本文描述了：（1）从出生后第6天（DOL 6）起对新生小鼠进行口服灌胃给药；（2）通过Ussing chamber评估出生后第10天至断奶期（出生后第20天）幼鼠结肠上皮屏障功能的离体（ex vivo）检测方法，包括细胞旁路和跨细胞通透性的测定。
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摘要
摘要
越来越多的证据表明，生命最初1000天在塑造肠道-微生物组轴中具有重要意义。这一生命早期窗口期对于长期生理轨迹和免疫适应的建立至关重要，可能影响个体对与菌群失调和屏障功能障碍相关疾病的易感性。要深入理解其潜在机制，必须全面评估关键生理参数，包括新生儿肠道的旁细胞和跨细胞通透性。评估这些参数对于阐明外源性分子的早期暴露如何影响肠道完整性和远期健康结局至关重要。因此，本文第一部分描述了在出生后第6天即可对小鼠幼崽进行目标分子的口服给药，同时最大限度地减少应激、损伤风险和同类相食行为。采用润滑且尖端圆钝的24G饲喂针，对体重不低于2.5 g的小鼠幼崽进行灌胃。第二部分概述了利用Ussing chamber（尤斯室）装置对出生后第10天至断奶期间幼崽结肠组织样本进行离体（ex vivo）旁细胞和跨细胞通透性的评估方法。使用专为小型活检组织设计的无针滑片，配合Ussing chamber固定新生小鼠结肠样本。在实验开始时，将旁细胞探针FITC-葡聚糖（4 kDa）和跨细胞标志物辣根过氧化物酶（44 kDa，VI型）加入系统的顶端室。于0分钟、30分钟、60分钟、90分钟和120分钟从基底外侧室采集样本，以定量探针的跨膜转运量。两种标志物的转运量均通过酶标仪进行直接（FITC）和间接（HRP）检测，依据标准曲线计算，并以通量（flux）形式表示。
引言
肠道屏障的完整性在维持整体健康中起着基础性作用，它通过协调黏膜免疫反应并调控肠上皮的选择性通透性来实现这一功能。该屏障系统控制营养物质的通过，同时阻止病原体、抗原和毒素进入体循环1。这种界面的长期破坏与肠道通透性增加相关，通常被称为"肠漏"，目前已被确认不仅是一种结果，更是慢性炎症状态及多种肠外病理变化的驱动因素2。
例如，肠道屏障功能受损已被证实是炎症性肠病（IBD）、幼年特发性关节炎（JIA）和1型糖尿病（T1D）等自身免疫性和代谢性疾病的关键因素。这凸显了肠道屏障状态不仅是一个重要的生物标志物，同时也可作为治疗靶点，以尽可能早地阻止病理生理过程的启动，并防止急性炎症向慢性状态发展3,4,5,6。
在此背景下，新生儿期代表了一个独特且高度敏感的发育窗口期，在此期间，肠道-微生物群界面的建立与成熟对终生的肠道及全身健康产生深远影响7。在这一早期阶段，肠上皮和免疫系统对内源性和外源性因素均表现出高度敏感性，在快速生长和分化的同时，还需适应微生物定植和饮食变化。在此关键发育窗口期内，若肠道屏障完整性受到破坏，可能在日后多种急性和慢性疾病的发生中发挥关键作用。这些疾病包括食物过敏等免疫介导性疾病，以及更严重的慢性疾病，如炎症性肠病（IBD）、幼年特发性关节炎（JIA）和1型糖尿病（T1D）7,8,9。这些疾病的发病机制往往起始于生命早期，因为其初次发病通常发生在儿童期至成年早期10,11。因此，阐明调控新生儿肠道屏障功能的机制，对于开发旨在减轻多种慢性疾病负担的预防和治疗策略至关重要。
鉴于这一背景，迫切需要可靠且具有生理相关性的工具，以在新生儿环境中研究肠道屏障完整性、慢性疾病机制以及炎症反应。这些工具必须能够在不牺牲精确性和有效性的前提下，重现已在成人模型中得到验证的实验检测方法。此外，越来越迫切需要研究多种感兴趣分子候选物的短期和长期效应，这些分子预计会对新生儿肠道稳态产生有益或有害的影响。在现有工具中，对新生小鼠幼崽进行口服灌胃给药是一种极为可靠的方法，可在特定发育阶段精确递送目标分子，从而实现对各种生物活性化合物、药物或微生物代谢产物在肠道成熟及屏障功能方面影响的可控性研究。
本文的第一部分描述了一种对出生后第6天（DOL 6）起的幼鼠进行灌胃的方法，可在食物多样化诱导肠道微生物群物种数量大幅增加之前、期间和之后研究干预措施的影响。因此，该技术能够在幼鼠生长发育过程中，对治疗干预对肠道健康的影响进行纵向分析。
