脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）与较高的病死率相关。本研究发现，在脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（SA-AKI 体外模型）中，circZBTB46 表达下调。过表达 circZBTB46 可提高 HUVEC 的存活率，减少细胞凋亡、炎症反应和氧化应激，其作用与 ERBB2/AKT 信号通路相关，提示其可能是 SA-AKI 的潜在治疗靶点。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）与较高的病死率相关。本研究发现，在脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（SA-AKI 体外模型）中，circZBTB46 表达下调。过表达 circZBTB46 可提高 HUVEC 的存活率，减少细胞凋亡、炎症反应和氧化应激，其作用与 ERBB2/AKT 信号通路相关，提示其可能是 SA-AKI 的潜在治疗靶点。
环状 RNA 是应激反应的新兴调控因子，但其在导致脓毒症相关急性肾损伤的内皮损伤中的作用仍不完全明确。我们假设环状 RNA ZBTB46（circZBTB46）通过激活 ERBB2-AKT 信号通路发挥内皮保护作用。在人脐静脉内皮细胞经脂多糖刺激的细胞模型中，我们定量分析了circZBTB46的表达水平，并检测了其过表达对细胞存活、凋亡、炎症介质及氧化还原稳态的影响。通过细胞活力检测和流式细胞术评估细胞存活与凋亡情况。采用酶联免疫吸附试验测定白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α 和白细胞介素-1β 的水平，同时检测活性氧、丙二醛、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，以评估氧化损伤程度及抗氧化能力。为阐明其作用机制，我们进行了转录组测序及基因集富集分析，通过 Western 印迹验证通路相关蛋白，并使用 ERBB2 抑制剂 AG-825 验证其必要性。脂多糖可抑制circZBTB46的表达。circZBTB46过表达可提高细胞活力，降低细胞凋亡率，减少促炎性细胞因子和活性氧的产生，降低丙二醛水平，并增强超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性。转录组和蛋白分析结果均支持 ERBB2-AKT 信号轴的激活，而药理学抑制 ERBB2 可削弱细胞保护作用，并逆转氧化还原平衡的改善。这些研究结果表明，circZBTB46可通过 ERBB2-AKT 信号通路内源性抑制脂多糖诱导的内皮损伤，并提示circZBTB46是脓毒症相关急性肾损伤的潜在机制节点和治疗靶点。
脓毒症是由病原体侵入引发的危及生命的全身性炎症级联反应，常导致多器官功能衰竭1在此关键背景下，脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）已成为重症监护病房中一种主要且具有重要临床意义的并发症2以肾滤过功能急剧恶化为特征，并伴随全身性感染，该状况在临床队列中的死亡率较非脓毒症急性肾损伤高出38%–42%2约60%被诊断为脓毒症或感染性休克的患者预计将发生脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）3因此，脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）已成为重症监护中的重大挑战，显著增加了发病率和死亡率4目前，脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）的机制尚未完全阐明。尽管前期临床前研究已涉及微循环功能障碍、细胞代谢改变、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）失衡、线粒体功能障碍以及炎症调节紊乱等因素，但SA-AKI的病理生理机制仍不明确，且目前尚缺乏支持早期诊断和持续管理的最佳措施5,6,7,8SA-AKI 的特征是细胞凋亡增加、氧化应激过度以及炎症反应9在此研究框架中，脂多糖（LPS）被用于一项实验 体外 用于在人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中模拟脓毒症相关急性肾损伤的表现，以进行初步靶点探索5.
