在地吉顿素通透化的BE（2）-C神经母细胞中，依赖胆碱能配体的氧化磷酸化偶联调节

Summary

我们提出了一种选择性通透性质膜的方案，使底物和抑制剂能够靶向递送，以评估培养细胞中的线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），克服通常阻碍此类分析的质膜运输障碍。利用该技术，我们展示了OXPHOS功能如何被毒蕈碱激动剂和拮抗剂调节。

Abstract

本研究旨在利用定义的底物-抑制剂组合评估培养细胞中氧化磷酸化（OXPHOS）的功能，同时保留分离线粒体制剂中丢失的细胞结构和细胞质上下文。由于完整细胞对若干Krebs循环中间体的渗透性较差，直接评估通过特定电子传递链（ETC）进入点的底物支持呼吸能力有限。为克服这一问题，我们应用了地吉酮介导的选择性质膜通透，并在BE（2）-C神经母细胞中进行了基于细胞外通量分析仪的耦联和电子流测定。为确定细胞类型依赖性，地吉托宁在HEK293细胞和大鼠原发性背根神经节（DRG）神经元中使用琥珀酸+视烯酮经验滴定，分离出II–IV复合体驱动的呼吸。

在复合体I抑制下，采用琥珀酸支持呼吸，通透细胞中由复合体II–IV驱动的氧气消耗量增加，与膜非渗透底物对线粒体访问能力增强的表现相符。相比之下，由通过内源性运输途径进入的底物（如丙酮酸/苹果酸）支持的呼吸，在不同条件下差异较小。利用该平台测试毒蕈碱配体，我们在偶联测定中观察到激动剂与拮抗剂相关的氧气消耗差异，而电子流测定在测试条件下配体相关效应较小。这些发现表明，在耦合定义的呼吸状态层面，可检测配体效应比最大电子转移能力更为显著。总体而言，选择性通透化扩大了培养细胞生物能量检测中底物的可及性，并使得分析线粒体呼吸的药理调控成为可能。

Introduction

线粒体能量代谢的功能失调或重编程是多种疾病的核心，包括神经退行性疾病、癌症、炎症性疾病、心血管代谢疾病以及各种遗传性疾病。为了更好地理解线粒体代谢在疾病发病机制中的作用，已开发出多种分析策略。这些包括_氧气消耗速率（OCR）、细胞外酸化速率（ECAR）、抗物质定量、底物利用、剖析或克雷布斯循环代谢物分析，以及同位素追踪¹。在这些技术中，OCR是线粒体呼吸的关键指标，可以通过高分辨率呼吸仪（HRR;例如Oroboros O₂k）²、Clark型电极或胞外通量分析仪等仪器进行评估

Oroboros O₂k 系统利用克拉克型极光_{摄氧传感器}（POS）^3,4,5 测量密封腔_室内的氧气浓度，适用于分离的线粒体、渗透细胞和组织均质体等样品。它由一个金/铂正极、一个银阳极和一个KCl电解质储层组成，这些储液库与样品之间由一层25微_米氧气渗透且耐化学的氟化乙烯丙烯膜（FEP）隔开。克拉克型电极³也在密闭腔室内工作，通过_对氧敏感电极_检测氧气浓度变化，常用于隔离的线粒体或细胞悬浮液。相比之下，细胞外通量分析仪通过嵌入微板中的荧光传感器，在活的粘附细胞或分离线粒体中量化OCR和ECAR，实现高通量代谢剖析。胞外通量分析仪平台的一个实用优势是能够在多种条件下实现自动化、多参数并行评估，而封闭腔室系统（如HRR或Clark型电极）通常通量较低，且需要更多手动操作。