在本文的第二部分，作为该方法的补充， 离体 使用Ussing chamber评估结肠上皮屏障功能可提供一种敏感且定量的通透性特征检测方法。通过对新生小鼠（如出生后第10天幼鼠）结肠活检组织中细胞旁路和跨细胞通透性的评估，能够精确判断多个关键候选因子对上皮屏障完整性和功能的影响。细胞旁路转运主要通过上皮层细胞间隙进行，是一种被动转运机制，依赖电化学梯度和渗透梯度驱动小分子溶质从管腔侧向基底外侧通过。该过程主要由紧密连接家族蛋白（如claudin和occludin）调控。相比之下，跨细胞转运是一种主动机制，可通过上皮细胞实现较大分子溶质的吸收。 通过 特定通道、载体和泵
异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖（4 kDa）由于分子尺寸较小，主要通过细胞旁路途径转运，而辣根过氧化物酶（HRP；44 kDa）则通过跨细胞途径选择性地转运至基底外侧。via 因此，定量这些非内源性示踪剂可分别评估细胞旁路和跨细胞通透性。采用FITC和HRP的Ussing室检测法可保持组织结构完整性，并实现实时测量肠道任意节段的细胞旁路和跨细胞通透性。新生儿灌胃与Ussing室分析相结合，为研究特定分子如何在短期和长期时间内影响肠道屏障功能提供了有力策略，有助于从生命最早期阶段制定减轻炎症和预防慢性疾病的干预措施。
综上所述，本实验方案描述了两种互补的实验方法，可用于：（1）在新生小鼠出生早期向其体内给予目标分子（步骤1）；（2）利用尤斯灌流室（Ussing chamber）评估从新生期至断奶期小鼠肠道节段的旁细胞和跨细胞通透性（步骤2-6）。
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方案
所有动物实验均依照适用的国家法规进行，并已获得法国高等教育、研究与创新部的批准 通过 APAFIS 平台（授权编号：APAFIS#23855）以及法国国家研究署（ANR）提供的资助：11-IDEX-0005-02、ANR-24-CE15-7152 和 18-IDEX-0001。所用试剂与设备列于下文 材料表.
1. 新生小鼠幼崽的灌胃
注意：以下方法改编自 Francis 等人的研究12。尽管原始方案允许在出生后第 2 天（DOL 2）起对小鼠幼崽进行灌胃，但本实验中灌胃操作未早于出生后第 6 天（DOL 6）进行，因为更早期操作的技术要求显著提高，使实验难度加大。此外，使用更年轻的幼崽会增加治疗最初几天内动物丢失的风险，从而需要更大的样本量，使研究更为复杂。
- 灌胃溶液的配制与准备
- 分别称量每只幼鼠的体重。
- 调整灌胃溶液的浓度和体积，确保给予的总体积不超过每克体重20 µL。
注：在标准条件下，出生第6天（DOL 6）的小鼠幼崽体重很少低于2.5 g。 - 使用注射器先用去离子水彻底冲洗24号圆头喂食针，再用70%乙醇冲洗，然后进行高压灭菌。
注：建议每个处理组使用单独的喂食针，以防止交叉污染。 - 在设定为约38 °C的消毒加热垫上放置干净的纸巾。
- 在打开动物笼具前，用70%乙醇清洗手套，以减少气味传递给幼鼠，并降低母鼠食仔的风险。
- 将母鼠转移到另一房间的独立笼具中，以减少因幼鼠可能发出叫声而引起的应激。
- 用清洁的手套接触巢材进行摩擦，以减少在灌胃过程中将外界气味传递给幼鼠的风险。
- 测量幼鼠剑突（胸骨下端）至吻部的长度，并据此在喂食针上标记最大插入深度（图1A，B）。
- 小鼠幼鼠的食管内灌胃操作
- 以无菌方式将喂食针头连接至注射器，并吸取略多于所需剂量的灌胃液，以确保能够完全给予预定体积，同时避免注入气泡，因为气泡会显著增加误吸风险。
注：也可先吸取灌胃液，然后将注射器倒置，回拉活塞并重新推进，以排出筒内空气，去除气泡。随后将灌胃液体积精确调整至所需剂量。 - 用非优势手的拇指和食指轻轻捏住幼鼠肩胛骨之间的皮肤将其提起。
注：不要从幼鼠背部拉起过多皮肤，以免引起窒息。 - 将幼鼠保持接近水平的位置，将喂食针轻轻插入其口腔，并垂直于咽部推进，直至到达喉后部（图1C）。
- 保持相同的角度和深度，将针头滑向口腔右侧或左侧，以避开舌头。
- 在保持角度和深度的同时，缓慢调整针头角度，同时轻轻向后倾斜幼鼠头部，直至注射器、头部和背部成一直线，且头部略微向后倾斜（图1D）。
- 不施加任何压力，让注射器依靠自身重量缓慢下降，直至最大插入标记接近或达到吻部水平（图1E）。
