脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）与较高的病死率相关。本研究发现，在脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（SA-AKI 体外模型）中，circZBTB46 表达下调。过表达 circZBTB46 可提高 HUVEC 的存活率，减少细胞凋亡、炎症反应和氧化应激，其作用与 ERBB2/AKT 信号通路相关，提示其可能是 SA-AKI 的潜在治疗靶点。
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脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）与较高的病死率相关。本研究发现，在脂多糖（LPS）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）（SA-AKI 体外模型）中，circZBTB46 表达下调。过表达 circZBTB46 可提高 HUVEC 的存活率，减少细胞凋亡、炎症反应和氧化应激，其作用与 ERBB2/AKT 信号通路相关，提示其可能是 SA-AKI 的潜在治疗靶点。
环状 RNA 是应激反应的新兴调控因子，但其在导致脓毒症相关急性肾损伤的内皮损伤中的作用仍不完全明确。我们假设环状 RNA ZBTB46（circZBTB46）通过激活 ERBB2-AKT 信号通路发挥内皮保护作用。在人脐静脉内皮细胞经脂多糖刺激的细胞模型中，我们定量分析了circZBTB46的表达水平，并检测了其过表达对细胞存活、凋亡、炎症介质及氧化还原稳态的影响。通过细胞活力检测和流式细胞术评估细胞存活与凋亡情况。采用酶联免疫吸附试验测定白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α 和白细胞介素-1β 的水平，同时检测活性氧、丙二醛、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，以评估氧化损伤程度及抗氧化能力。为阐明其作用机制，我们进行了转录组测序及基因集富集分析，通过 Western 印迹验证通路相关蛋白，并使用 ERBB2 抑制剂 AG-825 验证其必要性。脂多糖可抑制circZBTB46的表达。circZBTB46过表达可提高细胞活力，降低细胞凋亡率，减少促炎性细胞因子和活性氧的产生，降低丙二醛水平，并增强超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性。转录组和蛋白分析结果均支持 ERBB2-AKT 信号轴的激活，而药理学抑制 ERBB2 可削弱细胞保护作用，并逆转氧化还原平衡的改善。这些研究结果表明，circZBTB46可通过 ERBB2-AKT 信号通路内源性抑制脂多糖诱导的内皮损伤，并提示circZBTB46是脓毒症相关急性肾损伤的潜在机制节点和治疗靶点。
脓毒症是由病原体侵入引发的危及生命的全身性炎症级联反应，常导致多器官功能衰竭1在此关键背景下，脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）已成为重症监护病房中一种主要且具有重要临床意义的并发症2以肾滤过功能急剧恶化为特征，并伴随全身性感染，该状况在临床队列中的死亡率较非脓毒症急性肾损伤高出38%–42%2约60%被诊断为脓毒症或感染性休克的患者预计将发生脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）3因此，脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）已成为重症监护中的重大挑战，显著增加了发病率和死亡率4目前，脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）的机制尚未完全阐明。尽管前期临床前研究已涉及微循环功能障碍、细胞代谢改变、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）失衡、线粒体功能障碍以及炎症调节紊乱等因素，但SA-AKI的病理生理机制仍不明确，且目前尚缺乏支持早期诊断和持续管理的最佳措施5,6,7,8SA-AKI 的特征是细胞凋亡增加、氧化应激过度以及炎症反应
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本方案描述了用于研究circZBTB46调控对HUVECs中炎症信号、氧化应激以及ERBB2-AKT通路激活影响的实验步骤。
细胞培养
本研究中使用的 HUVECs 细胞购自商业来源。由于 HUVECs 来源广泛、培养条件可重复且转染效率高，因此被用作典型的内皮细胞模型，有助于在炎症应激条件下对内皮信号通路进行基因操作和机制研究15,16。HUVECs 在添加了10%（v/v）胎牛血清和1%抗生素-抗真菌混合液的 DMEM 培养基中培养。所有细胞培养均在标准生理条件下、于加湿培养箱（37 °C，5% CO2）中进行，以维持持续的细胞增殖，并通过台盼蓝排斥实验确认细胞存活率保持在>95%。尽管内皮细胞专用培养基（如添加内皮细胞生长补充物的 EGM-2 或 M199）通常推荐用于 HUVECs 的长期维持，但本研究采用 DMEM 以确保不同实验处理之间的一致性，并保证与 LPS 刺激及药理学抑制剂检测的兼容性。在 AG-825 抑制剂检测中，先将 HUVECs 与含有 10 µM AG-825 的新鲜 DMEM 培养基孵育 1 小时，随后向孔板中加入 LPS 溶液，使其终浓度为 10 µg/mL，并继续培养 24 小时。为尽量减少潜在的表型漂移，HUVECs 仅在低代次使....
