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方法文章

人类脂肪细胞分化及脂滴蓄积诱导作为研究肥胖的模型 体外

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DOI：

10.3791/69759

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2026年3月20日

 ,  ,  , 
1Department of Cell Pathology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

本文内容

摘要

本方案旨在建立一种模拟人类肥胖的细胞模型。为此，将人脂肪来源的干细胞分化为脂肪细胞，随后使用特定脂肪酸混合物对这些细胞进行脂质积累处理。

摘要

与肥胖相关的脂肪组织变化会改变其局部分泌谱，并影响其与周围其他细胞（包括癌细胞）的相互作用。持续的营养供给改变了脂肪细胞的代谢，使其发挥脂质储存库的作用。通常，针对肥胖机制的研究依赖于动物模型，但这类模型无法实现对细胞水平代谢过程的分析。因此，有必要建立一种可靠的 体外 一种用于研究肥胖脂肪细胞与其瘦型对应细胞功能变化的人类肥胖模型。本文介绍了一种利用胰岛素、异丁基-1-甲基黄嘌呤、地塞米松和吲哚美辛混合物诱导人脂肪前体细胞（脂肪源性干细胞）向脂肪细胞分化的实验方案。随后，将已分化的脂肪细胞与一系列脂肪酸（包括亚油酸、棕榈酸和油酸）共同孵育，以促进脂质积聚。最终成功构建了一种模拟肥胖状态下脂肪细胞肥大的有效模型，可用于后续相关研究。

引言

肥胖被认为是多种疾病的主要风险因素，例如肌肉骨骼系统疾病、心血管疾病、胰岛素抵抗、代谢综合征、糖尿病以及某些类型的癌症1。肥胖是最明显却最被低估的公共卫生问题之一，其成因具有多因素性。简而言之，肥胖由能量摄入与消耗之间的失衡所引发，导致脂肪储存增加2。能量过剩会导致脂肪组织（adipose tissue, AT）发生病理性扩张和功能障碍，而脂肪组织是机体调控能量稳态的关键组成部分。

脂肪细胞是脂肪组织（AT）的主要细胞成分3。在肥胖条件下，脂肪组织增长的主要原因是细胞肥大，即脂肪细胞体积增大，这是由于细胞质中以脂滴（LDs）形式储存的脂肪量增加所致4。尽管肥胖是一种复杂的病理状态，但对脂肪细胞生物学功能的研究可作为分析其病因并探索新的治疗策略的模型。这凸显了深入理解驱动脂肪细胞功能改变的分子机制的重要性，以开发针对肥胖相关疾病的新治疗策略。

动物模型最接近反映生理条件，因此被广泛用于肥胖的体内研究5。然而，在这种多层次系统中，要得出关于细胞水平基本生物学过程的结论仍然极具挑战性，这促使人们更倾向于使用体外脂肪细胞模型。目前体外研究最常采用小鼠3T3-L1细胞模型，在适当条件下，该模型可获得类似脂肪细胞的表型6。然而，由于其来源限制，该模型无法用于更复杂的分析，例如与人类细胞的共培养条件，且研究结果并不总能直接外推至人类脂肪细胞。基于上述种种原因，人们一直在寻找能够模拟人类肥胖的模型，而采用人源脂肪组织来源的干细胞（ADSCs）并诱导其后续分化的方法显得尤为合理。因此，该模型因其复杂性较低，最适合用于体外研究人类脂肪细胞肥大。它允许在不同条件下对单一细胞培养类型的各种参数进行比较，而这一点在体内研究中由于脂肪组织内存在多种细胞类型而难以实现。

从脂肪组织（AT）中分离得到的人体前脂肪细胞和脂肪源性干细胞是研究该组织功能障碍最常见的模型6。这些细胞在分化后，可通过进一步脂肪化来调节脂滴（LD）水平，是一种理想的脂肪细胞模型。然而，目前针对人体细胞肥大的研究相对较少7,8,9，且大多数研究仅使用一种类型的脂肪酸（FA）来诱导脂滴积聚。

本方案建议使用脂肪酸混合物（棕榈酸、油酸和亚油酸）处理人脂肪细胞，以模拟肥胖环境。该方法可获得脂质过载的人脂肪细胞模型，并能与对照组（未经处理）的脂肪细胞进行直接比较。该模型可用于研究正常脂肪细胞与肥大脂肪细胞之间的表型和功能变化，或根据需要进一步开展共培养条件下的实验。

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方案

在超净工作台中进行无菌操作，完成本方案的所有步骤。有关所有试剂和设备的详细信息，请参见材料表。下述分化方案适用于人脂肪来源的干细胞，不同细胞类型及其来源可能导致方案有所差异。所用试剂和设备均列于材料表中。