注：若遇到阻力，可轻轻旋转注射器，通过手指来回滚动使其更容易下降。若注射器仍无法前进，可尝试调整插入角度，或使用已用灌胃液润滑的喂食针重新开始操作。针头插入时间不应超过20秒，以防窒息。 - 当达到或接近最大插入标记时，迅速注入所需体积。若在注射过程中遇到阻力，应检查注射器—头部—背部是否对齐，并轻微调整插入深度。
注：建议快速完成注射，因为长时间留置针头会显著增加窒息、挣扎及动物受伤的风险。 - 在正确剂量注入后，沿插入时相同的角度缓慢撤出针头。
- 将幼鼠放置于先前放在加热垫上的纸巾上，并观察其恢复情况。正常的呼吸模式应在20秒内恢复。
注：若动物吻部或口腔出现气泡，表明发生误吸，对于出生日龄小于DOL 14的幼鼠需立即实施安乐死。若口腔中出现少量血液，提示口咽部与食管之间可能存在损伤，需密切观察，但无需常规实施安乐死。若幼鼠恢复情况不确定，应将其置于侧卧位；若其无法自行恢复正常体位，则需立即实施安乐死。 - 确认动物恢复后，将其放回巢穴并与其母鼠重新合笼。
注：在DOL 10之前，幼鼠活动能力较弱，可在加热垫上停留，直至笼内所有幼鼠完成灌胃。对于年龄较大的幼鼠，不得无人看管地留在加热垫上，因其可能试图逃离。
- 以无菌方式将喂食针头连接至注射器，并吸取略多于所需剂量的灌胃液，以确保能够完全给予预定体积，同时避免注入气泡，因为气泡会显著增加误吸风险。
图1：出生后第10天新生小鼠的灌胃操作。 测量小鼠吻部至剑突的距离（A），据此在饲喂针头上标记最大插入长度（B）。将饲喂针头插入小鼠口腔左侧或右侧（C）。当针头到达咽喉后部时，调整针头角度，使注射器、小鼠头部与背部呈一条直线（D）。随后轻柔地将针头向下推进，无阻力滑行，直至接近或达到最大插入标记处（E）。 请点击此处查看该图的放大版本。
2. 新生小鼠仔鼠安乐死及结肠获取
- 根据国家法律法规规定的方法实施安乐死。
注意：建议对出生后10天（DOL 10）以内的幼崽采用断头法，对年龄超过DOL 10的幼崽采用颈椎脱位法。不建议使用CO2或麻醉剂进行安乐死，因为幼崽对这些方法具有较强的耐受性。 - 将已安乐死的动物置于双目显微镜下。
- 用70%乙醇擦拭动物腹部。
- 使用镊子夹起腹部皮肤及下方腹膜，用精细剪刀做一较大的横向腹部切口（垂直于头尾轴），注意不要剪到肠管。
- 将精细剪刀轻轻插入切口，并向两侧沿腹膜延伸切口。
- 使用镊子和精细剪刀，从胸腔区域向下至盆腔下部，剪开腹膜的上部和下部（图2A）。
- 识别结肠远端，并沿其轴线方向朝直肠做一平行切口。
- 在结肠末端/直肠部分做切口，以游离该段结肠。
- 轻轻牵拉结肠，向盲肠方向推进，去除可能附着的结缔组织或脂肪组织。
- 在盲肠上方的回盲交界处剪断，将结肠从腹腔中游离出来（图2B）。
- 弃去盲肠及近端结肠起始的数毫米部分，然后从近端结肠采集一至两份大于Ussing腔室滑块孔径的组织样本（图2C）。
注意：建议获取两份稍大的活检样本，因为新生期结肠极为脆弱，在清洗和安装过程中容易撕裂、割伤或穿孔。 - 将剪刀闭合，轻轻施加压力，从近端向远端滑动，以清除展平后的活检组织中的粪便内容物。
- 将排空后的结肠组织置于冰冻的KRB缓冲液中。
图 2：DOL 10 天幼鼠结肠的解剖过程。为避免意外切开结肠，需分两步切开并打开幼鼠的表皮和腹膜，直至完全暴露整个腹腔（A）。通过首先切断远端/直肠部分，再于盲肠上方进行第二次切断，将结肠从腹腔中游离出来（B）。弃去近端结肠最初的数毫米组织，采集一段或两段大于Ussing腔室滑片孔径的结肠样本（C）。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 使用Ussing chamber中鼠类结肠活检组织进行结肠通透性检测
- 检测的准备
- 在进行Ussing实验的前一天。为确保最佳的实验条件，建议在实验前一天配制多种溶液。这些溶液的配制方法见表1。
注意：下列表格中列出的用量适用于12个Ussing室，KRB 10x溶液配制量较大，以便分装使用。
注意：KRB 10x溶液可在4 °C下保存6-12个月。 - 实验当天，在动物安乐死前30分钟：
- 按照表2中的说明配制400 mL KRB缓冲液。