细胞外通量分析仪特别适合评估完整粘附细胞或悬浮细胞在微板底部的线粒体功能。在使用完整粘附细胞的检测中，线粒体能量代谢可以通过葡萄糖或丙酮酸⁶等底物进行分析。或者，使用少量富集线粒体分数的检测法，可以依次测量基础呼吸、ADP刺激呼吸（状态3）、静息呼吸（状态4）以及利用底物和抑制剂组合进行无偶联刺激呼吸的连续^测量7。然而，在完整细胞系统中，非细胞通透性的三羧酸（TCA）循环代谢产物无法直接评估其代谢情况。而分离的线粒体因缺乏质膜屏障而允许使用此类代谢物。分离富集线粒体生物能量学分析方法存在局限性：线粒体结构在分离过程中可能发生变化，且影响线粒体代谢和代谢物运输的细胞质因子减少或缺失。因此，选择性渗透方法常被用作折中方案，既保留细胞结构的某些方面，又实现线粒体的受控访问。为克服使用完整细胞或分离线粒体进行代谢检测的局限，本方案描述了一种利用地吉托宁渗透粘附性神经母细胞瘤（BE（2）-C） 细胞的方法。这种方法促进了非细胞渗透代谢物通过质膜的导入，同时保持对特定底物和抑制剂的功能性线粒体反应。

地基酮素的选择性基于膜脂质成分的差异：质膜胆固醇丰富，而线粒体膜——尤其是内线粒体膜——胆固醇含量极^低。在低浓度下，地吉酮素（或皂苷）因其高胆固醇含量而选择性且完全渗透质膜，而线粒体膜仅在高浓度下受影响，^9,10。去吉顿素与胆固醇结合，在质膜上形成孔隙，使得像TCA循环中间体这样的小分子在优化得当时能够进入细胞质而不破坏线粒体结构或功能。该方法最适合可重复地作为附着单分子层在细胞外通量分析仪微板中进行基层化的培养细胞，并需对每种细胞类型和种子密度进行地吉酮素浓度的经验滴定。线粒体完整性保持的操作指标包括强健且对抑制剂敏感的OCR反应（例如，使用罗酮/抗霉素A时预期下降，以及抗坏血酸/TMPD下IV控制呼吸正常），以及没有OCR塌陷，从而表明过度渗透。因此，应在实验比较前进行digitonin优化，并在培养条件或细胞密度变化时重复进行。此外，最佳地微素浓度因细胞类型而异，必须通过经验确定，以建立一个允许非底物（如琥珀酸盐）进入的渗透窗口，同时保持对抑制剂敏感的线粒体功能。本研究通过优化BE（2）-C细胞中的digitonin，以及HEK293细胞和大鼠原发背根神经节（DRG）神经元来说明这一原理。

该方案通过BE（2）-C神经母细胞瘤细胞进行了验证，这些细胞最初从一名男性神经母细胞瘤患者的大脑中分离出来。BE（2）-C细胞表达多种毒蕈碱受体，尤其是胆碱能受体——毒蕈碱1型（CHRM1）。在我们之前的研究中，我们证明CHRM1与培养大鼠背根神经节神经元细胞体和神经元中的线粒体相关，同时也存在于CHRM1转染的HEK293^细胞中。此外，小鼠中Chrm1的遗传缺失会改变线粒体结构和功能的多个方面（^12,13）。因此，我们假设BE（2）-C细胞可用于研究毒蕈碱配体对OXPHOS功能的调节作用。在本演示中，我们考察了毒蕈碱药物——包括激动剂乙酰胆碱、偏倚受体拮抗剂吡烯丙醇¹⁴和受体拮抗剂阿托品——在琥珀酸或丙酮酸/苹果酸基质作为底物存在下对线粒体呼吸的影响，并比较了它们的影响。

Protocol

1. 解冻与初始电镀

注意：BE（2）-C细胞的基础培养基为ATCC配方的Eagle's最小必需培养基和F12培养基的1：1混合，辅以10%胎儿牛血清（FBS）。

1. 在37°C的水浴中解冻冷冻的BE（2）-C细胞。解冻后，用200× 克 离心机离心5分钟，去除低温保护剂。
2. 将细胞沉淀重新置于完全培养基中，并将细胞置于10厘米细胞培养皿中。在37°C的加湿培养箱中，空气中含5%二氧化碳，培养至细胞达到亚汇聚状态。

