本方案旨在建立一种模拟人类肥胖的细胞模型。为此，将人脂肪来源的干细胞分化为脂肪细胞，随后使用特定脂肪酸混合物对这些细胞进行脂质积累处理。
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本文内容
摘要
摘要
与肥胖相关的脂肪组织变化会改变其局部分泌谱，并影响其与周围其他细胞（包括癌细胞）的相互作用。持续的营养供给改变了脂肪细胞的代谢，使其发挥脂质储存库的作用。通常，针对肥胖机制的研究依赖于动物模型，但这类模型无法实现对细胞水平代谢过程的分析。因此，有必要建立一种可靠的 体外 一种用于研究肥胖脂肪细胞与其瘦型对应细胞功能变化的人类肥胖模型。本文介绍了一种利用胰岛素、异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松和吲哚美辛混合物诱导人脂肪前体细胞（脂肪源性干细胞）向脂肪细胞分化的实验方案。随后，将已分化的脂肪细胞与一系列脂肪酸（包括亚油酸、棕榈酸和油酸）共同孵育，以促进脂质积聚。最终成功构建了一种模拟肥胖状态下脂肪细胞肥大的有效模型，可用于后续相关研究。
引言
肥胖被认为是多种疾病的主要风险因素，例如肌肉骨骼系统疾病、心血管疾病、胰岛素抵抗、代谢综合征、糖尿病以及某些类型的癌症1。肥胖是最明显却最被低估的公共卫生问题之一，其成因具有多因素性。简而言之，肥胖由能量摄入与消耗之间的失衡所引发，导致脂肪储存增加2。能量过剩会导致脂肪组织（adipose tissue, AT）发生病理性扩张和功能障碍，而脂肪组织是机体调控能量稳态的关键组成部分。
脂肪细胞是脂肪组织（AT）的主要细胞成分3。在肥胖条件下，脂肪组织增长的主要原因是细胞肥大，即脂肪细胞体积增大，这是由于细胞质中以脂滴（LDs）形式储存的脂肪量增加所致4。尽管肥胖是一种复杂的病理状态，但对脂肪细胞生物学功能的研究可作为分析其病因并探索新的治疗策略的模型。这凸显了深入理解驱动脂肪细胞功能改变的分子机制的重要性，以开发针对肥胖相关疾病的新治疗策略。
动物模型最接近反映生理条件，因此被广泛用于肥胖的体内研究5。然而，在这种多层次系统中，要得出关于细胞水平基本生物学过程的结论仍然极具挑战性，这促使人们更倾向于使用体外脂肪细胞模型。目前体外研究最....
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方案
在超净工作台中进行无菌操作，完成本方案的所有步骤。有关所有试剂和设备的详细信息，请参见材料表。下述分化方案适用于人脂肪来源的干细胞，不同细胞类型及其来源可能导致方案有所差异。所用试剂和设备均列于材料表中。
1. 分化用脂肪来源干细胞（ADSCs）的制备
- 配制脂肪源性间充质干细胞生长培养基（ADSCs GM）：在含1 g/L葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺以及抗生素-抗真菌溶液（100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B）。
- 将ADSCs生长培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）和胰蛋白酶/EDTA溶液预热至37 °C。
注意：ADSCs 从商业来源获得。使用早期传代的细胞。多次传代会导致 ADSCs 的分化潜能下降10. - 无菌条件下，从用于细胞培养的 T75 培养瓶中移除 ADSCs 生长培养基。
- 用5 mL PBS冲洗细胞培养皿，以洗去残留的ADSCs GM。
- 移除烧瓶中的全部PBS液体。
- 向培养皿中加入2 mL胰蛋白酶/EDTA，于37 °C孵育至细胞脱落。使用倒置显微镜监测此过程。
注意：轻敲培养皿可加速细胞脱落。
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结果
本文所述方法可将人源ADSCs诱导分化为成熟脂肪细胞，并促进脂质大量积累，从而模拟肥胖条件下所观察到的肥大细胞。人源ADSCs分化过程的时间线如图1所示。在第0天，当细胞达到100%汇合度时（图1A），ADSCs呈现细长的纺锤形形态。此时可加入含有脂肪诱导因子的分化培养基（DM）启动分化程序。24小时后，细胞开始发生形态学变化，可见单个细胞中出现少量小脂滴（图1B）。在第7天，应更换为新鲜分化培养基，此时可观察到细胞中含有多个小脂滴（图1C）。再经过7天培养，即细胞分化第14天时，可见脂肪细胞中已积累大量脂滴（图1D）。
为获得肥大性脂肪细胞，应在ADSC分化后立即应用所述的脂肪化方案。在添加脂肪酸（FAs）的脂肪细胞培养基中孵育期间，细胞会积累更多大型脂滴，可通过光学显微镜观察到（
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讨论
本方案是一种可重复的两步法，用于诱导ADSCs分化，随后与脂肪酸（FAs）共同孵育，以建立模拟肥胖的细胞模型。决定该方案有效性的关键步骤是ADSCs分离后的传代次数。多次传代会导致这些细胞的分化潜能下降10。
