一种由农杆菌介导的棕榈植霉转化的简化方法

摘要

我们提出了一种简单、有效且可重复的农 杆菌介导的棕 榈菌 转化方案，该方案同样适用于 P. capsici。

摘要

疫霉 属是一种卵菌属，含有多种破坏性植物病原体，其中包括广泛寄主分布的 棕榈叶植物。疫 菌 的功能基因组学受限于有限的强大且易于实施的转化方法。在现有方法中， 农杆菌介导转化（AMT）尤具吸引力，因为它所需的专业设备极少，且通常能通过单拷基因插入产生稳定的转化体。大多数AMT用于真菌和卵菌转化的方案在 农杆 菌诱导和共培养基中使用最小培养基（MM）盐。制备这些培养基通常涉及制作和混合多种高汤溶液，其中一些含有不同浓度的多种成分。该过程耗时且易出错，因此导致转换成功率不稳定。本文介绍了一种简化、简洁且可重复的棕 榈杆菌 AMT方案，使用市售的Murashige和Skoog（MS）基础培养基制备 农杆菌 诱导和共培养基。该方案也已成功应用于转化 P. capsici ，并可能应用于其他 Phytophthora 属植物。

引言

卵菌属植物属（Phytophthora）包含世界上许多最具破坏性的植物病原体，导致严重的经济损失 ^1,2。其中，棕榈植霉是一种广泛寄主的病原体，感染许多经济重要作物，包括可可和木瓜³。它是可可中最广泛的黑荚腐病致病因子，可可是一种热带多年生树木，是数十亿美元巧克力产业的主要原料 ^4,5,6。理解这种破坏性病原体的分子致病机制对于设计新颖有效的疾病控制策略至关重要，而基因转化是推动此类研究的重要工具。

已开发多种方法用于转化Phytophthora属，包括微弹射击⁷、聚乙二醇和二氯化钙（PEG/CaCl2_）介导的原生质体转化8,9,10,11，动物孢子电穿孔12,13,14，以及农杆菌介导转化（AMT）^15，16. 在这些方法中，AMT具有关键优势，因为它通常能生成单拷贝^{基因整合，且操作}相对简单，无需专用设备。

此前已有一套利用AMT高效转化棕榈叶草的^方案。通过该方法，我们成功用多种构造转化了P. palmivora ^17,18。该方法采用最小培养基（MM）盐基农杆菌诱导和共培养基，常用于真菌和卵菌转化 15,16,19。尽管基于MM的转化协议已被证明在生成转化体方面有效，但准备多个库存溶液并将它们组合以生成介质，既耗时又容易出错。

本文介绍了一种更简化的棕 榈杆菌 AMT方法，使用商业Murashige和Skoog（MS）基础培养基替代 农杆 菌诱导和共培养基中的MM盐基培养基成分¹⁶。该方法免除了制备多种化学原料溶液的需求，使过程更省时且高度可重复。此外，该方法相比前述方法¹⁶具有更高的转化效率，且同样适用于 P. capsici。