注意：KRB 10x溶液、去离子水和碳酸氢盐必须预先混合，并用碳氧混合气体（95% O2；5% CO2）鼓泡15分钟，之后再加入CaCl2，以避免沉淀产生。 - 使用碳氧混合气体系统（95% O2；5% CO2），对新鲜配制的KRB缓冲液鼓泡15分钟。
- 将400 mL KRB缓冲液均分为两份，分别配制200 mL Krebs-葡萄糖溶液、200 mL Krebs-甘露醇溶液，以及按照表3所述配制HRP溶液。
- 按照表2中的说明配制400 mL KRB缓冲液。
- Ussing系统设置
- 将Ussing系统预热至37 °C。
- 按以下步骤预组装室腔：
- 抬起每个插槽的卡扣。
- 将室腔放入对应插槽中，暂不拧紧系统。
- 将两根供气管插入室腔的相应部分。
- 将四根电极插入前方开口处（如配备——本文未涵盖），或在实验前使用装有胶水的200 µL枪头密封四个开口。
- 在室腔下方放置托盘，以防可能的泄漏。
- 组织安装
- 用纸巾轻轻擦干先前清洗过的结肠样本，去除多余水分。
- 将结肠组织置于放大镜下，用精细剪刀的一侧刀片轻轻插入肠腔部分，将其剪开（图3A）。
注意：剪开操作可在剪刀完全插入后一次性完成。所用结肠段应尽可能平直，避免扭曲。 - 使用精细镊子，将组织安装在滑块的白色部分，保持肠腔面朝上，面向操作者。组织应无脂肪残留、粪便、皱褶、穿孔或撕裂，并充分覆盖开口区域（图3B）。
- 在双目显微镜下闭合滑块，并检查组织是否发生位移。当对滑块施加压力时，应能观察到组织轻微变形，表明滑块已紧密闭合。
注意：将滑块安装至Ussing室（图4）后，一旦准备就绪，应立即单独开始平衡步骤，以防止样本脱水。 - 在保持轻微压力使滑块闭合的同时，将滑块插入Ussing室，确保肠腔（滑块透明部分）朝向左侧。
- 闭合两侧卡扣，并拧紧右侧的螺丝，直至室腔密封且滑块无法移动。
- 最终设置与平衡
- 向室腔左侧（顶侧）加入4 mL Krebs-甘露醇溶液。
- 向室腔右侧（基底侧）加入4 mL Krebs-葡萄糖溶液。
- 在两个室腔之间放置一小片Parafilm膜，以防止交叉污染。
- 打开气体进气口（95% O2 / 5% CO2），调节出气速度至每秒1-2个气泡。
- 使用巴斯德移液管清除组织或系统中残留的大气泡。
- 让系统平衡20-30分钟。
- 按照表4所述配制FITC 4kDa + HRP + 甘露醇溶液。
- 在进行Ussing实验的前一天。为确保最佳的实验条件，建议在实验前一天配制多种溶液。这些溶液的配制方法见表1。
- 开始结肠通透性检测
- 当系统达到平衡后，从顶侧室腔（左侧）移除200 µL Krebs-甘露醇溶液，并立即加入200 µL FITC 4kDa + HRP + 甘露醇溶液，同时启动计时器。通过在室腔内轻柔上下吹打清洗移液枪头，并在每次使用后更换枪头，以避免交叉污染。
- 对每个室腔，从基底侧（右侧）收集2次100 µL样本（重复两次），并加入黑色96孔板中。用铝箔覆盖板子，避免板中FITC发生光降解。
- 立即用200 µL新鲜Krebs-葡萄糖溶液替换之前收集的200 µL样本。
- 每30分钟重复步骤（2）和（3），直至达到2小时时间点，以获得以下时间点：T0、T30、T60、T90 和 T120。
- 用铝箔密封96孔板，防止FITC光降解，并进行FITC定量分析。
| MgCl2 1M | |||
| MW (g/mol) | 终体积 = 20 mL | 终浓度 | |
| milli-Q H2O | 加水至终体积 | ||
| MgCl2, 6H2O | 203.3 | 4.066 g | 1 M |
| KRB 10X | |||
| MW (g/mol) | 终体积 = 1L | 终浓度 | |
| milli-Q H20 | 加水至终体积 | ||
| NaCl | 58.44 | 70 g | 1.198 M |
| KCl | 74.55 | 3.4 g | 45.6 mM |
| Na2HPO4 , 2H2O | 177.99 | 1 g | 5.62 mM |
| NaH2PO4 , 2H2O | 156.01 | 2.3 g | 14.7 mM |
| MgCl2 1M | 5 mL | 5 mM | |
| 碳酸氢盐 750 mM | |||
| MW (g/mol) | 终体积 = 250 mL | 终浓度 | |
| milli-Q H2O | 加水至终体积 | ||