近年来，环状RNA（circRNA）作为一类新近发现的非编码RNA分子，因其在多种疾病中的作用而受到越来越多的关注10。circRNA具有稳定的环状结构，可通过充当微小RNA（miRNA）的分子海绵、调控基因转录或参与蛋白质相互作用，在细胞生理和病理过程中发挥功能11。研究表明，circRNA在调控炎症、氧化应激和凋亡通路中具有关键作用，因此其在脓毒症及其相关疾病（包括急性肾损伤）中的潜在作用引起了更多研究关注12。例如，hsa_circ_0072463已被鉴定为SA-AKI有前景的诊断标志物和治疗靶点13。circ_001653被报道可通过招募BUD13缓解SA-AKI14。然而，circRNA在SA-AKI中的功能意义仍 largely 未被探索。
本研究旨在考察以下因素的影响： circZBTB46 内皮细胞功能、氧化应激和炎症反应的研究使用一种 体外 SA-AKI 系统。通过构建脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）模型，我们研究了内毒素刺激下的内皮细胞损伤。需要注意的是，LPS刺激的HUVECs代表了一种简化的、由内毒素/TLR4驱动的内皮应激模型，该模型与脓毒症相关急性肾损伤的多因素病理生理过程相关，但并不等同于后者。该模型主要捕捉TLR4介导的炎症激活、氧化应激以及与细胞凋亡相关的内皮反应，而忽略了关键的 体内 血流动力学改变、补体与凝血级联反应、损伤相关分子模式以及异质性微生物刺激等组分。在此实验框架下，我们探究了是否 circZBTB46 通过调节ERBB2信号通路，缓解脂多糖（LPS）诱导的氧化应激和细胞凋亡，从而保护内皮细胞功能。据我们所知，本研究首次提供了将 circZBTB46 在脓毒症相关急性肾损伤背景下对内皮细胞应激反应的研究。通过阐明其潜在的分子机制 circZBTB46介导的内皮保护作用，本研究可能加深对脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）致病机制的理解，并为以环状RNA为核心的创新治疗策略奠定基础。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本方案描述了用于研究circZBTB46调控对HUVECs中炎症信号、氧化应激以及ERBB2-AKT通路激活影响的实验步骤。
细胞培养
本研究中使用的 HUVECs 细胞购自商业来源。由于 HUVECs 来源广泛、培养条件可重复且转染效率高，因此被用作典型的内皮细胞模型，有助于在炎症应激条件下对内皮信号通路进行基因操作和机制研究15,16。HUVECs 在添加了10%（v/v）胎牛血清和1%抗生素-抗真菌混合液的 DMEM 培养基中培养。所有细胞培养均在标准生理条件下、于加湿培养箱（37 °C，5% CO2）中进行，以维持持续的细胞增殖，并通过台盼蓝排斥实验确认细胞存活率保持在>95%。尽管内皮细胞专用培养基（如添加内皮细胞生长补充物的 EGM-2 或 M199）通常推荐用于 HUVECs 的长期维持，但本研究采用 DMEM 以确保不同实验处理之间的一致性，并保证与 LPS 刺激及药理学抑制剂检测的兼容性。在 AG-825 抑制剂检测中，先将 HUVECs 与含有 10 µM AG-825 的新鲜 DMEM 培养基孵育 1 小时，随后向孔板中加入 LPS 溶液，使其终浓度为 10 µg/mL，并继续培养 24 小时。为尽量减少潜在的表型漂移，HUVECs 仅在低代次使用，并且仅在短期检测中暴露于基于 DMEM 的实验条件。所有功能性实验均在明确规定的处理时间窗内完成，而非在长期培养过程中进行。
细胞转染
为了阐明circZBTB46的生物学功能，由GenScript合成并验证了过表达质粒（oe-circZBTB46）及相应的阴性对照质粒（oe-NC）。将HUVECs以每孔1 × 10⁵个细胞的密度接种于6孔板中，过夜培养，使转染时细胞融合度达到约70%–80%。每孔中，将2.5 µg质粒DNA（oe-circZBTB46或oe-NC）溶于125 µL低血清培养基中，并与2.5 µL P3000试剂混合（A管）；同时，将3.75 µL Lipofectamine 3000溶于125 µL低血清培养基中（B管）。随后将A管与B管混合，轻轻混匀，在室温下孵育15–20分钟以形成转染复合物（最终每孔复合物体积为250 µL）。将复合物逐滴加入无抗生素的完全培养基中的细胞中。在37 °C、5% CO2条件下孵育6小时后，更换为新鲜的完全生长培养基。转染后继续培养48小时，再进行后续实验。所有操作均按照制造商的说明书进行。
LPS诱导模型
生成一个 体外 SA-AKI 模型，HUVECs（5 × 105 细胞/孔）转染 oe-circZBTB46 将细胞或NC接种于96孔板中，培养24小时至融合度达到80%。随后，用10 µg/mL LPS处理细胞24小时。未用LPS处理的HUVECs作为对照组。
qRT-PCR
采用商用试剂从HUVECs中提取总RNA。使用商用试剂盒进行逆转录以合成cDNA。定量PCR（qPCR）在实时PCR系统上使用预混液进行，每个样本设三个重复。目的基因的表达量以 U6，通过2进行分析−ΔΔCT 方法17,18用于环状RNA表达分析， U6 小核RNA用作标准化的内参，因其常用于小非编码RNA的定量，且已有报道表明其在短期过程中表达相对稳定 体外 实验条件。本研究中使用的引物序列如下所示：