1. 分化用脂肪来源干细胞（ADSCs）的制备

  1. 配制脂肪源性间充质干细胞生长培养基（ADSCs GM）：在含1 g/L葡萄糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺以及抗生素-抗真菌溶液（100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B）。
  2. 将ADSCs生长培养基、磷酸盐缓冲液（PBS）和胰蛋白酶/EDTA溶液预热至37 °C。
    注意：ADSCs 从商业来源获得。使用早期传代的细胞。多次传代会导致 ADSCs 的分化潜能下降10.
  3. 无菌条件下，从用于细胞培养的 T75 培养瓶中移除 ADSCs 生长培养基。
  4. 用5 mL PBS冲洗细胞培养皿，以洗去残留的ADSCs GM。
  5. 移除烧瓶中的全部PBS液体。
  6. 向培养皿中加入2 mL胰蛋白酶/EDTA，于37 °C孵育至细胞脱落。使用倒置显微镜监测此过程。
    注意：轻敲培养皿可加速细胞脱落。
  7. 通过加入6 mL新鲜的ADSCs生长培养基（GM）来抑制胰蛋白酶活性。
  8. 将培养皿中的全部细胞悬液转移至适合离心的试管中。
  9. 以 300 x g 离心细胞 g 室温（RT）下孵育5分钟。
  10. 移除上清液。
  11. 将细胞重悬于 2 mL 新加入的 ADSCs GM 中。
  12. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计算细胞密度和细胞活力。
    注意：可使用台盼蓝染色法评估细胞活力。
  13. 将细胞以每孔15,000个细胞的数量接种至96孔塑料培养板中，每孔加入100 µL ADSCs生长培养基，根据实验需求确定接种孔数。
    注意：种子细胞需始终设置重复孔，以获得用于对照和脂肪酸（FAs）孵育条件的脂肪细胞。根据实验类型的不同，ADSCs 可接种于不同类型的塑料培养板或培养皿中。推荐接种密度为每平方厘米 30,000–60,000 个细胞2根据后续分析或下游实验所需的细胞数量，调整细胞培养皿的规格，使用6孔或12孔板。
  14. 在37 °C、含5% CO₂的湿润环境中培养细胞2.
  15. 当细胞达到100%融合度（通常在接种后24–48小时），按照以下说明诱导其向脂肪细胞分化。
    注意：在诱导分化前，必须达到较高的细胞汇合度。否则，可能影响分化效率。如果贴壁细胞需要超过48小时才能达到高汇合度，则每3-4天更换一次新鲜的ADSC生长培养基。

2. 诱导脂肪向分化

  1. 配制分化培养基（DM）：在DMEM/F12培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺、抗生素-抗真菌素溶液（100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B）、5 µg/mL胰岛素、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）、5 µM地塞米松和200 µM吲哚美辛。
    注意：仅根据实际需要量配制DM，不要长期储存，务必使用新鲜配制的DM。使用前将DM在37 °C水浴中预热。若IBMX和吲哚美辛在低于37 °C的温度下加入培养基，可能会发生沉淀；如出现沉淀，可将液体在37 °C水浴中加热以重新溶解。
  2. 无菌操作吸除并弃去融合生长的ADSCs中的全部培养基。
    注意：在加入DM前，必须彻底去除ADSCs的生长培养基。
  3. 向96孔板中生长的细胞小心加入100 µL/孔的DM。
    注意：换液过程中避免细胞干燥。
  4. 将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养7天。
  5. 吸除并弃去ADSCs中的全部DM。
  6. 向96孔板中生长的细胞小心加入100 µL/孔的新鲜DM。
  7. 将细胞继续在37 °C、5% CO2的培养箱中培养7天。
    注意：可通过明场显微镜观察诱导细胞中脂滴的形成情况，以监测成脂分化的进展。

3. 脂肪细胞的脂质积累

  1. 制备添加脂肪酸（FAs）的脂肪细胞培养基：在DMEM/F12培养基中添加10% 胎牛血清（FBS）、2 mM 谷氨酰胺、抗生素-抗真菌素溶液（100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、0.25 µg/mL 两性霉素B）、0.33 mM 亚油酸、0.17 mM 棕榈酸和0.17 mM 油酸。
  2. 制备对照脂肪细胞培养基：在DMEM/F12培养基中添加10% 胎牛血清（FBS）、2 mM 谷氨酰胺、抗生素-抗真菌素溶液（100 U/mL 青霉素、100 µg/mL 链霉素、0.25 µg/mL 两性霉素B）、0.44% 牛血清白蛋白（BSA）和0.26% 乙醇（后两种化合物也用作脂肪酸的溶剂）。
    注意：仅根据直接使用所需量制备对照组和添加脂肪酸的脂肪细胞培养基。请勿长期储存，务必使用新鲜配制的培养基。使用前在37 °C水浴中预热培养基。
  3. 完成总共14天的分化后，小心移除并弃去96孔板上已分化脂肪细胞中的全部DM培养基体积。
  4. 小心向96孔板中一半的细胞孔每孔加入100 µL添加脂肪酸的脂肪细胞培养基。
  5. 小心向96孔板中另一半的细胞孔每孔加入100 µL对照脂肪细胞培养基。
    注意：更换培养基时切勿使细胞干燥。
  6. 将细胞置于含5% CO2的湿润环境中，于37 °C孵育48小时。
  7. 48小时后，使用对照组细胞及经脂肪酸孵育的细胞进行后续实验。
    注意：在此阶段，已获得的脂肪化脂肪细胞可用于多种实验目的，如细胞染色、细胞代谢分析或其他细胞类型的共培养。