| NaHCO3 | 84 | 15.75 g | 750 mM |
| CaCl2 2M | |||
| MW (g/mol) | 终体积 = 50 mL | 终浓度 | |
| milli-Q H2O | 加水至终体积 | ||
| CaCl2 | 111 | 11.098 g | 2 M |
表1：Ussing实验前一天的溶液配制。
| KRB 缓冲液 (400 mL) | ||
| 体积 | 终浓度 | |
| KRB 10X | 40 mL | 1X |
| H2O (milli-Q) | 352 mL | |
| 碳酸氢盐 750 mM | 8 mL | 15 mM |
| CaCl2 2M | 240 µL | 1.2 mM |
表2：Ussing实验当天KRB缓冲液的配制。
| Krebs-葡萄糖/甘露醇（每种 200 mL） | ||||
| 终体积 = 200 mL | 终浓度 | |||
| KRB 缓冲液 | 加至终体积 | |||
| 葡萄糖 | 360 mg | 10 mM | ||
| 或 | ||||
| 甘露醇 | 364 mg | 10 mM | ||
| HRP 溶液 | ||||
| 终体积 = 1480 µL | 终浓度 | |||
| Krebs-甘露醇 | 加至终体积 | |||
| HRP | 13 mg | 8.8 mg/mL | ||
表3：Ussing实验当天Krebs-葡萄糖/甘露醇和HRP溶液的配制。
| FITC 4kDa + HRP + 甘露醇溶液 | ||
| 适用于12个腔室 | 体积 | 终浓度 |
| HRP (8.8mg/ml) | 1345 µL | |
| Krebs-甘露醇 | 1155 µL | |
| FITC 4Kd | 166.6 mg | 16.66 mM |
表4：在Ussing实验当天配制FITC 4 kDa + HRP + 甘露醇溶液。
图3：DOL 9幼犬结肠样品的安装。 将精细剪刀的一侧刀刃插入样品的管腔段，一次性完成切割（A）。将打开的样品安装在Ussing滑片孔上，使管腔面朝向操作者（B）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：完全准备好的尤辛室装置照片。 请点击此处查看此图的放大版本。
4. 通过 FITC 定量评估结肠旁细胞通透性
- FITC 标准品的制备
- 将 FITC 4Kd + HRP + 甘露醇溶液用 Krebs-葡萄糖溶液稀释，按照 表5 和 图5 所述方法配制标准品系列稀释液。
- 将编号从1至7的每种标准品稀释液各取 2 × 100 µL（设重复孔）加入酶标板中。用铝箔密封酶标板，避光保存，直至开始读板。
- 数据采集：使用酶标仪，设定激发波长为 485 nm，发射波长为 535 nm，并尽快完成酶标板的读数。
注意：建议在自动优化增益和手动设定增益两种模式下均进行读板，以便于不同酶标板间数据的比较，并在标准品稀释出现误差时便于数据插值校正。 - 酶标板保存：在完成 FITC 定量数据采集后，若计划在接下来几天内进行 HRP 定量，则将酶标板用铝箔密封后于 4 °C 过夜保存；如需长期保存，则应置于 -80 °C 冻存。
图 5：FITC 标准品稀释制备的可视化示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。
| FTIC 标准稀释液 | |||||||
| N° | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 稀释液 | FITC 储存液 1:10000 稀释 | 稀释液编号1 的 1:2 稀释 | 稀释液编号2 的 1:2 稀释 | 稀释液编号1 的 1:10 稀释 | 稀释液编号4 的 1:2 稀释 | 稀释液编号5 的 1:2 稀释 | |
| Krebs-葡萄糖溶液 | |||||||
| FITC (µM) | 1.66 | 0.83 | 0.415 | 0.166 | 0.083 | 0.0415 | 0 |
表5：在Ussing实验当天制备FITC标准品稀释液。
5. 通过HRP定量评估结肠跨细胞通透性
- 进行 HRP 定量检测实验的前一天：
