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向人源 SOD1-G93A ALS 小鼠腰椎鞘内注射 SOD1-ASO 实现中枢神经系统精准靶向及可预测疗效

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DOI：

10.3791/69788

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2026年2月24日

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1Biogen

本文内容

摘要

本文详细介绍了针对成年小鼠中枢神经系统的鞘内给药方法，重点在于操作步骤的精确性以及实现重复给药的可能性。文中包含一项验证性研究的结果，显示反义寡核苷酸可降低SOD1-ALS模型小鼠中突变SOD1的表达水平，证明该方法在神经退行性疾病临床前研究中的应用价值。

摘要

鞘内（IT）给予靶向中枢神经系统（CNS）的治疗药物是一种微创的给药途径，可将药物直接递送至脑脊液（CSF）中，从而提高靶向特异性和药物作用效率。尽管鞘内插管技术在大鼠中可持续给药已属常规操作，但在小鼠中的应用受限于解剖结构特点以及较高的操作相关并发症风险，包括脊髓损伤和感染。为克服这些局限，我们采用了一种急性穿刺针技术用于成年小鼠的鞘内给药，该方法可重复性高、侵入性小，适用于单次或多次给药方案。在携带SOD1-G93A突变的肌萎缩侧索硬化症（ALS）转基因小鼠模型中，我们成功实现了靶向SOD1基因的反义寡核苷酸（ASOs）的高效鞘内递送。该策略有效下调了突变型SOD1基因的表达，并通过电生理学和生物标志物评估显示显著改善了疾病表型。这些结果验证了该鞘内给药方法的有效性以及治疗效果，其疗效与脑室内（ICV）给药相当。尤为重要的是，该技术模拟了人类临床研究中所采用的操作流程，具有高度的转化相关性，适用于中枢神经系统靶向干预措施的临床前评估。尽管该技术需要一定的操作经验以确保一致性并避免脱靶效应，但这一鞘内给药策略代表了一种稳健、可重复且具有临床相关性的方法，有助于推动小型动物模型中的治疗开发。

引言

本研究描述了一种腰椎鞘内（IT）注射方案，将其与脑室内（ICV）给药方式进行比较，并评估药效动力学结果和耐受性，以指导靶向中枢神经系统（CNS）的治疗药物开发。靶向RNA的疗法，特别是反义寡核苷酸（ASO），可通过转录后水平调控基因表达，为治疗中枢神经系统疾病提供了有前景的手段。这类方法在神经退行性疾病中尤为重要，因为此类疾病伴随进行性神经元丢失，迫切需要精准、局部化且及时的干预措施，以期改变疾病的进展过程。本文直接比较了ASO治疗药物采用IT注射与ICV给药的疗效。

在临床前研究中，已采用成年小鼠（雄性或雌性，30-70日龄，体重13-20 g）的腰椎鞘内注射，将药理学试剂或生物载体直接递送至脑脊液（CSF）以靶向中枢神经系统1,2。通常缓慢注射5-10 μL的体积，以限制短暂的脑脊液压力升高和反流，鞘内通路通过L5-L6椎间隙建立1,2。操作成功依赖于精细的技术，以避免神经损伤，且操作受年龄和体重对脑脊液容量及操作难易程度的影响。使用细径针头（例如，27-30 G针头连接25 μL Hamilton注射器）可实现可靠的递送2。关键技术挑战包括尽量减少死腔损失、防止硬膜外误注射和液体渗漏，以及降低操作者依赖性变异，这些因素可能影响给药准确性和脑脊液中的药物分布。

由于中枢神经系统（CNS）结构复杂且细胞类型具有异质性，开发针对CNS 疾病的高效疗法仍面临重大挑战。这些特征阻碍了药物的靶向递送，并限制了药物在多种解剖和生理屏障之间的生物分布，因而需要采用专门的递送策略。一个关键障碍在于遍布中枢神经系统的生理和解剖屏障，这些屏障限制了药物的渗透。脑和脊髓被三层脑膜包裹：硬脑膜、蛛网膜和软脑膜，这些结构与血脑屏障（BBB）共同构成了抵御血液中治疗药物及其他分子进入的坚固防线。尽管这些屏障对于维持中枢神经系统的稳定性至关重要，但它们显著阻碍了反义寡核苷酸（ASOs）、单克隆抗体和病毒载体等大分子、亲水性分子的递送1,2,3,4。鞘内（IT）给药可通过将治疗药物直接注入蛛网膜下腔的脑脊液（CSF） 中，从而绕过这些限制。这种递送途径有助于药物在中枢神经系统各区域之间的分布，促进更广泛的组织渗透，进而有效作用于中枢神经系统中多种细胞类型所表达的靶点。自Hylden和Wilcox于1980年首次在小鼠中使用鞘内注射递送吗啡以来1，IT注射已成为递送多种治疗剂的常用方法，包括小分子药物、生物制剂、基因治疗载体以及反义寡核苷酸（ASOs）5,6,7,8,9,10。

反义寡核苷酸（ASOs）是一类经化学修饰的单链寡核苷酸，可与互补的RNA序列结合，并通过RNase H介导的RNA降解、剪接调控以及翻译的空间位阻抑制等机制调节基因表达11,12,13,14,15。通过化学修饰，如硫代磷酸酯骨架、2'-O-甲氧乙基（2'-MOE）取代以及约束性乙基残基，可增强ASOs的稳定性、结合亲和力以及对核酸酶的抗性6。这些特性使其在靶向神经遗传性疾病相关致病基因方面具有应用潜力。以鞘内给药方式使用的ASO疗法已在脊髓性肌萎缩症（SMA）和肌萎缩侧索硬化症（ALS）等疾病中显示出临床获益12,13,14,15。例如，诺西那生钠（Nusinersen，商品名Spinraza）可促进SMN2转录本中外显子7的包含，从而弥补SMA中SMN1基因的功能缺失7,14。类似策略也已在亨廷顿病中用于靶向突变型亨廷顿蛋白（huntingtin）的转录本12,13。尽管相关临床试验已提前终止16，但这些研究仍凸显了针对中枢神经系统（CNS）的ASO治疗策略持续受到关注。

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致命的神经退行性疾病，其特征是上、下运动神经元进行性变性。该疾病在全球范围内的患病率为每10万人中有6至9人，年发病率约为每10万人年2例，临床表现为逐渐加重的肌肉无力和痉挛，大多数患者在症状出现后2至3年内死于神经肌肉性呼吸衰竭17。尽管大多数病例为散发性（sALS），约10%的病例为家族性（fALS），后者有助于揭示疾病的遗传驱动因素。其中研究最为广泛的基因为铜/锌超氧化物歧化酶1（SOD1），该基因突变占家族性ALS的15%至20%，占散发性ALS的不到2%，以常染色体显性方式遗传18。SOD1编码一种细胞质抗氧化酶，可通过将超氧自由基转化为过氧化氢来清除活性氧。SOD1的突变形式（如G93A、A4V和H46R）具有构象不稳定性，导致蛋白质聚集以及获得毒性功能，进而引发氧化应激、线粒体功能障碍和兴奋性毒性19,20,21,22,23,24,25。此外，小胶质细胞和星形胶质细胞介导的非细胞自主机制会加剧ALS的病理过程，这些细胞共同营造慢性炎症环境，导致神经元持续受损26,27,28,29。因此，利用反义寡核苷酸（ASOs）沉默SOD1的表达，成为缓解ALS疾病发生发展的有前景的治疗策略。