circZBTB46-正向引物：5'-CGGCGCTCATGAGTAAGAAC-3'
circZBTB46-反向：5'-CGCCTCTTCTACAGACTGGG-3'
U6-上游引物：5'-TGCTATCACTTCAGCAGCA-3'
U6-反向：5'-GAGGTCATGCTAATCTTCTCTG-3'。
CCK-8 检测
采用市售的 CCK-8 试剂检测 HUVECs 的细胞活力。简言之，将细胞接种于 96 孔板中，贴壁培养 24 小时。随后，每孔加入 10 µL CCK-8 溶液，在 37 °C 下继续孵育 2 小时。使用酶标仪在 450 nm 波长下测定光密度（OD）。初步观察结果显示，10 µg/mL 的 LPS 显著降低了 HUVECs 的细胞活力，因此选择该浓度用于后续实验。
流式细胞术
首先，按照标准操作用无EDTA的胰蛋白酶消化并分离HUVECs细胞。根据Annexin V-APC/PI细胞凋亡检测试剂盒的制造商说明，在酶消化后，细胞悬液于4 °C条件下以1,000 × g 离心5分钟。将沉淀的细胞在相同条件下用预冷的PBS洗涤两次，随后重悬于100 µL的1×结合缓冲液中。每个样品分别加入5 µL Annexin V-FITC偶联物和5 µL碘化丙啶（PI）染色液，室温（20–25 °C）避光孵育10分钟。最后，向所有样品中加入400 µL的1×结合缓冲液，并在1小时内使用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。首先根据FSC/SSC设门以排除碎片。在进行细胞凋亡分析时，利用未染色及单染色/补偿对照样品，在Annexin V-FITC vs PI散点图上设定象限门，以区分活细胞（Annexin V−/PI−）、早期凋亡细胞（Annexin V+/PI−）、晚期凋亡细胞（Annexin V+/PI+）和坏死细胞（Annexin V−/PI+）群体。所有样品均采用相同的设门模板和阈值进行分析。
ELISA 检测
采用市售 ELISA 试剂盒检测培养的 HUVEC 上清液中炎症因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的浓度。具体使用人 TNF-α ELISA 试剂盒、人 IL-6 ELISA 试剂盒和人 IL-1β ELISA 试剂盒，操作严格按照制造商说明书进行。每次检测每孔加入 50 µL 未稀释的细胞培养上清液。标准曲线使用试剂盒提供的系列稀释液建立（TNF-α：0–1000 pg/mL；IL-6：0–500 pg/mL；IL-1β：0–200 pg/mL）。加入样本和标准品后，酶标板在 37 °C 孵育 90 分钟，随后用洗涤缓冲液洗涤 5 次。加入生物素标记的检测抗体，在 37 °C 孵育 60 分钟。再次洗涤后，加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP），在 37 °C 孵育 30 分钟。最后一次洗涤后，加入 3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）底物，在 37 °C 避光孵育 15 分钟。反应通过终止液终止，并立即在 450 nm 波长处测定吸光度，参考波长为 630 nm。每个样本和标准品均设复孔检测，所有实验均包含三次独立的生物学重复。上清液中氧化应激标志物丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）的水平分别采用 MDA ELISA 试剂盒、SOD ELISA 试剂盒和 CAT ELISA 试剂盒，按照所提供的操作流程进行检测19,20,21。MDA 和 SOD 检测每孔使用 40 µL 未稀释上清液；CAT 检测则在加样前用检测缓冲液将样本稀释 1:10。标准曲线根据试剂盒说明配制（MDA：0–60 nmol/mL；SOD：0–100 U/mL；CAT：0–100 U/mL）。孵育步骤如下：MDA 在 37 °C 孵育 60 分钟；SOD 在 37 °C 孵育 60 分钟；CAT 在 37 °C 孵育 30 分钟。关键孵育步骤之间均用洗涤缓冲液洗涤 4 次。显色通过加入相应底物并在 37 °C 孵育实现（MDA：15 分钟；SOD：20 分钟；CAT：15 分钟）。SOD 和 CAT 在 450 nm 处读取吸光度，MDA 在 532 nm 处读取。所有测定均在复孔中进行，并在三次独立的生物学重复中重复实验。
RNA测序