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qRT-PCR 分析 circZBTB46 表达在一个 体外 SA-AKI 模型
本组实验旨在验证以下假设： circZBTB46 在LPS刺激下表达发生改变，且对表达的调控 circZBTB46 影响内皮细胞活力和凋亡 体外 SA-AKI 模型。最初， circZBTB46 在对照条件下及在一种 体外 SA-AKI 系统。如图所示 图1A, circZBTB46 在LPS处理的HUVECs中，表达显著低于未处理的对照细胞。该结果表明，表达的 circZBTB46 在LPS处理下受到抑制。下一步， circZBTB46 在HUVECs中成功过表达，以供进一步研究（图1B
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在脓毒症期间，病原体释放的病原体相关分子模式（PAMPs），例如脂多糖（LPS），可激活Toll样受体（如TLR4），从而启动全身性炎症反应26。该过程触发多种促炎介质的分泌，如TNF-α、IL-6和IL-1β，导致细胞因子风暴27。同时，LPS可直接损伤血管内皮细胞，引起微循环障碍、血管通透性增加以及血栓形成，最终损害肾脏血流27。此外，LPS诱导的氧化应激产生过量活性氧（ROS），进一步损伤肾小管上皮细胞和内皮细胞，并通过线粒体依赖性途径促进细胞凋亡4。这些过程共同导致肾小管功能障碍、肾小球滤过率下降，最终引发急性肾损伤9。因此，脓毒症相关急性肾损伤（SA-AKI）的核心机制涉及炎症反应、内皮功能障碍、氧化应激和细胞凋亡之间的复杂相互作用。
既往研究表明，环状RNA（circRNA）在多种疾病的发病机制中发挥关键的调控作用
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作者声明无竞争利益。作者声明，本论文中所呈现的主要结果此前均未发表，也未在其他地方考虑发表。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| AG-825（ErbB2 抑制剂） | MedChemExpress | HY-10197 | 10 μM 用于通路阻断 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | RNA 完整性（RIN≥7） |
| AKT 抗体 | Proteintech | 60203-2-Ig | WB（1:15000） |
| Annexin V-APC/PI 凋亡检测试剂盒 | Elabscience | E-CK-A327 | 细胞凋亡检测 |
| 抗生素-抗真菌剂 | Gibco | 15240062 | 1% 浓度 |
| BCA 蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 | 蛋白浓度测定 |
| CAT ELISA 试剂盒 | MEIMIAN | MM-0897H2 | 抗氧化酶检测 |
| CCK-8 试剂盒 | Dojindo | CK04 | 细胞活力检测 |
| 环状 RNA 测序（circRNA seq） | 福州华荣科汇生物科技有限公司 | PE150 | 环状 RNA 测序及所有相关生物信息学分析 |
| CytoFLEX 流式细胞仪 | Beckman Coulter | B53000 | 细胞凋亡分析 |
| DMEM | Gibco (Invitrogen) | 11965092 | 细胞培养基 |
| ECL 底物试剂盒 | Millipore | WBKLS0100 | 蛋白检测 |
| ERBB2 抗体 | Sino Biological | 100271-T32 | WB（1:10000） |
| 胎牛血清（FBS） | Biological Industries | 04-001-1ACS | 10%（v/v）添加物 |
| GAPDH 抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | WB（1:50000） |
| HUVECs | Procell system | CP-H082 | 细胞系来源 |
| IL-1β ELISA 试剂盒 | MEIMIAN | MM-0181H2 | 炎症因子检测 |
| IL-6 ELISA 试剂盒 | MEIMIAN | MM-0049H2 | 炎症因子检测 |
| Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | 20012850 | RNA 测序 |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | 转染试剂 |
| LPS（E. coli O111:B4） | Sigma-Aldrich | L2630 | 10 μg/mL 用于 SA-AKI 模型 |
| MDA ELISA 试剂盒 | MEIMIAN | MM-2037H2 | 氧化应激标志物检测 |
| NanoDrop 2000 | Thermo Fisher | ND-2000 | RNA 定量 |
| NEBNext Ultra II RNA 文库构建试剂盒 | NEB | E7770S | RNA-seq 文库制备 |
| oe-circZBTB46 质粒 | GenScript | 定制合成 | circZBTB46 过表达载体 |
| oe-NC 质粒 | GenScript | 定制合成 | 阴性对照载体 |
| p-AKT（Ser473）抗体 | Proteintech | 66444-1-Ig | WB（1:1200） |
| PrimeScript RT 试剂盒 | Takara | RR047A | cDNA 合成 |
| PVDF 膜 | Millipore | IPVH00010 | Western blot 转膜 |
| QuantStudio 5 系统 | Thermo Fisher | A28137 | 实时 PCR |
| 核糖核酸酶 R | Lucigen | RNR07250 | rRNA 去除 |
| RIPA 裂解缓冲液 | Beyotime | P0013B | 蛋白提取 |
| RNAiso Plus | Takara | 9109 | 总 RNA 提取 |
| SOD ELISA 试剂盒 | MEIMIAN | MM-25469H2 | 抗氧化酶检测 |
| TB Green Premix Ex Taq | Takara | RR420A | qPCR 试剂 |
| TNF-α ELISA 试剂盒 | MEIMIAN | MM-0122H2 | 炎症因子检测 |
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