SOD1-G93A 转基因小鼠模型（Jax 品系编号：004435）在内源性人类 SOD1 启动子的调控下表达人源 G93A 突变型 SOD1，能够高度模拟肌萎缩侧索硬化症（ALS）的临床特征，包括早期运动功能障碍、脊髓神经退行性变以及生存期缩短30。既往的临床前研究表明，在出生后第65天开始，通过渗透压泵持续向SOD1-G93A大鼠脑室内给药，以每日100 μg的剂量连续给予靶向SOD1的反义寡核苷酸（ASOs）28天，可显著抑制SOD1水平，减轻神经炎症反应，延缓临床症状的出现，并改善运动功能31。此外，在携带SOD1突变的ALS患者中，ASO介导的SOD1基因表达下调与血清神经丝轻链（NfL）水平降低相关，而NfL是一种反映轴突损伤的血液生物标志物32。在本项研究中，我们通过鞘内注射的方式向SOD1-G93A小鼠给予靶向SOD1的ASOs，并系统评估了其在分子、电生理及生物标志物层面的影响。对脊髓组织的定量分析显示，SOD1 mRNA水平显著降低。复合肌肉动作电位（CMAPs）的电生理评估表明神经肌肉功能得以保留。同时，血清NfL水平下降，提示正在进行的神经元损伤得到缓解。

为了评估不同中枢神经系统（CNS）递送方法的空间分布特征及相对有效性，本研究设置了一个采用脑室内（ICV）注射的对照组，即将治疗剂注入侧脑室，使其通过脑脊液（CSF）流动经室管膜及血管周围间隙扩散33。通过比较鞘内（IT）与脑室内（ICV）给药途径，我们旨在阐明药效动力学结果和组织靶向性的差异，从而优化面向中枢神经系统的反义寡核苷酸（ASO）疗法的递送策略。此外，为评估临床转化的可行性，我们开展了独立的耐受性研究，每只动物接受最多四次鞘内注射，每次间隔八周。在所有测试方案中，均未观察到明显的痛苦或发病迹象，表明鞘内ASO给药在生存期内具有良好的耐受性。这些结果与既往报道中在小鼠中重复进行鞘内注射具有良好耐受性的研究结果一致34。

IT ASO 递送的临床相关性进一步得到了近期托夫森（tofersen，QALSODY®）获批用于治疗 SOD1 相关肌萎缩侧索硬化症（ALS）的支持35。临床研究显示了强烈的靶点结合效应，表现为脑脊液中 SOD1 蛋白水平降低，随后是作为神经轴突损伤生物标志物的神经丝轻链水平下降。尽管在最初的 3 期 VALOR 试验中未达到主要终点，但包含开放标签扩展阶段的整合分析表明，更早启动治疗可能带来潜在益处35。

综合来看，本研究的数据表明，在 SOD1-G93A 肌萎缩侧索硬化（ALS）小鼠模型中，通过鞘内递送靶向 SOD1 的反义寡核苷酸（ASO）可实现有效的分子水平敲低、生物标志物改善以及功能保护，且耐受性良好。这些结果支持鞘内 ASO 递送作为治疗中枢神经系统遗传性疾病的一种合理且具有临床可行性的策略，并为后续转化研究提供了坚实的临床前依据。

方案

所有操作均经 IACUC 批准，并依照经批准的实验方案以及机构的化学品卫生和生物安全指南进行。
注意：在标准条件下饲养的 C57BL/6J（JAX #000664）和 SOD1-G93A 转基因小鼠（JAX #004435）中进行研究（12 小时光照/12 小时黑暗循环，22–24 °C，自由摄食和饮水）。

1. 应用化学修饰的ASO靶向人类SOD1

  1. 使用经过验证的反义寡核苷酸（ASOs），特异性靶向人类 SOD1 基因（RefSeq: NM_000454.5）3' 非翻译区（UTR）的第 613-629 位核苷酸36：A*GoToG*T*T*T*A*A*T*G*T*ToToA*T*C
  2. 通过引入 MOE（2'-O-甲氧乙基）（正体表示）、cEt（约束性乙基）（斜体表示）、DNA（粗体表示）、磷酸键（o）和硫代磷酸键（*），加入经验证的化学修饰以增强稳定性与功效，如先前报道36。  补充文件 1 提供了 ASO 化学结构及其对应的彩色编码图示。
  3. 制备一种非靶向对照 ASO，其序列与人类或啮齿类基因组无互补性，并采用相同的修饰方案作为对照：C*CoToAoT*A*G*G*A*C*T*A*T*C*C*AoGoGoA*A

2. 在无菌条件下制备和处理ASO溶液

  1. 在无菌条件下，用无菌人工脑脊液（aCSF；表1）将ASO重悬至10 mg/mL的浓度，每只动物的最终注射体积为10 μL（含100 μg ASO）。
  2. 使用无菌移液器轻轻混匀溶液以保持分子完整性，随后短暂涡旋5–10秒，确保充分混匀。
  3. 将稀释后的溶液通过无菌0.2 mm针头滤器过滤，以去除颗粒物和污染物。
  4. 将最终溶液无菌分装至无菌微量离心管中，置于经监控的温控设备中4 °C保存，最多可保存1周；避免冻融循环以维持其稳定性。

3. 鞘内注射前的小鼠准备

  1. 使用电子天平将每只小鼠称重至最接近的 0.1 g，然后将其转移至鼻罩中，并以 2–2.5% 浓度的异氟烷（溶于氧气）诱导麻醉；持续监测麻醉深度，并通过足底反射消失确认达到手术麻醉水平。
  2.  准备一个温控加热垫，并将其设定为 37 °C，用于小鼠在准备和恢复期间的体温维持。在小鼠与加热垫之间放置物理屏障，以避免直接接触。
  3. 麻醉诱导后立即在双眼涂抹眼用润滑剂，以防止角膜干燥。随后将小鼠置于加热垫上呈腹卧位，以预防低体温，减轻生理应激，并在整个操作过程中维持正常的心血管和呼吸功能。
  4. 使用无菌注射器（配备 25 号针头）皮下注射缓释型布托啡诺注射混悬液（1.3 mg/mL），剂量为 3.25 mg/kg，在操作前按每 20 g 体重注射 0.05 mL 给药。
  5. 剃除从腰部中侧至骨盆带区域的毛发，然后使用异丙醇和聚维酮碘棉签交替擦拭消毒该区域，重复三次，并让消毒部位完全自然风干。