方案

1. 准备原料溶液、培养基及其他转化所需的材料

1. 抗生素库存溶液
   1. 制备卡那霉素（50 mg/mL）、G418（15 mg/mL）和头孢悽肟（100 mg/mL）的存制溶液：将适量抗生素溶解于水中，进行过滤灭菌，制备1毫升分量，并在-20°C下储存。
   2. 制备利福平（15 mg/mL）的浓汤溶液：将适量的利福平溶解在DMSO中，制备1毫升分纸，用锡纸包裹，保存于-20°C。
      注意：确保使用DMSO兼容材料（如尼龙或PTFE（特氟龙）制成的注射器过滤器对DMSO制备的化学溶液进行过滤灭菌。
2. 农 杆菌 生长介质
   1. Luria-Bertani（LB）液体培养基：制备250毫升培养基时，将6.25克LB粉末加入250毫升水中，用高压灭菌处理，并在室温（RT）下储存。
   2. LB琼脂培养基：制备250毫升培养基时，将6.25克LB粉末和3.75克琼脂加入250毫升水中，高压灭菌处理后保存。在制作平板前，向熔化后的LB琼脂添加适当的抗生素。将平板与抗生素一起存放于4°C。
3. 棕榈叶草的培养基生长与转化
   1. 10% V8琼脂：要制备500毫升琼脂，将50毫升原味V8 100%蔬菜汁加入450毫升水中。然后向懸浮液中加入0.5克_CaCO3 ，搅拌均匀。用高压灭菌处理溶液，倒入盘子中。
      注意：必要时添加适当的抗生素。将平板与抗生素一起存放于4°C。
   2. 半浓度的Murashige和Skoog（1/2 MS）液体培养基：将2.15克Murashige和Skoog基础培养基（MS）加入950毫升水中，调pH至5.6，加1 N KOH，加入最多1升的水。直接用它制备半毫秒琼脂（步骤1.3.3），剩余半毫秒液体高压灭菌，储存在RT中。
   3. 用于农 杆菌-动物孢子共培养琼脂（AZCA）：制备600毫升AZCA时，将步骤1.3.2中1/2毫秒的567毫升液体与9克琼脂混合。溶液用高压灭菌消毒保存。
   4. 50%甘油：将50毫升甘油与50毫升水混合，高压灭菌处理后保存于RT。
   5. 1M MES（pH 5.6）：制备200毫升时，将39.048克MES水合物加入160毫升水中，然后用NaOH溶液调整pH至5.6。接着，加入200毫升以下的水，过滤灭菌，并在黑暗条件下储存在RT中。
      注意：随着pH值升高，MES会逐渐溶解。最初用10 N NaOH将pH值调近5.6，这样粉末几乎能溶解。然后加入1个N NaOH，使pH值正好达到5.6。
   6. 20%葡萄糖：将10克葡萄糖溶解在40毫升水中，然后加入至50毫升的水，进行过滤灭菌，并储存在RT中。
   7. 200 mM 乙酰心灵酮（AS）：将40毫克4'-羟基-3'，5'-二甲氧基乙酰苯酮溶解在1毫升DMSO中（详见1.1.2下的说明），并用锡纸覆盖溶液。在变身当天保持新鲜。
   8. 农杆菌 诱导培养基（AIM）：制备40毫升培养基时，在无菌50毫升管中加入400微升50%甘油、400微升20%葡萄糖、1.6毫升1 M MES（pH 5.6）、40微升200 mM AS至37.6毫升1/2毫秒液体（pH 5.6）溶液（步骤1.3.2制备），置于无菌50毫升管中。将溶液充分混合，用锡纸覆盖管子，并在几小时内新鲜使用。
   9. 农杆菌-游虫共培养琼脂（AZCA）：制备600毫升琼脂时，加入6毫升50%甘油、3毫升20%葡萄糖、24毫升1 M MES（pH 5.6）、600微升200 mM AS高压灭菌并熔化的567毫升半毫秒琼脂（pH值5.6）（步骤1.3.3制备）。将溶液倒入盘子中，并用黑布覆盖以防光。
      注意：当温度为55-60摄氏度时，将化学溶液加入熔化的半毫秒琼脂中（步骤1.3.9）。 在步骤1.3.7-1.3.9时关闭引擎盖灯，因为AS对光敏感。在转变当天执行这三个步骤。
   10. 普利奇琼脂：制备1升琼脂时，需在950毫升水中加入0.5克KH₂PO 4,0.25克 MgSO ₄·7H₂O，1克L-天冬氨酸，5克葡萄糖，0.5克酵母提取物，10微升硫胺素（100 mg/mL，水中，保存温度4°C），10毫克β-植物甾醇（溶解于3毫升乙醇中后加入）。搅拌溶液溶解所有成分，然后加水使体积达到1升。将溶液分成500毫升，每份500毫升加入7.5克琼脂。溶液用高压灭菌处理，温度降至55°C时加入相应抗生素，然后倒入盘中。
   11. Hybond N+膜：将带保护片的膜切成5厘米×6厘米的块，用铝箔包裹，然后用高压灭菌处理。将高压灭菌膜放置在AZCA培养基上时，用无菌镊子处理，并丢弃保护膜。

2. 棕榈叶菌的培养

1. 在转化前七到八天，将棕 榈 木瓜分离P1¹⁶，在新鲜制作的10% V8琼脂平板上，将一块先前培育 的植被菌 培养物（或来自株内）的琼脂塞放在培养皿中央。
   注意：为了获得更高浓度的游动孢子，使用新鲜制备的未澄清10%V8琼脂非常重要。
2. 在25°C下，进行12小时光照/12小时暗期的孵育周期，7-8天，直到转化。