根据制造商说明书，使用商业试剂从HUVECs中提取总RNA。采用分光光度计通过测定260 nm和280 nm处的吸光度（A260/A280）评估RNA纯度和浓度，并使用Bioanalyzer评估RNA完整性。仅使用RNA完整性数值（RIN）≥ 7的RNA样本进行后续文库构建。在文库制备过程中，由商业公司采用标准rRNA去除流程去除核糖体RNA。如需，于文库构建前进行RNase R处理，以选择性消化线性RNA并富集环状RNA。随后，在升高温度条件下，依照RNA文库制备试剂盒说明书中的标准流程进行RNA片段化，以生成合适大小的RNA片段。根据制造商说明书，使用RNA文库制备试剂盒构建测序文库，并在Illumina测序平台上采用双端150 bp（PE150）测序策略进行测序。测序深度足以支持全转录组分析。原始测序读段经标准质量控制流程处理，以去除接头序列和低质量读段。将高质量读段比对至人类参考基因组，并据此定量基因表达水平22,23。在LPS刺激条件下，采用已建立的统计学方法鉴定circZBTB46过表达HUVECs与NC处理HUVECs之间的差异表达基因（DEGs）。通过基因集富集分析（GSEA）鉴定与circZBTB46过表达相关的信号通路。根据实验组间的差异表达对基因进行排序，并使用分子特征数据库（MSigDB）中的精选基因集进行富集分析。富集显著性基于标准化富集评分（NES）和错误发现率（FDR）进行评估，FDR < 0.25被视为具有统计学显著性。环状RNA测序及所有相关生物信息学分析均外包完成。
差异表达基因的鉴定
为了筛选差异表达基因（DEGs），使用 DESeq (2012) R 软件包对两个不同组别之间的表达水平进行比较。统计学显著性的阈值定义为 p < 0.05，且 |log2FC| 值大于 0.58。热图由 pheatmap R 软件包生成，火山图则使用 Goplot2 R 软件包绘制。
功能富集分析
基于线性转录本的GO和KEGG富集分析通过在线平台EnrichR进行，气泡图根据GOplot R软件包绘制。采用GSEA软件，基于MSigDB数据库提供的表达矩阵和基因集文件，并设置分析参数（如置换次数和统计方法）。通过标准化富集评分（NES）、P值和FDR值评估基因集的富集情况，从而深入探究差异表达基因的功能及潜在生物学机制。
Western blot
使用含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解缓冲液从 HUVECs（约 1 × 10⁶ 个细胞）中提取总蛋白。采用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白（每道 20 µg）在 10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上以 80 V 电泳 30 分钟，随后以 120 V 电泳 60 分钟进行分离。接着，在 4 °C 条件下，使用湿转系统以 100 V 将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，持续 90 分钟。PVDF 膜用含 5% 脱脂奶粉的含 0.1% Tween-20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）在室温下封闭 1 小时，然后在相同的封闭缓冲液中加入一抗（目标蛋白通常按 1:1000 稀释，GAPDH 按 1:5000 稀释），于 4 °C 孵育过夜。所用一抗包括：ERBB2、p-AKT、AKT 和 GAPDH。孵育后，膜用 TBST 洗涤 3 次，每次 10 分钟，随后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔 IgG 二抗（按 1:5000 用封闭缓冲液稀释），室温孵育 1 小时。再经 TBST 洗涤 3 次（每次 10 分钟）后，使用增强化学发光（ECL）Western Blot 显色试剂盒显影，并用成像系统采集图像。使用软件对条带信号强度进行定量分析。
统计学分析
统计学评估使用 GraphPad Prism 10 进行。数据以均值 ± 均值标准误（SEMs）表示。定义 p 值 < 0.05 为具有统计学显著性。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
qRT-PCR 分析 circZBTB46 表达在一个 体外 SA-AKI 模型
本组实验旨在验证以下假设： circZBTB46 在LPS刺激下表达发生改变，且对表达的调控 circZBTB46 影响内皮细胞活力和凋亡 体外 SA-AKI 模型。最初， circZBTB46 在对照条件下及在一种 体外 SA-AKI 系统。如图所示 图1A, circZBTB46 在LPS处理的HUVECs中，表达显著低于未处理的对照细胞。该结果表明，表达的 circZBTB46 在LPS处理下受到抑制。下一步， circZBTB46 在HUVECs中成功过表达，以供进一步研究（图1B
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
在脓毒症期间，病原体释放的病原体相关分子模式（PAMPs），例如脂多糖（LPS），可激活Toll样受体（如TLR4），从而启动全身性炎症反应26。该过程触发多种促炎介质的分泌，如TNF-α、IL-6和IL-1β，导致细胞因子风暴27。同时，LPS可直接损伤血管内皮细胞，引起微循环障碍、血管通透性增加以及血栓形成，最终损害肾脏血流27。此外，LPS诱导的氧化应激产生过量活性氧（ROS），进一步损伤肾小管上皮细胞和内皮细胞，并通过线粒体依赖性途径促进细胞凋亡4。这些过程共同导致肾小管功能障碍、肾小球滤过率下降，最终引发急性肾损伤9。因此，脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）的核心机制涉及炎症反应、内皮功能障碍、氧化应激和细胞凋亡之间的复杂相互作用。
既往研究表明，环状RNA（circRNA）在多种疾病的发病机制中发挥关键的调控作用