4. 直接鞘内注射

  1. 麻醉并完成手术部位准备后，将小鼠转移至清洁的注射区域，并使其腹侧卧位于加热垫上。
  2. 将小鼠置于脊柱轻度弓起的位置，以利于触诊和注射。在下胸部至 upper lumbar 水平将弯头刮勺插入腹部下方，诱导轻度脊柱屈曲，从而扩大第五与第六（L5-L6，优先选择）或第四与第五（L4-L5）椎板之间的腰椎椎间隙。
  3. 用一只手的拇指和食指轻轻夹住骨盆带以固定，同时用另一只手触诊背部中线，定位 L4-L5 或 L5-L6 目标椎间隙。
  4. 将装有 29-G、½ 英寸针头的无菌 0.3 mL 胰岛素注射器垂直于背部皮肤表面或以 70–80° 角度放置，针尖斜面朝向头侧。推进针头直至遇到轻微阻力，表明已穿透硬脑膜，随后继续进入鞘内腔。
  5. 稳定推进，直至针尖进入鞘内腔，以出现尾部抽动反射作为成功进入鞘内腔的确认标志。
  6. 若遇到明显阻力或未观察到尾部抽动反射，应退出针头，重新确认解剖标志，并调整针头位置后再次尝试注射。若首次尝试在 L5-L6 椎间隙进行，则后续尝试应改在 L4-L5 椎间隙进行。
  7. 缓慢注射 10 μL ASO 溶液（持续约 10 秒），以最小化压力变化并避免脑脊液反流。注射后可将针头原位保留额外 10 秒。
  8. 垂直且平稳地小心拔出针头，以防止组织损伤和液体回流。

5. 注射后小鼠的监测与恢复支持

  1. 将每只小鼠分别置于预热的恢复室中独立或间隔充足的空间内，保持环境温度为 37 °C，并确保视野清晰。
  2. 在麻醉恢复期间持续控制恢复室温度，以防止低体温。
  3. 持续监测呼吸频率和呼吸模式、体位以及对触觉刺激的反应性。
  4. 观察小鼠直至其恢复翻正反射并表现出协调的运动能力。
  5. 根据 IACUC 协议，记录所有相关操作细节，包括注射部位、ASO 剂量、注射体积以及操作过程中和操作后的任何行为学或生理学观察结果。

6. 确定返回饲养笼的标准

  1. 将小鼠放回饲养笼之前，确认其状态稳定且具有协调的自主运动能力。
  2. 确保小鼠无任何痛苦迹象，包括呼吸费力或不规则、发出叫声以及长时间无反应。
  3. 提供柔软且营养全面的支持性食物，例如营养完整的凝胶饮食补充剂，以帮助维持水合状态和热量摄入，同时减少摄食所需 effort。

7. 对小鼠进行复苏后观察

  1. 如果小鼠为群养，需确认其是否存在探索、理毛和社交互动等正常行为。
  2. 持续监测是否出现异常恢复迹象，如异常姿势、虚弱或瘫痪、呼吸不规则或反应性降低，一旦出现这些症状，应立即重新评估。
  3. 若恢复延迟或受损，应寻求兽医干预。

8. 使用立体定位手术向侧脑室进行脑室内注射及术后护理

注意：采用脑室内（ICV）注射作为对照组，以评估药物的空间分布和相对疗效，将反义寡核苷酸（ASOs）递送至侧脑室，通过脑脊液（CSF）介导其扩散，并与鞘内给药进行比较。ICV 注射操作应依照小鼠的成熟、标准化方案进行37。

  1. 使用浓度为 2–2.5% 的异氟烷与氧气混合气体对小鼠进行麻醉以实现制动，将小鼠俯卧位固定于加热垫上，然后在手术前皮下注射缓释型布托啡诺注射混悬液（1.3 mg/mL 盐酸布托啡诺），剂量为 3.25 mg/kg，使用无菌 1 mL 注射器配合 25 号针头，按每 20 g 体重 0.05 mL 给药。用电动剃毛器剃除小鼠头部的毛发。
  2. 所有外科操作均在麻醉状态下进行。通过检测足底回缩反射（脚趾夹捏）是否消失来确认麻醉深度。在整个脑室内注射（ICV）手术过程中维持无菌操作区域。仅使用无菌器械，并小心操作以避免接触非无菌表面。
  3. 将小鼠以标准俯卧位固定于配备数字显示控制台的立体定位仪上。将小鼠门齿嵌入适配器的门齿杆中以固定头部，随后固定适配器并连接输送异氟烷的吸入与排气呼吸管。将耳杆插入小鼠耳道并拧紧螺钉，以牢固稳定头部。
  4. 使用异丙醇和聚维酮碘棉签交替擦拭消毒手术区域，重复三次，然后使用无菌手术刀做正中切口以暴露颅骨。用无菌棉签清除软组织，确保前囟点（bregma）清晰可见。
  5. 在颅骨上标记前囟点（bregma）。将含有 ASO 的注射器（26-G，26s/2"/2，点状针尖）置于前囟点正上方。调整针头至目标坐标：前后向（AP）-0.3 mm，内外向（ML）±1.0 mm，垂直向（DV）-3 mm（相对于颅骨表面）。在颅骨上标记前后向和内外向坐标位置。
  6. 在已标记的坐标处钻出颅骨孔，然后使用立体定位仪将注射器针头下降至颅骨表面以下 -3 mm 深度。以 10 μL/min 的速度注射溶液，直至总注射体积达到 10 μL。注射完成后，保持针头在原位 4 分钟，然后缓慢拔出，以尽量减少反流。
  7. 缝合头皮切口，将小鼠置于预热至 37 °C 的恢复舱中直至完全清醒，并在确认其生命体征稳定后放回原饲养笼。提供营养全面的凝胶饮食补充剂，并持续监测异常恢复迹象，如异常姿势、虚弱或瘫痪、呼吸不规则或反应性降低；若出现上述任何症状，应立即重新评估。

9. 复合肌肉动作电位（CMAP）的电生理学评估

  1. 确保实验操作人员对每只小鼠的基因型和处理分组均处于盲态，以消除数据收集与分析过程中的偏倚。
  2. 使用异氟烷对小鼠进行麻醉，以实现制动并保证其舒适，同时维持体温在 37 °C。
  3. 通过确认足底反射消失来判断麻醉深度是否充分。
  4. 采用一次性 28 G 单极针状电极进行刺激与记录。将记录电极插入胫骨前肌约 1 mm 深度。
  5. 在坐骨切迹附近刺激坐骨神经，使用持续时间为 0.1 ms 的单相方波脉冲，每 2 s 给予一次刺激，起始强度为 1.0 mA，并以 0.5 mA 为增量逐步增加，直至获得超最大反应（通常为 1.5–3.5 mA）。
  6. 确定超最大刺激阈值后，在高于该阈值 0.5 mA 的强度下记录复合肌肉动作电位（CMAP）反应。在刺激后 0.8 ms 处测量 CMAP 振幅（峰-峰振幅），并对每只小鼠左右后肢的振幅取平均值。

