用无菌水、70% 乙醇清洗，并经高压灭菌。
碳酸氢钠	默克	S6297
碳酸钠	默克	S7795
分光光度计	TECAN	Spark 10M	若使用137101黑色板，则需要配备顶部检测功能的酶标仪。
Tween-20	默克	P7949