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
作者声明无竞争利益。作者声明，本论文中所呈现的主要结果此前均未发表，也未在其他地方考虑发表。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AG-825（ErbB2 抑制剂） | MedChemExpress | HY-10197 | 10 μM 用于通路阻断 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | RNA 完整性（RIN≥7） |
| AKT 抗体 | Proteintech | 60203-2-Ig | WB（1:15000） |
| Annexin V-APC/PI 凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A327 | 细胞凋亡检测 |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240062 | 1% 浓度 |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 | 蛋白浓度测定 |
| CAT ELISA 试剂盒 | MEIMIAN | MM-0897H2 | 抗氧化酶检测 |
| CCK-8 试剂盒 | Dojindo | CK04 | 细胞活力检测 |
| 环状 RNA 测序（circRNA seq） | 福州华荣科汇生物科技有限公司 | PE150 | 环状 RNA 测序及所有相关生物信息学分析 |
| CytoFLEX 流式细胞仪 | Beckman Coulter | B53000 | 细胞凋亡分析 |
| DMEM | Gibco (Invitrogen) | 11965092 | 细胞培养基 |
| ECL 底物试剂盒 | Millipore | WBKLS0100 | 蛋白检测 |
| ERBB2 抗体 | Sino Biological | 100271-T32 | WB（1:10000） |
| 胎牛血清（FBS） | Biological Industries | 04-001-1ACS | 10%（v/v）添加物 |
| GAPDH 抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | WB（1:50000） |
| HUVECs | Procell system | CP-H082 | 细胞系来源 |
| IL-1β ELISA 试剂盒 | MEIMIAN | MM-0181H2 | 炎症因子检测 |
| IL-6 ELISA 试剂盒 | MEIMIAN | MM-0049H2 | 炎症因子检测 |
| Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | 20012850 | RNA 测序 |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | 转染试剂 |
| LPS（E. coli O111:B4） | Sigma-Aldrich | L2630 | 10 μg/mL 用于 SA-AKI 模型 |
| MDA ELISA 试剂盒 | MEIMIAN | MM-2037H2 | 氧化应激标志物检测 |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | ND-2000 | RNA 定量 |
| NEBNext Ultra II RNA 文库构建试剂盒 | NEB | E7770S | RNA-seq 文库制备 |
| oe-circZBTB46 质粒 | GenScript | 定制合成 | circZBTB46 过表达载体 |
| oe-NC 质粒 | GenScript | 定制合成 | 阴性对照载体 |
| p-AKT（Ser473）抗体 | Proteintech | 66444-1-Ig | WB（1:1200） |
| PrimeScript RT 试剂盒 | Takara | RR047A | cDNA 合成 |
| PVDF 膜 | Millipore | IPVH00010 | Western blot 转膜 |
| QuantStudio 5 系统 | Thermo Fisher | A28137 | 实时 PCR |
| 核糖核酸酶 R | Lucigen | RNR07250 | rRNA 去除 |
| RIPA 裂解缓冲液 | Beyotime | P0013B | 蛋白提取 |
| RNAiso Plus | Takara | 9109 | 总 RNA 提取 |
| SOD ELISA 试剂盒 | MEIMIAN | MM-25469H2 | 抗氧化酶检测 |
| TB Green Premix Ex Taq | Takara | RR420A | qPCR 试剂 |
| TNF-α ELISA 试剂盒 | MEIMIAN | MM-0122H2 | 炎症因子检测 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。