3. 农杆菌的制备

1. 转化前三天，携带pCB301TOR-GFP¹⁶的Eha105菌株，在LB琼脂平板上添加利福平（15 μg/mL）和卡那霉素（50 μg/mL）上。在28°C下孵育该平板2天。
   注意： 农杆菌的初步制备（步骤3.1）可在转化前一周进行，培养板可在2天孵育期后保存至4°C。
2. 转化前一天，取少量 农杆菌 细胞，并用无菌1.5毫升微离心管的底部和平底涂抹在新的LB琼脂平板上，补充抗生素（步骤3.1中描述）。为了方便涂抹，可以在LB琼脂板中央加入20微升LB液体培养基，将细菌细胞与LB培养基混合，然后均匀涂抹在培养基上。将平板在28°C下孵育一夜约16-18小时。
3. 用1毫升移液器吸头将培养过的细胞舀入一夜，然后通过上下移液将其重新悬浮在1毫升农 杆菌 诱导培养基（AIM）中。在无菌50毫升管内，用AIM稀释细胞至OD₆₀₀ = 0.4，管内有锡纸覆盖。制作至少5毫升，用于与 棕榈芽孢 子共孵（步骤5.1）。
   注意：OD₆₀₀ 范围在 0.1 到 0.8 之间，可以实现成功的变换。OD₆₀₀ = 0.4是常规使用的，因为该浓度在使用最小培养基（MM）盐基农杆菌诱导和共培养基进行转化时，转化效率^最高。
4. 在RT环境中，在暗条件下用平台摇床轻轻搅拌（约70转/分钟）孵育细菌1.5-2小时。
   注意：建议在第3.3步关闭罩灯，并在孵育期间（第3.4步）松开50毫升管的盖子。

4. 释放游走孢子

1. 经过1小时的 突起 农芽菌孵育（步骤3.4），将7-8天的 棕榈杆菌 培养板注入10毫升预冷水，用移液器尖端轻敲培养基表面的气泡，然后在4°C下培养板15分钟，随后在光照下用RT培养15分钟。
2. 用移管轻柔地将释放的游动孢子（约7-8毫升）转移到15毫升无菌离心管上，同时不扰动菌丝体和孢子囊。
3. 测量游动孢子浓度时，将部分游动孢子悬浮液（例如20微升）转移到1.5毫升微离心管中，并用水稀释10倍（20微升游动孢子为180微升H，20_微升）。在管子内旋转1分钟，形成囊状孢子以便计数，然后用血细胞计在显微镜下计数游动孢子的数量。将计数数乘以10倍，确定步骤4.2中制备的动物孢子悬浮液浓度。
   注意：通过测量游动孢子浓度来计算转化效率。我们通常使用浓度范围为每毫升1.5×106到5×106^个游动孢子，转化成功。

5. 农杆菌与游动孢子的共孵

1. 将5毫升农 杆菌（步骤3.4制备）加入5毫升动物孢子悬浮液（步骤4.2准备）中，放入无菌的50毫升管内，外覆锡纸。轻轻混合，在RT下在黑暗中孵育2小时。保持盖子松动，共孵期间不要摇晃管子。
2. 在共孵育期间（步骤5.1），准备AZCA平板（步骤1.3.9）。培养基凝固后，将一片消毒过的Hybond N⁺ 膜（步骤1.3.11中制备）放在每个AZCA板上，并保持平板在黑暗中。
3. 在农 杆菌与动物孢子共孵育2小时（步骤5.1）后，用移液器尖端将300微升混合物涂抹在放置在AZCA板顶的每个Hybond N⁺ 膜上（步骤5.2），保持边缘未沾液体。
4. 让混合物在抽油烟机中自然风干约10分钟，保持培养皿不盖盖。一旦膜上的溶液停止流动，就尽快盖好板子。
   注意：在步骤5.1-5.4期间，保持引擎盖灯关闭。如有必要，在添加和涂抹混合物时使用灯光（步骤5.3）。
5. 风干后，在25°C的黑暗下孵育2天。

6. 选择G418耐药转化物

1. 共孵育48小时（步骤5.5）后，使用消毒镊子倒置将Hybond N⁺ 膜转移到补充G418（30 μg/mL）和头叶紫杉肟（100 μg/mL）的Plich琼脂平板上。将膜放置在板上时，不要拖拽在介质表面。
   注意：必须确定每种 棕榈叶菌 分离株中转化物选择中的G418浓度，因为不同分离株的敏感度不同。为此，在Plich琼脂平板中央放置一个直径0.5厘米的菌丝塞，并从零开始，以5 μg/mL的剂量添加一系列G418浓度。为每种浓度准备三块复制板。将平板在25°C下孵育7天。确定完全抑制 植霉 菌分离株生长的最低G418浓度，并用于转化物的选择。
2. 使用1.5毫升微离心管的平底轻轻按压并滑动膜表面，确保其与介质紧密接触。观察板子底部，检查膜与培养基之间是否有气泡。用同一根微型离心管的平面底部轻轻挤出气泡（如果有的话）。
3. 在25°C下，以12小时光照/12小时暗期的周期孵育2-3天。
4. 潜伏3天后，使用无菌产钳取出这些膜，并在相同条件下继续培养平板。如果板上出现明显菌落，2天后可以去除膜。
   注意：转化体通常在膜切除后1-3天内出现，但部分菌落可能较晚出现。为了产生更多转化物，去除膜后观察板块大约一周。
5. 将转化物转移到10%的V8琼脂平板上，G418浓度相同或降低30%。