2. 亚文化

1. 对细胞进行2–3次传代亚培养，以确保其达到稳定的指数生长阶段。

3. 胰蛋白酶化与单细胞悬浮液制备

1. 当培养液达到60–80%的汇聚度时，对细胞进行胰蛋白酶化。将细胞悬浮液多次通过细尖转移移液器，带抛光头，以解离团块，实现单细胞悬浮。
2. 加入含有FBS的新鲜培养基以中和胰蛋白酶。用200× 克 离心机分离细胞5分钟，使其沉淀。

4. 用于细胞外通量分析仪的24孔细胞培养微板的细胞播种协议

1. 将沉淀物重新悬浮于完整培养基中，最终浓度为每孔每孔100微升10,000个细胞。
2. 以最佳密度播种细胞，确保它们在1–2天内完全融合。根据实验设计，四个角井或单角井保持空置。这些井将作为背景控制。
   注意：这可能需要反复试验，包括调整媒体音量和时间。
3. 监测培养基颜色的变化——黄化表示pH值下降，需立即更换新培养基以维持细胞健康。

5. 基于细胞外通量分析仪的制备

注意：本处所用的偶联和电子流测定格式遵循已建立的基于微板的线粒体呼吸流程⁷，并进行了修改，包括通过地微素滴定和毒蕈碱配体处理条件对BE（2）-C细胞进行渗透化。

1. 准备库存溶液和2个线粒体测定溶液（MAS）。提前准备2份MAS混合物和工作试剂（底物和抑制剂）库存溶液（见 表1、 表2和 表3）。
2. 所有存料溶液和MAS都储存在-20°C以备未来使用，从而实现高效的检测设置。
   安全性： 罗酮、抗霉素A、寡霉素、FCCP、地微素和TMPD均有危险性，应按照机构安全指南处理。所有抑制剂库存溶液应在认证的化学熏蒸柜中准备和处理，同时佩戴适当的个人防护装备（实验服、丁腈手套和护目镜）。含有这些试剂的溶液以及含DMSO的废物应按照机构和地方法规收集并作为有害化学废物处置。使用后应对工作表面进行除污处理。
3. 给传感器滤芯加水
   1. 实验前一晚，向每个阱中加入1毫升传感器滤芯校准缓冲液或磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH 7.4）来补水细胞外通量分析仪传感器筒。让传感器筒在室温（20–25°C）下静置一夜（12–18小时）。
      注意：在非二氧化碳培养箱中37°C孵育并非必要，因为装载过程中弹匣会平衡至室温。一旦放入细胞外通量分析仪进行校准，试筒将在大约15分钟内达到37°C。

6. 实验当天

注意：所有溶液都应新鲜准备，必要时调整pH值，并在使用前保持冰镇保存。

1. 将冷冻基材和2枚MAS在室温（20–25°C）下解冻15–30分钟，或在37°C水浴中解冻5–10分钟。
2. 准备所有底物和注射液（见 表4、 表5、 表6和 表7），并确认pH值为7.4。必要时调整，并把溶液冰着保存，直到使用。使用 表4 和 表5 进行偶联测定。电子流测定请使用 表6 和 表7。
3. 将抑制剂和底物装入相应的传感器卡带端口，准备进行检测。根据检测类型——耦合测定还是电子流分析 ⁷ ——可根据需要分别参考 表4 和 表5 ，或 表6 和 表7。
4. 将所有底物和抑制剂工作液准备到确定的最终体积（大宗混合：15 mL;卡匣注射混合物：每个端口2 mL）。计算浓度以达到注注后期望的最终井内浓度（最终井体积：D口后700微升）。
5. 在含有毒蕈碱配体的24孔细胞外通量分析板的每个孔中加入450微升的制备检测液（最终配体浓度：1微米;总孔体积：500微升）。确保每个井已包含50微升1xMAS缓冲液和浸没单元。
   注意：在将板材装入分析仪之前，请立即执行此步骤。
6. 将每种制备试剂50微升装入传感器筒对应的注射口。