10. 测定血清中 pNFH 水平

  1. 在指定时间点，使用含有促凝剂和血清分离胶的毛细血管采血管，通过面静脉穿刺采集 100 μL 全血。
  2. 将血液样本在 4 °C 条件下以 2000 g 离心 10 分钟，以分离血清。
  3. 采用经过验证的免疫检测试剂，在全自动、基于微流控免疫检测试剂盒的分析仪上定量检测生物样本中血清磷酸化神经丝重链（pNFH）的水平。

11. 分离RNA并进行RT-qPCR

  1. 使用6 mm钢珠，在低温可编程高能振荡珠磨机中以每分钟1,000–1,200次冲程的速度对小鼠颈段/胸段脊髓组织进行粉碎，持续30–40秒。
  2. 取15 mg粉碎后的组织，加入700 μL基于苯酚-硫氰酸胍的裂解液和RNA提取试剂，使用2.8 mm陶瓷珠，在可编程高速珠击式机械匀浆器中以5.62 m/s的速度进行匀浆，每次30秒，共进行两个循环。
  3. 按照制造商说明书，使用试剂盒提取总RNA，包括柱上DNase处理步骤。
  4. 使用高容量逆转录试剂系统合成cDNA。
  5. 为进行qPCR检测，设计特异性引物/探针组合，用于检测人SOD1基因第4外显子区域的目标基因：
    上游引物（5′-TGGTGTGGCCGATGTGTCTA-3′），
    下游引物（5′-ATGATGCAATGGTCTCCTGAGA-3′），
    探针（5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGATCTCA-MGB/NFQ-3′）
  6. 使用小鼠GAPDH（TaqMan检测编号：Mm99999915_g1）作为内参基因。
  7. 在高通量实时定量PCR（qPCR）仪器上进行qPCR反应，每反应使用20 ng cDNA、快速循环探针法qPCR预混液、基因特异性引物以及荧光标记的水解探针，用于检测内参转录本（VIC/MGB）和目标转录本（FAM/MGB）。

12. 数据的统计分析

  1. 将体活测量（CMAP）、血清pNFH以及基因表达分析的数据以均值 ± 标准差（SD）的形式呈现。
  2. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）评估各组均值之间的统计学显著性，随后进行Tukey多重比较检验，以p < 0.05为具有统计学显著性。
  3. 使用适当的统计分析软件生成图表并完成所有分析，确保与本研究中所进行的分析方法一致。

结果

为了严格表征鞘内（IT）给药在成年小鼠中的精确性和效率，我们首先利用伊文思蓝染料（0.5%）作为脑脊液（CSF）流动和组织渗透的可视化示踪剂，开展了基础验证实验。将成年野生型C57BL/6J小鼠（品系#000664；体重25–30 g）在氧气中用异氟烷（2–2.5%）麻醉，以消除运动伪影，并在无菌条件下准备腰椎区域。通过腰椎穿刺将药物注入蛛网膜下腔，注射体积分别为20 μL、30 μL和50 μL的单次递增剂量，以评估剂量/体积与染色强度之间的关系。通过观察尾部抽动或注射时无阻力感来确认针头位置正确。

在染料注射后5分钟内，对小鼠进行经心脏灌注冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS），以清除血管系统中残留的染料。随后小心取出脊髓组织，在中性背景和标准光照条件下进行拍照。肉眼观察显示，所有接受染料注射的小鼠脊髓均呈现出一致且均匀的背侧至腹侧分布的伊文思蓝染色。较高的注射体积与沿头尾轴方向更强的染料饱和度相关，但即使注射20 μL体积的小鼠也显示出明显的染色效果。相比之下，未接受伊文思蓝染料注射的小鼠（对照组，注射无菌生理盐水）在脊髓组织中未见任何可见着色或背景染色（图1）。这些结果表明，在小鼠中进行鞘内注射可实现溶质沿脊髓的快速且可重复的递送。本实验的局限性包括缺乏对染料分布的定量评估，以及未对用于反义寡核苷酸（ASO）给药的10 μL注射体积进行染料分布分析。然而，在后续针对人源SOD1-G93A小鼠模型的研究中，已通过特异性针对人SOD1基因的表达分析，在基因表达水平上完成了定量评估。后续实验中用于ASO给药的10 μL注射体积是经过选择的，以确保在小鼠体内安全且耐受性良好的给药剂量，并基于既往研究预计可提供足够的中枢神经系统暴露量38。

在上述解剖学验证的基础上，我们进一步评估了鞘内（IT）递送反义寡核苷酸（ASO）靶向突变SOD1的功能相关性，该策略在SOD1-ALS模型中已被证实具有治疗效果。携带人类突变SOD1基因的半合子SOD1-G93A转基因小鼠表现出可预测的运动神经元变性和神经肌肉功能衰退，是公认的临床前模型。在5周龄时（症状出现前），小鼠通过鞘内单次推注方式给予10 μL体积中含有100 μg的SOD1特异性ASO。该剂量的选择基于先前采用脑室内（ICV）给药方式进行的小鼠优化研究（McCampbell等，2018）36。为了比较IT与ICV递送的疗效，另设一组小鼠通过立体定位技术接受相同剂量ASO的ICV注射。对照组则通过IT途径给予非活性ASO（非靶向对照）。

治疗后五周（10周龄时），小鼠在轻度异氟烷麻醉下进行复合肌肉动作电位（CMAP）检测。通过标准化的坐骨神经刺激方案诱发后肢肌肉的CMAP记录显示，与接受无活性ASO处理的对照组相比，鞘内（IT）和脑室内（ICV）给药组的CMAP波幅均显著保留（经单因素方差分析及Tukey事后检验，p < 0.0001）。重要的是，IT与ICV两种给药方式之间的波幅保留程度无显著差异（p > 0.05），表明二者在神经肌肉保护效果上相当（图2A）。

为评估神经元完整性的系统性生物标志物，采用高灵敏度电化学发光法检测血清中磷酸化神经丝重链（pNFH）的水平。注射后5周时间点采集的血样显示，与对照组（溶剂处理）小鼠相比，反义寡核苷酸（ASO）治疗小鼠的pNFH浓度降低了>40%（p < 0.0001），且IT与ICV给药方式之间未观察到显著差异（图2B）。一致的分子生物标志物反应结果印证了电生理数据，提示IT给药在该ALS模型中能有效缓解神经退行性病变过程。

为了在分子水平上评估 SOD1-ASO 的靶点结合效果，我们对分离的颈段和胸段脊髓组织进行了逆转录定量 PCR（RT-qPCR）分析。采用基于离心柱的方法提取总 RNA，确保其高纯度（A260/A280>1.8），随后使用随机六聚体引物进行 cDNA 合成。以 GAPDH 为归一化对照，对人源 SOD1 转录本进行的定量 PCR 扩增结果显示，经鞘内（IT）给药后的平均基因敲低率为 60%，脑室内（ICV）给药后为 35%，两者均显著高于非活性 ASO 对照组（p < 0.0001）。两种给药途径的直接比较表明，IT 给药导致的基因敲低效果显著更强（p < 0.0001），提示通过直接进入脊髓途径可实现更有效的靶点结合（图 3）。尚需进一步研究以评估其他中枢神经系统区域中的靶点结合情况。