- 确保实验当天条件最佳；实验前一天需配制多种溶液。这些溶液的配制方法见表6。
注意：以下表格列出的用量适用于一块 96 孔板。HRP 标准品可分装后于 -20 °C 或 -80 °C 保存数月。由于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液不稳定，应仅使用新鲜配制的缓冲液。 - 在配制抗 HRP 抗体溶液后，立即向透明 96 孔平底高吸附微孔板中每孔加入 100 µL 抗体溶液。用铝箔纸包裹后，于 4 °C 过夜孵育。
- 确保实验当天条件最佳；实验前一天需配制多种溶液。这些溶液的配制方法见表6。
- 进行 HRP 定量检测实验当天：
- 按表7所述方法配制 5% BSA 封闭缓冲液。
- 弃去孔内液体，每孔加入 280 µL PBS Tween 洗涤液，共洗涤 4 次，每次洗涤间以 350 rpm 振荡 1 分钟。
- 向每孔中加入 200 µL BSA 封闭缓冲液。
- 用铝箔纸密封微孔板，置于摇床上以 500 rpm 振荡孵育至少 1 小时。在此期间，将样品解冻并稀释（1:10 或 1:50），并按表8所述方法配制标准品稀释液。
- 弃去孔内液体，每孔加入 280 µL PBS Tween 洗涤液，共洗涤 4 次，每次洗涤间以 350 rpm 振荡 1 分钟。
- 向每孔中加入 50 µL 标准品或稀释后的样品，密封微孔板，于室温下以 300 rpm 振荡孵育 1 小时。
- 孵育期间，将 QuantaBlu 试剂恢复至室温，并按表9所述方法配制工作液。
- 弃去孔内液体，每孔加入 280 µL PBS Tween 洗涤液，共洗涤 4 次，每次洗涤间以 350 rpm 振荡 1 分钟。
- 向每孔中加入 100 µL QuantaBlu 工作液，在室温或 37 °C 孵育 1.5 至 90 分钟（平均 30 分钟）。
注意：可通过紫外光源下观察到强烈的蓝色荧光来监测反应进程。 - 向每孔中加入 100 µL QuantaBlu 终止液以终止过氧化物酶活性。密封微孔板，并在 350 rpm 振荡条件下于室温孵育 10 分钟。
- 使用酶标仪，将激发波长设为 315 nm，发射波长设为 470 nm，尽快读取微孔板数据。
注意：建议同时在最佳增益和手动设定增益条件下读数，以便于不同微孔板间数据的比较，并在标准品稀释出现错误时仍可进行数据插值分析。除 QuantaBlu 荧光过氧化物酶底物试剂盒外，也可使用其他过氧化物酶底物（如四甲基联苯胺，分别在加入或不加终止液的情况下于 450 nm 或 650 nm 处检测），但替代方法的灵敏度较低。
| BSA 溶液 | |||
| 分子量 (g/mol) | 终体积 = 12.7 mL | 终浓度 | |
| Milli-Q H2O | 加至终体积 | ||
| BSA | 66430 | 1.27 g | 100 mg/mL |
| Krebs-葡萄糖 + BSA | |||
| 分子量 (g/mol) | 终体积 = 30 mL | 终浓度 | |
| Krebs-葡萄糖 | 加至终体积 | ||
| BSA 溶液 | 60 µL | 0.2 mg/mL | |
| PBS 吐温 | |||
| 分子量 (g/mol) | 终体积 = 500 mL | 终浓度 | |
| PBS 1X | 加至终体积 | ||
| 吐温-20 | 500 µL | 0.1% | |
| 碳酸钠溶液 | |||
| 分子量 (g/mol) | 终体积 = 3.22 mL | 终浓度 | |
| Milli-Q H2O | 加至终体积 | ||
| Na2CO3 | 105.99 | 34.13 mg | 0.1 M |
| 碳酸氢钠溶液 | |||
| 分子量 (g/mol) | 终体积 = 12.7 mL | 终浓度 | |
| Milli-Q H2O | 加至终体积 | ||
| NaHCO3 | 84 | 106.68 mg | 0.1 M |
| 包被缓冲液 pH 9.6 | |||
| 终体积 ≈ 11 mL | |||
| 碳酸钠溶液 | 2.58 mL | ||
| 碳酸氢钠溶液 | 加至 pH = 9.6（约 8.4 mL） | ||
| 10 µM HRP 标准品 | |||
| 初始浓度 | 终体积 = 5 mL | 终浓度 | |