7. 仪器编程与检测执行

1. 实验前至少1–2小时开启胞外通量分析仪，使内部培养箱稳定在37°C。 在整个校准和检测运行过程中，保持室温在37°C。
2. 根据 表8，编程分析仪执行适当的混合、等待和测量循环。
3. 根据实验设计在软件中标记井和实验组。
4. 开始检测运行。让仪器校准传感器匣（~15分钟）。
5. 在卡带校准时准备装填测定板。如有需要，延迟装填;传感器筒在仪器内部保持稳定在37°C。
6. 在D端口注入后的最终测量周期结束后完成检测。立即进行测定后归一化和数据分析。

8. 细胞板用于细胞外通量分析仪分析

1. 将传感器卡带放入分析仪进行校准后，立即开始准备电池板。每个含有粘附细胞的孔中加入700微升1x MAS缓冲液。在室温（20–25°C）下孵育1分钟。
2. 小心抽吸缓冲液，避免扰动附着的细胞。重复洗涤步骤至少3×1分钟，去除残留培养基，并在10分钟内完成所有洗涤。
3. 在指定背景槽（无单元）添加50微升1倍MAS缓冲液以建立视觉体积参考。
4. 从实验井中抽取缓冲液，每孔留约50微升残余缓冲液。
5. 将平板在37°C的水浴中孵育，保持平板在水面以上以防止蒸发。在装载前保持37°C温度10分钟（最长20分钟）。
6. 在装载板材前，向每个孔加入450微升含有适当底物的1x次MAS缓冲液，达到最终500微升的体积。
7. 将板块插入胞外通量分析仪。

9. 结束检测与数据分析

1. 运行完成后，将细胞板和传感器筒从分析仪中取出。
2. 使用总蛋白定量或总细胞计数对每井的OCR值进行归一化。用RIPA缓冲液裂解细胞，使用Bradford测定或其他光谱光度蛋白测定法定量总蛋白。
3. 使用分析软件对OCR值进行归一化，并根据需要导出数据。
4. 应用以下验收标准：确认基线OCR稳定性（连续两次测量周期中≤15%漂移），并确认注射罗酮、寡霉素或抗霉素A后OCR降低≥60%。
5. 排除不符合这些标准的运行，并根据需要重新优化渗透剂浓度或细胞播种密度。

10. 输出结果

1. 插入一个USB驱动器到乐器中。
2. 导出检测数据。

11. 数据处理

1. 使用仪器软件分析数据。
2. 导出处理后的数据，格式兼容所选分析软件，以便进一步分析和可视化。

Results

在偶联测定中，BE（2）C细胞渗透性中地微粒蛋白浓度的优化
在该方案开始时，我们标准化了有效细胞通透性所需的最佳digitonin浓度，同时不影响线粒体呼吸。在该方案中，我们测试了5 μM和10 μM的digitonin作为起始浓度，并进行了偶联测定。该检测法评估ETC与OXPHOS机制之间的耦合程度，使我们能够区分ETC驱动和OXPHOS驱动的呼吸。使用罗酮抑制复合物I，而肉桂酸作为复合物II的电子供体，推动电子通过复合物II流向IV，_支持氧气消耗（见图1A）。由II–IV复合体介导的基底呼吸在10 μM的digitonin中显著高于5 μM，表明在高浓度下，粘果酸通过渗透细胞膜的运输效率更高（见图1A，B）。需要注意的是，最初的检测每孔使用了5×10个⁴单元。鉴于10微米地地铁素提供了最佳的渗透性，我们随后将细胞数减少为每孔2×10...