综合这些全面的数据，有力地验证了鞘内注射（IT）作为一种精确、可重复且微创的技术，可用于在小鼠模型中将反义寡核苷酸（ASOs）递送至中枢神经系统（CNS）。在广泛的效应指标上，IT给药在治疗效果方面与脑室内（ICV）给药相当，包括持续维持神经功能（CMAP）、使疾病相关生物标志物（pNFH）恢复正常水平，以及在靶向的CNS区域内显著降低人源SOD1转录本的分子表达。这些发现凸显了IT递送途径在面向CNS的ASO治疗中的多功能性，其疗效与ICV递送相当，同时具备操作简便和侵入性更低的优势。因此，IT与ICV递送均为针对CNS干预的可行策略，在临床前研究中可根据解剖可及性、操作可行性及治疗背景灵活选择。这使得IT递送成为未来靶向CNS治疗的一种极具前景的转化平台。为支持转化研究，我们建议开展进一步的临床前研究，利用荧光原位杂交或免疫荧光等技术，评估药物在脑脊液、不同CNS区域以及靶细胞内的药代动力学分布和摄取情况。

伊文思蓝通透性实验，肠道样本包含对照组和不同实验浓度。
图 1：成年小鼠鞘内注射后伊文思蓝染料分布的可视化。 通过直接鞘内（IT）注射0.5%伊文思蓝染料至成年小鼠，以定性评估其在脊髓中的分布情况。在不同的实验组中分别给予三种不同体积的染料（20 μL、30 μL 和 50 μL）（每种体积条件n = 1只小鼠）。注射后取出脊髓并进行灌流，通过观察组织沿程的染色强度来评估染料渗透情况。脊髓组织图像显示了每种注射体积对应的染料扩散范围，表明随着注射体积增加，脊髓内的染料覆盖范围和染色强度呈剂量体积依赖性增强。请点击此处查看该图的放大版本。

CMAP 和 pNFH 数据分析柱状图；SOD1-ASO 治疗比较，第10周结果。
图 2：靶向 SOD1 的反义寡核苷酸治疗可恢复小鼠的运动功能并降低病理性神经丝蛋白水平。 在5周龄时，成年SOD1-G93A转基因小鼠通过鞘内（IT）或脑室内（ICV）注射接受单剂量的活性靶向SOD1反义寡核苷酸（SOD1-ASO），或通过鞘内注射给予无活性的对照ASO。治疗效果在10周龄时进行评估，相当于治疗后5周。（A）通过复合肌肉动作电位（CMAP）记录来评估治疗动物的神经肌肉功能。与对照组相比，SOD1-ASO治疗组（每组 n = 5 - 6）的CMAP下降趋势出现逆转，表明功能恢复。（B）从第10周采集的血清中定量外周磷酸化神经丝重链（pNFH）水平，该蛋白是神经退行性变的生物标志物。与对照组相比，SOD1-ASO治疗显著降低了循环中pNFH的水平，提示与疾病相关的神经元损伤得到缓解。所有数据均以均值±标准差（SD）表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）并随后进行Tukey多重比较检验确定统计学显著性，p值≤0.0001表明各治疗组之间存在显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。

脊髓研究，柱状图，倍数变化，SOD1-ASO 影响，第10周，统计结果。
图 3：SOD1-ASO 给药显著抑制转基因 SOD1-G93A 小鼠脊髓中人源 SOD1 mRNA 的表达。 为评估通过鞘内（IT）或脑室内（ICV）注射递送的靶向 SOD1 的反义寡核苷酸（SOD1-ASO）的靶向效率，采集10周龄（给药后5周）处死的 SOD1-G93A 转基因小鼠的颈段/胸段脊髓组织，采用反转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测人源 SOD1 mRNA 的表达水平。人源 SOD1 转录本水平以非活性 ASO 处理组的表达量为参照进行定量和归一化。该图展示了各治疗组人源 SOD1 mRNA（以 GAPDH 为内参）的倍数变化（每组 n = 5–7 只小鼠），显示 SOD1-ASO 给药后表达显著下调。数据以均值 ± 标准差表示。组间差异采用单因素方差分析（ANOVA）进行检验，随后进行 Tukey 多重比较检验，p 值 ≤ 0.0001 表明各治疗组间存在显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。

组分分子量添加量（每升或每千克）单位
磷酸二氢钠二水合物0.034g
磷酸氢二钠无水物1420.111g
氯化钠58.448.766g
氯化钾74.560.224g
氯化钙二水合物147.020.206g
六水合氯化镁0.163g
水（Milli-Q）993g
泊洛沙姆 1880.01g

表1：aCSF成分。

补充图1：小鼠腰椎鞘内注射的体位摆放。 将弯曲的刮刀或药勺置于小鼠腹部下方，使脊柱弯曲，从而扩大椎间隙。注射部位为L4-L5或L5-L6节段，应沿脊柱中轴线正确对齐，如图所示。请点击此处查看该图的高清版本。

补充文件1：ASO序列与化学修饰。 请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍的直接鞘内（IT）注射技术是一种微创且高效的将治疗剂递送至中枢神经系统（CNS）的方法，尤其适用于小鼠等小型啮齿类动物模型。该盲穿技术在操作上具有挑战性，但由经过训练的操作者实施时，已被证明具有良好的可重复性和临床相关性。该方法利用精确的解剖定位和高效的操作技巧，可快速实现中枢神经系统给药，无需导管植入，这一重要简化为拓展临床前研究带来了显著优势；然而，其转化应用的价值仍有待进一步的定量评估和标准化方法学验证5,8,10。

一次成功的鞘内注射依赖于多个关键步骤。细致的动物准备至关重要：首先使用麻醉舱诱导麻醉，并通过鼻罩维持麻醉状态，随后剃除腰椎区域的毛发并给予镇痛剂以确保动物舒适。通过将弯曲的刮板置于腹部下方，使脊柱弯曲以扩大椎间隙，从而实现小鼠的正确体位（补充图1）。本研究所描述的鞘内注射目标是将针尖斜面准确置入腰池，方法是在适当的椎体水平将针头推进椎板之间的间隙。准确定位L4与L5椎板之间或更优的L5与L6椎板之间的椎间隙，对于进入蛛网膜下腔至关重要5,10。蛛网膜下腔也称为鞘内腔，位于蛛网膜与软脑膜之间39。由于脊髓比椎管短，尾部的脊髓节段相对于其对应的椎体位置更为头侧。为避免歧义，注射部位以椎间隙而非脊髓节段来标定。值得注意的是，小鼠腰椎节段的解剖存在显著变异，无论是在同一品系内还是不同品系之间均如此40。注射必须沿脊柱中线进行，以避免偏斜，否则可能导致后肢轻瘫，严重时甚至因脊髓损伤而导致瘫痪。当在正确的解剖位置操作时，直接损伤脊髓的风险极低。然而，仍存在轻微的神经根刺激或损伤风险，因此强调操作者必须接受充分培训并具备熟练的操作技能，以最大限度地减少不良后果。尾部回缩反射可作为判断针头位置是否成功的有用指标，使操作者能够评估进针深度，避免过浅或过深的穿刺。该技术需要反复练习才能掌握，需稳定控制进针深度、角度和注射体积，以防止药液回流或渗漏至周围组织。尽管我们建议注射体积不超过10 μL，但已有研究在无不良反应的情况下评估了高达20 μL的注射量。先前的研究已确定10 μL的鞘内注射体积为药物递送的最佳剂量38。虽然这相当于小鼠总脑脊液（CSF）体积的25-30%41,42，但在成年小鼠中报道的最大可耐受鞘内注射体积可达30 μL10。超过推荐限值的注射体积可能干扰脑脊液动力学，导致脑脊液压力改变，并增加不良反应的风险。小鼠的总脑脊液体积估计为35–40 μL，每天更新12–13次41,42，相当于大约每1.8小时完全更新一次42,43。考虑到脑脊液更新迅速、经验观察结果以及既往研究表明使用20–30 μL的鞘内注射体积未出现并发症，10 μL的注射体积预期不会产生不良影响10,44。