| Krebs-葡萄糖 | 加至终体积 | ||
| HRP 溶液 | 8.8 mg/mL | 50 µL | 0.088 mg/mL |
| BSA 溶液 | 100 mg/mL | 10 µL | 0.2 mg/mL |
| 1.5 nM HRP 标准品 | |||
| 初始浓度 | 终体积 = 15 mL | 终浓度 | |
| Krebs-葡萄糖 | 加至终体积 | ||
| 2.0 µM HRP 标准品 | 0.088 mg/mL | 2.25 µL | 13.2 ng/mL |
| BSA 溶液 | 0.2 mg/mL | 3 µL | 40 ng/mL |
| 抗 HRP 抗体溶液 | |||
| 初始浓度 | 终体积 = 10 mL | 终浓度 | |
| 包被缓冲液 | 加至终体积 | ||
| 抗 HRP 抗体 | 5.6 mg/mL | 8.93 µL | 5 µg/mL |
表6：HRP实验前一天的溶液配制。
| BSA 封闭缓冲液 | |||
| 初始浓度 | 终体积 = 25 mL | 终浓度 | |
| PBS 1X | 12.5 mL | ||
| BSA 溶液 | 100 mg/mL | 12.5 mL | 50 mg/mL |
表7：HRP实验当天BSA封闭缓冲液的配制。
| 标准品 | Krebs-葡萄糖 + BSA | 1.5 nM HRP 标准品 | Fmol HRP/50 µL |
| 空白 | 1000 µL | 0 µL | 0 |
| 1 | 993.75 µL | 6.25 µL | 0.09375 |
| 2 | 987.5 µL | 12.5 µL | 0.1875 |
| 3 | 975 µL | 25 µL | 0.375 |
| 4 | 950 µL | 50 µL | 0.75 |
| 5 | 900 µL | 100 µL | 1.5 |
| 6 | 850 µL | 150 µL | 2.25 |
| 7 | 800 µL | 200 µL | 3 |
| 8 | 700 µL | 300 µL | 4.5 |
| 9 | 600 µL | 400 µL | 6 |
| 10 | 400 µL | 600 µL | 9 |
| 11 | 200 µL | 800 µL | 12 |
表8：HRP实验当天HRP标准品的配制。
| QuantaBlu 工作溶液 | |
| 终体积 = 12 mL | |
| QuantaBlu 底物溶液 | 10.8 mL |
| QuantaBlu 稳定过氧化物溶液 | 1.2 mL |
表9：HRP实验当天QuantaBlu工作液的配制。
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结果
标准曲线绘制与孔浓度定量
从每孔的吸光度值中减去空白对照孔的平均值。以Y轴为吸光度值，X轴为浓度，使用GraphPad Prism软件中的“插值标准曲线（Interpolate a standard curve）”功能绘制标准曲线。若所有标准品点呈线性排列，“线性（Line）”模型可提供最佳拟合结果； alternatively，采用“S型四参数逻辑斯蒂模型（Sigmoidal, 4 PL, X is concentration）”可在非线性标准曲线插值时提供更高的灵活性与准确性（图6）。将待测样本的吸光度值（Y轴）填入标准品下方，通过结果表中的“插值得到的X平均值（Interpolated X mean values）”反推出各样本的浓度（图6）。
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讨论