结果

遵循该方案，我们进行了两项独立实验，利用携带pCB301TOR-GFP¹⁶的A. tumefaciens EHA105进行转化。如预期，游动孢子与农杆菌共孵育，在Plich琼脂平板上添加30 μg/mL G418，形成抗G418菌落，而在对照板上则未观察到未感染农杆菌的菌落（见图1A）。这两项实验中每107^个游动孢子产生的G418耐药转化体数量分别为55个和50个（见表1），几乎是之前使用¹⁶方案获得的最高数（27±5）的两倍。

真正的转化体通过两种方法得到验证：首先，使用荧光显微镜观察GFP荧光;其次，利用引物对EGFP-F2（5'- GACGTAAACGGCCACACACAGTT-3'）和EGFP-R2（5'-GGGTGCTCAGGTAGTGTG-3'）对550碱基对 EGFP 基因片段进行PCR扩增。实验（实验）1中，18种抗G418转化剂中有15种表现出GFP荧光;实验2中，21种转化物中有17种表现出GFP荧光（见表1， 图1B）。对于七个两次实验均未显示荧光的G418抗性转化物，其中三个通过PCR确认为真正的转化体（见图1C）。总体估计，真正的转化率为90%。

此外，我们还成功转化了P. capsici南瓜分离株PC2024-14sz，使用携带pCB301TOR-GFP的A. tumefaciens EHA105，遵循该方案，仅对游虫悬浮液的制备做了小幅修改（在注水7天的P. capsici板后，4°C的潜伏期延长至30分钟）。单次实验中每107对G418（30 μg/mL）抗性转化体的数量为13个。在荧光显微镜下观察到九种转化体，均产生荧光（补充文件1），表明它们是真正的转化体。

图1：利用 携带pCB301TOR-GFP的A. tumefaciens EHA105进行棕榈叶蛋白的转化。（A） 在补充30 μg/mL G418的Plich琼脂上出现的抗G418棕榈叶虫转化体。（B）在荧光显微镜下检测到具有代表性的转化物和P. palmivora野生型（WT）菌株中的GFP表达。图像在明场（BF）和GFP荧光通道下均拍摄。（C）从四个可检测到GFP荧光的转化物和七个无GFP荧光的转化物中进行的 EGFP PCR 扩增。使用通用引物对ITS4/ITS5²⁰扩增内部转录间隔（ITS）区域以检测DNA完整性。没有GFP荧光的转化体以粗体和下划线标示。缩写：M = NEB 100 bp DNA 阶梯;WT = 野生型P. palmivora P1分离株;N = 以H₂O为模板的阴性对照PCR。请点击此处查看该图的放大版本。

实验	农杆菌OD600	动物孢子浓度（/mL）	Zoospore体积（毫升）	G418抗性转化体数量	具有可探测GFP信号的变换体数量（检测/观测）	抗G418转化株数量/107 个游动孢子
1	0.4	1.8 x 106	4.3	43	15/18	55
2	0.4	2.9 x 106	4.6	67	17/21	50

表1： 利用 携带pCB301TOR-GFP的A. tumefaciens EHA105，农杆菌介导的P. palmivora转化效率。

补充文件1：野生型（WT）辣椒P的GFP表达，以及使用携带pCB301TOR-GFP的A. tumefaciens EHA105 生成的代表性转化物。图像在明场（BF）和GFP荧光通道下均拍摄。请点击这里下载此文件。

讨论

该方案采用半强度的Murashige和Skoog基础培养基（1/2 MS）替代常用于农杆菌诱导和共培养基用于卵菌和真菌转化的最小培养基（MM）盐分。制备MM盐基培养基需要从多种化学品中制成多种高汤溶液，然后将^{这些溶液混合}。1/2 MS还含有许多化学成分;然而，由于MS作为预混粉末在商业上广泛流通，介质制备简化为将粉末溶解于水中。这一改装大大缩短了介质准备时间，并最大限度地减少了人为错误的可能性。此外，该方案提高了转化效率，相较于之前描述的AMT方法¹⁶，转化物数量更多。它也有效转化P. capsici，可能适用于其他Phytophthora属物种。进一步支持其更广泛应用潜力的是，基于MS的培养基此前已被用于共培养表达AtVIP1（拟南芥VirE2相互作用蛋白1）和P. infestans游动孢子的农杆菌株，从而成功转化P. infestans²¹。