可扩展性是该技术的一个显著优势。一旦掌握，经过培训的操作人员每小时可处理10至12只动物，从而便于开展更大规模的临床前研究，同时避免了导管植入或更具侵入性的外科手术所带来的后勤负担。与慢性导管植入相比，该操作无需复杂的仪器设备，可减少动物应激反应，并缩短恢复时间，因此适用于需要重复给药的纵向研究。为了模拟临床给药方案，我们验证了在小鼠中进行系列鞘内（IT）给药的可行性，最多给予四次剂量，每次间隔八周。这些注射耐受性良好，未观察到痛苦迹象、行为改变或疾病征象，这与先前研究结果一致：多次鞘内治疗后，脑脊液（CSF）动力学或脊髓结构均无显著改变34,45。因此，我们的研究证实，在适当间隔下重复鞘内给药是可行的，符合人类治疗范式中为实现治疗效益而需维持靶点持续暴露的要求。根据我们的经验，这些重复的鞘内注射在5至29周龄的广泛年龄范围内均能成功实施。尽管随着年龄增长和体重增加，由于皮下组织增多，脊髓可及性可能略有下降，但在熟练掌握该技术并熟悉针头定位手感的操作者手中，仍可成功完成给药。然而，我们指出，除注射部位和推注体积外，注射速度以及注射溶液的物理特性（如相对于脑脊液的密度）等因素也会显著影响溶质在中枢神经系统（CNS）内的分布。虽然本研究未直接测量或调控这些参数，但Linninger等人（2023年）的最新研究通过机制性药代动力学模型表明，这些因素显著影响鞘内注射反义寡核苷酸（ASO）的生物分布及组织靶向性46。因此，我们承认这是本研究的局限性，并强调注射速度和溶液特性是未来研究中优化中枢神经系统递送效率和转化相关性的重要变量。综上所述，这些结果凸显了在多剂量临床前研究范式中重复鞘内给药的可靠性和可行性，支持其用于实现靶点的持续暴露以及对人类治疗方案的转化建模。

IT 方法在治疗测试方面也具有灵活性。该方法适用于多种治疗方式，包括反义寡核苷酸（ASOs）、小分子、多肽和病毒载体，能够直接评估靶向中枢神经系统的干预措施。将精确且可控体积的治疗药物递送至腰池，可确保脊髓及更广泛中枢神经系统得到有效暴露，同时限制全身性外溢。通过尾 flick 反射及其他操作提示，可实时验证鞘内给药是否成功，从而进一步提高实验的可重复性并降低实验失败率5,6,8,47。

既往在 SOD1-G93A 小鼠中的研究表明，疾病病理学改变主要影响脊髓，尤其是腰段脊髓，而非大脑皮层29,48。因此，该技术在 SOD1-ALS 的研究背景下尤为重要，SOD1-ALS 是一种由超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突变引起的遗传性肌萎缩侧索硬化症。这些突变导致错误折叠的 SOD1 蛋白聚集，从而在运动神经元内产生毒性功能获得效应，引发进行性神经肌肉功能衰退49,50。在本研究中，我们采用靶向 SOD1 的反义寡核苷酸（ASOs），证实其可有效结合靶标 mRNA 并实现功能恢复。RT-qPCR 分析显示，经鞘内（IT）给药后，脊髓中人源SOD1转录本水平显著降低；而复合肌肉动作电位（CMAP）记录则表明运动神经元功能障碍得到逆转。此外，血清分析显示磷酸化神经丝重链（pNFH）水平下降，pNFH 是神经退行性变的生物标志物，进一步验证了该治疗策略的有效性。

该模型的临床相关性因近期美国食品药品监督管理局（FDA）批准了托法森（QALSODY®）而得到进一步凸显。托法森是一种反义寡核苷酸（ASO），旨在靶向SOD1 mRNA，用于治疗SOD1-ALS35。托法森通过鞘内给药方式用于SOD1-ALS患者，已显示出明确的药效动力学活性，包括降低脑脊液（CSF）中总SOD1蛋白水平（靶点结合的间接标志物）以及血浆神经丝轻链（NfL）水平（轴突损伤和神经退行性变的标志物）。在III期VALOR研究及其开放标签扩展（OLE）的整合分析中，较早启动托法森治疗与临床功能、肌力和生活质量下降幅度的减小相关，并降低了死亡等效事件的风险35。这些数据验证了鞘内给药途径作为中枢神经系统（CNS）靶向ASO治疗的有效策略，也为采用类似递送方法的临床前研究提供了强有力的转化支持。

除了在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中的应用外，鞘内注射（IT）途径在脊髓性肌萎缩症（SMA）中也已取得成功14,51,52，其中鞘内给予的反义寡核苷酸药物Nusinersen（Spinraza®）是首个获批的治疗药物14,51,52。鞘内注射可绕过血脑屏障，实现中枢神经系统（CNS）广泛的药物分布53，这对于具有弥散性神经元病变特征的疾病至关重要。尽管重复给药在操作可行性和耐受性方面存在挑战，但制剂和递送技术的进步正不断使鞘内给药在长期治疗中更具可行性。

鞘内（IT）给药相比脑室内（ICV）注射在人类临床实践中具有更高的转化相关性。成年小鼠的ICV与IT注射主要区别在于中枢神经系统（CNS）内的靶向位置，以及所给予物质的分布和效应。ICV注射将物质直接递送至脑侧脑室内的脑脊液（CSF）中，主要作用于脊髓上位结构；而IT注射则将物质递送至脊髓蛛网膜下腔的脑脊液中，主要靶向脊髓。尽管两种方法均可绕过血脑屏障，实现物质对中枢神经系统的直接递送，但某些化合物经IT给药后作用持续时间更长54，且通常在脊髓中产生更强的转导效果；相比之下，ICV注射可在侧脑室邻近的脑区实现较高的局部浓度54。然而需要注意的是，注入脊髓段脑脊液的化合物仍可到达脑部，尽管其转运速率非常缓慢1。这些差异也体现在操作风险方面：若无菌条件被破坏，ICV注射存在较高的污染风险；而IT注射虽非完全无风险，但与装置相关的安全隐患较少。术后反应方面，IT注射可能引起短暂的不适或后肢相关反应，而ICV注射所致即刻不适较轻，但仍可能存在局部颅内刺激。