Discussion

本研究引入了一种快速且经济高效的方案，用于评估培养神经母细胞瘤中毒蕈碱配体介导OXPHOS调节的效果。通过结合选择性质膜渗透剂digitonin，结合定义的底物-抑制剂对，我们实现了如肉煴酸酯等代谢底物的靶向直接送达线粒体 的原位。这种方法克服了完整细胞膜的限制，后者通常限制了关键TCA循环中间体的获取。重要的是，该方案保留了细胞结构和细胞质相互作用，为评估线粒体在各种实验条件下的功能提供了生理学相关的平台，包括与神经退行性疾病模型相关的药物治疗。

成功的关键因素是针对特定细胞类型和播种密度对地铁素浓度进行经验优化。支持这种细胞类型依赖性，我们观察到最佳的digitonin浓度在不同细胞类型间存在显著差异。例如，HEK293细胞在约15 μM的digitonin处表现出最大由琥珀酸支持的II–IV复合体呼吸，而培养的大鼠DRG神经元在~10 μM处表现出最佳响应。这些观察进一步表明，地吉托宁必须针对每种细胞类型和种子密度进行经验滴定，以确保选择性渗透而不损害线粒体完整性。可接受的通透性表现为对非细...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
乙酰胆啧氯化物	米利波尔西格玛	A6625	毒蕈碱激动剂
ADP	MP生物医学公司	ICN19014901	电子受体，ATP合成的底物。
抗霉素A	AAJ63522MA	热力科学	抑制线粒体复合体III
阿托品	米利波尔西格玛	1044990	毒蕈碱拮抗剂
Be2C细胞	美国字体文化收藏	CRL-2268	从一名男性神经母细胞瘤患者大脑中分离出的神经母细胞表达毒蕈碱受体
去码托宁	米利波尔西格玛	D141	温和的洗涤剂，膜渗透剂。
D-甘露醇	热力科学化学	AA3334236	一种不可代谢的糖醇，用于渗透稳定和膜保护
EGTA	米利波尔西格玛	E0396	钙螯合，防止钙依赖性蛋白酶及其他可能降解线粒体蛋白的酶被激活。
无脂肪酸BSA	米利波尔西格玛	126575	防止脂肪酸失控影响，稳定线粒体
FCCP	开曼化学	NC0904863	线粒体中氧化磷酸化的原质载体和解偶
天哪	米利波尔西格玛	391340	pH缓冲与线粒体功能的兼容性
L-抗坏血酸	TCI美国	A053925G	TCA循环中间体，OXPHOS底物
氯化镁	米利波尔西格玛	M8266	为了离子平衡，支持酶活性
N1，N1，N1，N1，N1-四甲基-1,4-苯二胺（TMPD）			电子供体到细胞色素c，通过绕过复合物I和II评估复合IV功能，TMPD/抗坏血酸可直接测量复杂IV依赖性氧气消耗
寡霉素	米利波尔西格玛	1404-19-9	抑制线粒体ATP合成，复合体V
盐酸吡哧	米利波尔西格玛	P7412	毒蕈碱偏置激动剂
丙酮酸	热力科学化学	AC132155000	TCA循环基底
罗酮	米利波尔西格玛	557368	抑制线粒体复合体I
Seahorse XF24 V7 PS 细胞培养微板	安捷伦	102340-100	细胞培养微板
Seahorse XFe24分析仪	安捷伦	S7801BR	安捷伦Seahorse XFe24分析仪以24孔板格式测量活细胞的氧气消耗率（OCR）和细胞外酸化速率（ECAR）。
琥珀酸	费舍尔化学	AC158742500	TCA循环中间体，OXPHOS底物
XFe24传感器卡带校准缓冲器	安捷伦	102340100	PBS缓冲液pH 7.2
XFe24传感器卡带	安捷伦	102340-100	用于OCR和ECAR测量的传感器