需要注意的是，该协议可能产生较低比例的误报。在通过GFP荧光观察或PCR测试的39种G418耐药转化体中，有4种既未表现出荧光，也未显示EGFP的扩增（见表1，图1C）。由于农杆菌介导转化过程中T-DNA的部分整合并不罕见^22,23，因此可能只有含有pCB301TOR-GFP¹⁶质粒NPTII基因的T-DNA部分被整合进了P. palmivora基因组。或者，假阳性可能是由于膜与选择培养基接触不足，导致G418选择逃脱。因此，确保膜与培养基保持完全接触（步骤6.2）至关重要。

该协议还可以进一步简化。例如，农 杆 菌诱导培养基（AIM）中的MES和 农杆菌-动物孢子共育琼脂（AZCA）可以被省略。MES常作为缓冲剂在生物化学和分子生物学实验中维持稳定的pH值;然而，在pH 5.6下制备1 M MES库存溶液需要足够时间并增加成本。在植物的AMT中，如甜罗勒²⁴ 和木瓜²⁵，采用了类似的MS基 Agobacterium 诱导和共育培养基，但无MES，表明MES可能并非P . palmivora 转化的必需。需要进一步实验来确认MES的省略不会影响转化效率。

总体而言，这一简化方案为棕 榈菌、 辣椒果菌及可能的其他卵菌的常规基因操作提供了实用且易得的平台。它支持广泛的基础研究，其中一些具有转化潜力，包括对病原体进行荧光标记以追踪感染动态、标记蛋白质以研究亚细胞定位，以及通过基因表达或蛋白质编码序列的靶向变化进行功能分析。结合基于CRISPR的基因组编辑，该方案有望加速对致病机制的剖析及对这些破坏性病原体关键毒力因子的识别。由此产生的见解反过来将推动基于机制的新疾病控制策略的发展。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL微离心管	VWR	525-1126
4'-羟基-3'，5'二甲基乙酰苯酮	TCI	D2666	乙糖核糖环酮（AS）
50毫升管	格赖纳生物一号	227261
绝对乙醇	费舍尔生物试剂	BP28184
琼脂	费舍尔生物试剂	BP1423-500
铝箔
Hybond-N+膜（30厘米，3米）	西提瓦	RPN303B
碳酸钙	西格玛-奥尔德里奇	239216-500G	CaCO3
头孢脱他克钠盐	热力科学化学	AAJ6269006
D-（+）-葡萄糖	西格玛-奥尔德里奇	G8270-1KG
DNeasy PowerLyzer 微生物套件	奇根	12255-50
镊子
荧光显微镜	蔡司		蔡司Axioscope 5荧光显微镜，滤光片组38 HE
G418硫酸盐	热力科学化学	AC329400010
甘油	西格玛-奥尔德里奇	911046-1L
血球细胞计（Bright-Line）	豪瑟科学
硫酸卡霉素	圣克鲁斯生物技术	SC-257635
L-天冬酰胺无水	MP生物医学	ICN10079425
LB 布罗斯，米勒	费舍尔生物试剂	BP1426-2
硫酸镁七水合物	西格玛-奥尔德里奇	63138-250G	MgSO4·7H2O
MES 水合物	西格玛-奥尔德里奇	M2933-100G
Murashige和Skoog基础培养基	西格玛-奥尔德里奇	M5519-50L
培养皿（100毫米 x 15毫米）	VWR	25384-342
磷酸二氢钾	西格玛-奥尔德里奇	1370391000	KH2PO4
利福平	圣克鲁斯生物技术	SC-200910
Taq 2X 母带混音	NEB	M0270L
硫胺盐酸盐	西格玛-奥尔德里奇	T4625-5G
紫外可见光分光光度计	费舍尔科学	14-385-355
V8 原创100%植物汁	坎贝尔汤公司
涡旋器	费舍尔科学	14-955-163
水			分子生物学级，采用Mill-Q水净化系统纯化
酵母提取物	亚克罗斯	611805000	目前由Thermo Scientific Chemicals提供
&β;-植物甾醇	西格玛-奥尔德里奇	85451-100G