该技术的未来应用将超越当前的临床前研究。鞘内给药可用于评估下一代靶向中枢神经系统的治疗手段，包括基因编辑工具（如CRISPR/Cas系统）、RNA干扰技术以及基于病毒载体的基因疗法。该方法可适用于针对多个中枢神经系统通路的联合治疗，实现对药效动力学相互作用的实时评估55,56。此外，鞘内给药可与影像学技术相结合，用于在活体（in vivo）条件下追踪药物分布及靶点结合情况，从而加速转化研究进程。该技术还为在遗传定义明确的神经疾病小鼠模型中研究精准医学策略提供了平台，有助于生物标志物的发现、长期功能评估以及临床转化前的安全性评价。

综上所述，采用异氟烷麻醉的直接腰椎鞘内注射技术是一种微创、快速且具有临床可转化性的药物递送方法，可用于将治疗剂递送至小鼠中枢神经系统。该技术在SOD1-ALS模型中的成功应用及其适用于多次给药的特点，为在转化神经科学研究中更广泛地应用奠定了坚实基础。随着领域内对中枢神经系统基因调控、靶向RNA治疗和精准医学的日益重视，鞘内给药途径将继续作为一种关键的药物递送策略，连接临床前模型与临床应用的成功。

披露

SM 和 S-C L 目前是渤健公司（Biogen, Inc.）的雇员，而 TC、DF、YL、JD 和 MZ 曾是该公司的雇员。本文讨论的反义寡核苷酸由 Ionis Pharmaceuticals 提供给作者。托法森（Tofersen，商品名 QALSODY）是渤健与 Ionis Pharmaceuticals 共同开发的产品。

致谢

我们感谢Ionis Pharmaceuticals提供了本文所述的反义寡核苷酸（ASOs）。我们衷心感谢Biogen公司的Ryan Gamble、Steve Garafalo、Adria Martig、Isabel Isaza、Taras Tuczkewycz和David Koske所做出的专业贡献，他们通过实质性的修改显著提升了本稿件的质量。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于IT注射的0.3 mL 29 G、1/2英寸胰岛素注射器Smiths Medical4429-3
直径0.5 mm的无菌钻头Fine Science Tools (FST) 或同等产品1900705
5-0 Prolene单丝缝合线Ethicon 8870H 
酒精棉签Dynarex1203
酒精棉签Dynarex1203
镇痛药-缓释布托啡诺需处方
动物剪毛器Wahl08787-450A
Applied Biosystems高容量cDNA反转录试剂盒Fisher Scientific43-688-14
Bead Ruptor 24均质仪Omni International, Inc.19-070
血液采集与血清分离管Beckton Dickinson (BD)365967
二水合氯化钙JT Baker1335
数字注射泵Harvard Apparatus70-4507
Ella全自动免疫分析系统R&D Systems600-100
眼膏-PuralubeDecra17033-211-38
Geno/GrinderSPEX SamplePrep2010
Germinator 500干式灭菌器Braintree Scientific 或同等产品GER 5287-120V
带针头的Hamilton注射器（26s/2"/2（针尖类型））Hamilton8030026s/2"/2：                                                26s：26 G；                                                       2" 长度；                                                               2：针尖类型
硬组织均质混合用2.8 mm陶瓷珠（2 mL增强管）（50个/包）Fisher Scientific50-280-9286供应商：Revvity Health Sciences Inc
加热垫K&H Manufacturing1060
ICV平台Stoelting502063
带废气清除系统的异氟烷麻醉舱VetEquip901820
七水合氯化镁EMD Chemicals1.05832
Metzenbaum剪刀Fine Science Tools (FST) 或同等产品14016-14
小鼠GAPDH TaqMan探针 ID Mm99999915_g1ThermoFisher Scientific4331182
用于CMAP的针电极，28 GNatus Medical（Teca品牌）#902-DMF25-TP
NutraGel：全营养饲料Bio ServNGB-2
Olsen-Hegar持针器Fine Science Tools (FST) 或同等产品12502-12
泊洛沙姆188Mutchler
氯化钾JT Baker3045
前置放大器（用于CMAP）World Precision Instruments (WPI)SYS-DAM50
ProteinSimple pNFH试剂盒R&D SystemsSPCKB-PS-000519
聚维酮碘棉签Dynarex1201
QIAzol裂解试剂 Qiagen79306
QuantStudio 12K Flex系统Applied Biosystems4471087
药匙Fisherbrand01-257-567
Signal v6.04Cambridge Electronic Design序列号 061144CMAP软件 
小型动物复苏舱Thermocare便携式动物重症监护单元型号FW-1FW-1 
带数字显示控制台的小动物立体定位仪KOPF型号 940 
SOD1 G93A小鼠The Jackson Laboratory货号 # 004435
氯化钠EMD Chemicals1.16224
无水磷酸氢二钠Sigma Aldrich55136
二水合磷酸二氢钠Sigma Aldrich3819
无菌一次性手术刀Med Vet International 或同等产品MIL4410
无菌手术巾Dynarex4410
无菌纱布垫Dynarex 或同等产品DRX-3354
无菌生理盐水ThermoFisher Scientific14190094
无菌外科手套Ansell 或同等产品20277290
刺激隔离器（用于CMAP）World Precision Instruments (WPI)SYS-A365D
Stoelting微型钻机 Stoelting58610
外科弯头镊（Graefe镊 - 钛合金）Fine Science Tools (FST) 或同等产品11652-10
外科直头镊（Graefe镊 - 钛合金）Fine Science Tools (FST) 或同等产品11650-10
手术胶带Dynarex 或同等产品3572
用于皮下注射镇痛药的注射器BD309582
TaqMan Fast Advanced Master MixThermoFisher Scientific4444556
水（Milli-Q级）
电子天平Mettler Toledo                     型号 XSR2002S23-112795
野生型C57BL/6J小鼠The Jackson Laboratory货号 # 000664