4. 脂滴染色

  1. 配制脂肪细胞培养基：在DMEM/F12培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺以及抗生素-抗真菌溶液（100 U/mL青霉素、100 µg/mL链霉素、0.25 µg/mL两性霉素B）。
  2. 将用于染色脂肪细胞中脂滴（LDs）的荧光染料按1:1000比例稀释于脂肪细胞培养基中。
  3. 移除并弃去96孔板中生长的细胞所含的对照组脂肪细胞培养基以及添加了脂肪酸（FAs）的脂肪细胞培养基的全部体积。
  4. 每孔小心加入50 µL含荧光染料的脂肪细胞培养基。
    注意：换液过程中切勿使细胞干燥。
  5. 将细胞置于含5% CO2的湿润环境中，37 °C孵育15分钟。
  6. 用每孔100 µL的脂肪细胞培养基替换原有液体，以洗去荧光染料。
  7. 使用荧光显微镜在绿色荧光检测通道（激发波长427 nm/发射波长585 nm）下进行成像。
    注意：本方案适用于活细胞染色。染色也可在细胞经甲醛固定后进行。

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结果

本文所述方法可将人源ADSCs诱导分化为成熟脂肪细胞，并促进脂质大量积累，从而模拟肥胖条件下所观察到的肥大细胞。人源ADSCs分化过程的时间线如图1所示。在第0天，当细胞达到100%汇合度时（图1A），ADSCs呈现细长的纺锤形形态。此时可加入含有脂肪诱导因子的分化培养基（DM）启动分化程序。24小时后，细胞开始发生形态学变化，可见单个细胞中出现少量小脂滴（图1B）。在第7天，应更换为新鲜分化培养基，此时可观察到细胞中含有多个小脂滴（图1C）。再经过7天培养，即细胞分化第14天时，可见脂肪细胞中已积累大量脂滴（图1D）。

为获得肥大性脂肪细胞，应在ADSC分化后立即应用所述的脂肪化方案。在添加脂肪酸（FAs）的脂肪细胞培养基中孵育期间，细胞会积累更多大型脂滴，可通过光学显微镜观察到（

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讨论

本方案是一种可重复的两步法，用于诱导ADSCs分化，随后与脂肪酸（FAs）共同孵育，以建立模拟肥胖的细胞模型。决定该方案有效性的关键步骤是ADSCs分离后的传代次数。多次传代会导致这些细胞的分化潜能下降10。

在脂肪细胞分化过程中，脂肪源性间充质干细胞（ADSCs）从增殖状态转变为生长停滞的脂肪细胞。前脂肪细胞的生长停滞是启动分化诱导的前提步骤。12只有在生长停滞的细胞中（可通过100%汇合时的接触抑制实现），激素处理方案（胰岛素、吲哚美辛、地塞米松和IBMX）才能诱导脂肪细胞分化。IBMX与地塞米松联合使用可刺激PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）的表达，后者是脂肪生成的关键调控因子。13IBMX 是一种竞争性、非选择性的磷酸二酯酶抑制剂，可提高细胞内 cAMP 水平并激活蛋白激酶 A（PKA）。PKA 信号通路对于 PPARγ 的转录激活至关重要，从而进一步促进脂肪生成相关基因的表达。此外，地塞米松和 IBMX 均可诱导 C/EB...

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披露

作者声明，他们不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本文由波兰国家科学中心资助，资助项目包括多罗塔·诺瓦克（Dorota Nowak）获得的OPUS 22基金（编号：2021/43/B/NZ3/01458）以及亚历山德拉·希米奇耶夫（Aleksandra Simiczyjew）获得的SONATA基金（编号：2020/39/D/NZ5/02330）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）MerckI5879
0.25% 胰蛋白酶/0.05% EDTA，pH 7.2IITD PAN, Wrocfigure-materials-1aw, Poland20-500
96孔板Thermo130188
抗生素-抗真菌溶液Sigma-AldrichA5955
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA3294
细胞计数仪N/AN/A
离心机N/AN/A
地塞米松Sigma-AldrichD4902
杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）IITD PAN, Wrocfigure-materials-2aw, Poland10-500含1 g/L葡萄糖
杜氏改良伊格尔培养基：营养混合物F12Gibco11320-033
乙醇Chempur113964200#1L
胎牛血清（FBS）GibcoA5256701
人脂肪来源干细胞（hADSC）LonzaPT-5006
培养箱N/AN/A
吲哚美辛Sigma-AldrichI8280-5G
胰岛素Sigma-AldrichI9278
倒置显微镜N/AN/A
L-谷氨酰胺Sigma-Aldrich25030-024
亚油酸钠盐Sigma-AldrichL8134
LipidSpot 荧光染料Biotium70065
磷酸盐缓冲液（PBS）Thermo10010023
油酸钠Sigma-AldrichO7501
棕榈酸钠Sigma-AldrichP9767
T75细胞培养瓶Thermo130190
台盼蓝Sigma-Aldrich95896HJ

参考文献

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