在脂肪细胞分化过程中，脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）从增殖状态转变为生长停滞的脂肪细胞。前脂肪细胞的生长停滞是启动分化诱导的前提步骤。12只有在生长停滞的细胞中（可通过100%汇合时的接触抑制实现），激素处理方案（胰岛素、吲哚美辛、地塞米松和IBMX）才能诱导脂肪细胞分化。IBMX与地塞米松联合使用可刺激PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）的表达，后者是脂肪生成的关键调控因子。13IBMX 是一种竞争性、非选择性的磷酸二酯酶抑制剂，可提高细胞内 cAMP 水平并激活蛋白激酶 A（PKA）。PKA 信号通路对于 PPARγ 的转录激活至关重要，从而进一步促进脂肪生成相关基因的表达。此外，地塞米松和 IBMX 均可诱导 C/EB.......
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披露
作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本文由波兰国家科学中心资助，资助项目包括多罗塔·诺瓦克（Dorota Nowak）获得的OPUS 22基金（编号：2021/43/B/NZ3/01458）以及亚历山德拉·希米奇耶夫（Aleksandra Simiczyjew）获得的SONATA基金（编号：2020/39/D/NZ5/02330）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX） | Merck | I5879 | |
| 0.25% 胰蛋白酶/0.05% EDTA，pH 7.2 | IITD PAN, Wroc aw, Poland | 20-500 | |
| 96孔板 | Thermo | 130188 | |
| 抗生素-抗真菌溶液 | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| 细胞计数仪 | N/A | N/A | |
| 离心机 | N/A | N/A | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| 杜氏改良伊格尔培养基（DMEM） | IITD PAN, Wrocaw, Poland | 10-500 | 含1 g/L葡萄糖 |
| 杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物F12 | Gibco | 11320-033 | |
| 乙醇 | Chempur | 113964200#1L | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | A5256701 | |
| 人脂肪来源干细胞（hADSC） | Lonza | PT-5006 | |
| 培养箱 | N/A | N/A | |
| 吲哚美辛 | Sigma-Aldrich | I8280-5G | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 倒置显微镜 | N/A | N/A | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | 25030-024 | |
| 亚油酸钠盐 | Sigma-Aldrich | L8134 | |
| LipidSpot 荧光染料 | Biotium | 70065 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Thermo | 10010023 | |
| 油酸钠 | Sigma-Aldrich | O7501 | |
| 棕榈酸钠 | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| T75细胞培养瓶 | Thermo | 130190 | |
| 台盼蓝 | Sigma-Aldrich | 95896HJ |
参考文献
- Lin, X., Li, H. Obesity: Epidemiology, pathophysiology, and therapeutics. Front Endocrinol. 12, 706978(2021).
- Wen, X., et al. Signaling pathways in obesity: Mechanisms and therapeutic interventions. Signal Transduct Target Ther. 7
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