口服灌胃可对单个新生小鼠重复给予精确且剂量明确的管腔内给药。相比之下，虽然自主摄食是一种可行的替代方法，但每只动物需要更长的给药时间，且所给予的化合物剂量较低，给药精度也较差。12此外，灌胃给药可容纳比可行方法更大的体积 通过 可注射途径，有助于在较低浓度下实现更高的总剂量，从而在给药时最大限度地降低潜在毒性13消化道的转运进一步限制了该化合物的分布容积，这对于研究肠道通透性和屏障功能具有优势。然而，毒性会因发育阶段和分子类别而存在显著差异；因此，首次对新生动物施用任何处理时必须格外谨慎。对新生幼鼠进行灌胃是一项精细操作，需要经过专门训练，尤其是出生后10天（DOL 10）以内的幼鼠。建议使用含深色食用染料的PBS进行训练，成功灌胃后可在幼鼠胃部观察到明显的深色区域。若染料出现在胃以外区域，特别是咽喉或胸腔部位，则表明灌胃失败，应立即对幼鼠实施安乐死。此外，灌胃操作不应在麻醉状态下进行，因为溶液的正确递送依赖于幼鼠主动吞咽饲管，这也有助于降低对上食管括约肌造成损伤的风险。 和抽吸...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作获得了ANR-11-IDEX-0005-02卓越实验室INFLAMEX的财政支持、未来基金会（2025，AP-RM-24-012）的资助以及ANR Diab1GUT项目（ANR-24-CE15-7152）的资助。本研究在INFIBREX联盟的框架下开展，并受益于以下机构的支持 "法国2030" 投资计划，由法国政府发起，并由巴黎城市大学（Université Paris Cité）负责实施 "卓越计划" IdEx 项目（ANR-18-IDEX-0001）。我们衷心感谢炎症研究中心Ussing Chamber技术平台提供的宝贵支持，并特别感谢Alexandra Willemtz和Maude Le Gall给予的专业协助。我们还要诚挚感谢炎症研究中心动物实验平台提供的关键支持，并特别感谢Isabelle Renault和Guillaume Anselmet的大力帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含钙的10倍浓度DPBS && Mg | 杜尔贝科氏 | 14200091 | |
| 抗-HRP 抗体 | Nordic Biosite | GTX10183 | 单克隆小鼠辣根过氧化物酶IgG [2H11] |
| 双目放大镜 | Olympus | SZ61 | 无需特殊要求。 |
| 黑色平底96孔板 | ThermoFisher Scientific | 137101 | 培养板必须为黑色，并适用于荧光检测。检测时需取下盖子。 |
| BSA | 默克 | A4503 | |
| C57BL/6J 小鼠 | 查尔斯河实验室 | 632C57BL/6J | |
| CaCl2 | 默克 | 2382 | |
| 透明96孔透明平底高结合板 | 康宁 | 9018 | |
| D-(+)-葡萄糖 | 默克 | G8270 | |
| 蒸馏水 H2O | |||
| D-甘露醇 | 默克 | M4125 | |
| 精细镊子 | FST | 11445-12 | |
| 精细剪刀 | FST | 14058-09 | |
| FITC-葡聚糖 4Kd | FD4 | TdB Labs | 对光降解敏感。 |
| 加热垫 | Minerve | 20 031 01 | |
| HRP | 默克 | P8375 | |
| MgCl₂2，6H2O | 默克 | M2670 | |
| Milli-Q H2O | |||
| P2300 EasyMount Ussing 系统 &和 Chambers | 生理学仪器 | EM6-C-CE | 系统、腔室和滑块必须全部兼容。 |
| P2306 Ussing Chamber 滑片 | 生理学仪器 | PI-P2306 | 适用于不同大小和形态组织的滑块有多种型号可供选择。 |
| QuantaBlu 荧光过氧化物酶底物试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 15169 | |
| 可重复使用喂养针，圆头 | FST | 18061-24 | 24 号，1.25 mm 尖端直径，圆头。使用前须用无菌水、70% 乙醇清洗，并经高压灭菌。 |
| 碳酸氢钠 | 默克 | S6297 | |
| 碳酸钠 | 默克 | S7795 | |
| 分光光度计 | TECAN | Spark 10M | 若使用137101黑色板，则需要配备顶部检测功能的酶标仪。 |
| Tween-20 | 默克 | P7949 |
参考文献
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