参考文献

  1. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).
  2. Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice. J Vis Exp. (144), e58565(2019).
  3. Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 Suppl 1 (Suppl 1), S3(2009).
  4. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2 (1), 3-14 (2005).
  5. Ajeeb, R., Clegg, J. R. Intrathecal delivery of macromolecules: clinical status and emerging technologies. Adv Drug Deliv Rev. 199, 114949(2023).
  6. Bennett, C. F., Swayze, E. E. RNA targeting therapeutics: molecular mechanisms of antisense oligonucleotides as a therapeutic platform. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 50, 259-293 (2010).
  7. Corey, D. R. Nusinersen, an antisense oligonucleotide drug for spinal muscular atrophy. Nat Neurosci. 20 (4), 497-499 (2017).
  8. Bey, K., et al. Efficient CNS targeting in adult mice by intrathecal infusion of single-stranded AAV9-GFP for gene therapy of neurological disorders. Gene Ther. 24 (5), 325-332 (2017).
  9. Kennedy, Z., Gilbert, J. W., Godinho, B. Intrathecal delivery of therapeutic oligonucleotides for potent modulation of gene expression in the central nervous system. Methods Mol Biol. 2434, 345-353 (2022).
  10. Stavrou, M., Georgiou, E., Kleopa, K. A. Lumbar intrathecal injection in adult and neonatal mice. Curr Protoc. 4 (6), e1091(2024).
  11. Zou, Z. Y., Liu, C. Y., Che, C. H., Huang, H. P. Toward precision medicine in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Transl Med. 4 (2), 27(2016).
  12. Quemener, A. M., et al. The powerful world of antisense oligonucleotides: from bench to bedside. Wiley Interdiscip Rev RNA. 11 (5), e1594(2020).
  13. Rook, M. E., Southwell, A. L. Antisense oligonucleotide therapy: from design to the Huntington disease clinic. BioDrugs. 36 (2), 105-119 (2022).
  14. Neil, E. E., Bisaccia, E. K. Nusinersen: a novel antisense oligonucleotide for the treatment of spinal muscular atrophy. J Pediatr Pharmacol Ther. 24 (3), 194-203 (2019).
  15. Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389(2022).
  16. Kingwell, K. Double setback for ASO trials in Huntington disease. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 412-413 (2021).
  17. Mead, R. J., Shan, N., Reiser, H. J., Marshall, F., Shaw, P. J. Amyotrophic lateral sclerosis: a neurodegenerative disorder poised for successful therapeutic translation. Nat Rev Drug Discov. 22 (3), 185-212 (2023).
  18. Gros-Louis, F., Gaspar, C., Rouleau, G. A. Genetics of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1762 (11-12), 956-972 (2006).
  19. Valentine, J. S., Hart, P. J. Misfolded CuZnSOD and amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3617-3622 (2003).
  20. Rotunno, M. S., Bosco, D. A. An emerging role for misfolded wild-type SOD1 in sporadic ALS pathogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 253(2013).
  21. Winkler, D. D., et al. Structural and biophysical properties of the pathogenic SOD1 variant H46R/H48Q. Biochemistry. 48 (15), 3436-3447 (2009).
  22. Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
  23. Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
  24. Bruijn, L. I., et al. Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD1 mutant independent from wild-type SOD1. Science. 281 (5384), 1851-1854 (1998).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  26. Peggion, C., et al. SOD1 in ALS: taking stock in pathogenic mechanisms and the role of glial and muscle cells. Antioxidants (Basel). 11 (4), 614(2022).
  27. Beers, D. R., et al. Endogenous regulatory T lymphocytes ameliorate amyotrophic lateral sclerosis in mice and correlate with disease progression in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 134 (Pt 5), 1293-1314 (2011).
  28. Marchetto, M. C., et al. Non-cell-autonomous effect of human SOD1 G37R astrocytes on motor neurons derived from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 649-657 (2008).
  29. Filipi, T., et al. Cortical glia in SOD1(G93A) mice are subtly affected by ALS-like pathology. Sci Rep. 13 (1), 6538(2023).
  30. Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
  31. Smith, R. A., et al. Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. J Clin Invest. 116 (8), 2290-2296 (2006).
  32. Simonini, C., et al. Neurodegenerative and neuroinflammatory changes in SOD1-ALS patients receiving tofersen. Sci Rep. 15 (1), 11034(2025).
  33. Naseri Kouzehgarani, G., et al. Harnessing cerebrospinal fluid circulation for drug delivery to brain tissues. Adv Drug Deliv Rev. 173, 20-59 (2021).
  34. Duan, C., et al. Intrathecal administration of a novel siRNA modality extends survival and improves motor function in the SOD1(G93A) ALS mouse model. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (1), 102147(2024).
  35. Miller, T. M., et al. Trial of antisense oligonucleotide tofersen for SOD1 ALS. N Engl J Med. 387 (12), 1099-1110 (2022).
  36. McCampbell, A., et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. J Clin Invest. 128 (8), 3558-3567 (2018).
  37. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. (75), e50326(2013).
  38. Bhusal, A., Suk, K. Protocol for delivering proteins, peptides, and shRNAs via the intrathecal route in the experimental allergic encephalomyelitis mouse model. STAR Protoc. 5 (3), 103219(2024).
  39. Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. Epidural and intrathecal drug delivery in rats and mice for experimental research: fundamental concepts, techniques, precaution, and application. Biomedicines. 11 (5), 1413(2023).
  40. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  41. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
  42. Law, V., et al. A murine Ommaya xenograft model to study direct-targeted therapy of leptomeningeal disease. J Vis Exp. (167), e62033(2021).
  43. Christensen, J., Li, C., Mychasiuk, R. Choroid plexus function in neurological homeostasis and disorders: the awakening of the circadian clocks and orexins. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (7), 1163-1175 (2022).
  44. Wu, W., et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).
  45. Shi, L., et al. Repeated intrathecal administration of plasmid DNA complexed with polyethylene glycol-grafted polyethylenimine led to prolonged transgene expression in the spinal cord. Gene Ther. 10 (14), 1179-1188 (2003).
  46. Linninger, A. A., Barua, D., Hang, Y., Iadevaia, S., Vakilynejad, M. A mechanistic pharmacokinetic model for intrathecal administration of antisense oligonucleotides. Front Physiol. 14, 1130925(2023).
  47. Chen, Y., et al. Intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system. J Vis Exp. 152, e60274(2019).
  48. Molnar-Kasza, A., et al. Evaluation of neuropathological features in the SOD1-G93A low copy number transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Front Mol Neurosci. 14, 681868(2021).
  49. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  50. Une, M., et al. SOD1-interacting proteins: roles of aggregation cores and protein degradation systems. Neurosci Res. 170, 295-305 (2021).
  51. Gidaro, T., Servais, L. Nusinersen treatment of spinal muscular atrophy: current knowledge and existing gaps. Dev Med Child Neurol. 61 (1), 19-24 (2019).
  52. Hoy, S. M. Nusinersen: first global approval. Drugs. 77 (4), 473-479 (2017).
  53. Metz, T., et al. Biodistribution of radioactively labeled splice-modulating antisense oligonucleotides after intracerebroventricular and intrathecal injection in mice. Nucleic Acid Ther. 34 (1), 26-34 (2024).
  54. Adank, D. N., et al. Comparative intracerebroventricular and intrathecal administration of a nanomolar macrocyclic melanocortin receptor agonist MDE6-5-2c (c[Pro-His-DPhe-Arg-Trp-Dap-Ala-DPro]) decreases food intake in mice. ACS Chem Neurosci. 11 (19), 3051-3063 (2020).
  55. Sharma, A., et al. Multiple doses of cell therapy and neurorehabilitation in amyotrophic lateral sclerosis: a case report. Clin Pract. 10 (3), 1242(2020).
  56. Modol-Caballero, G., et al. Gene therapy overexpressing neuregulin 1 type I in combination with neuregulin 1 type III promotes functional improvement in the SOD1(G93A) ALS mice. Front Neurol. 12, 693309(2021).

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