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研究文章

胆碱能配体依赖性调节Digitonin透化的BE(2)-C神经母细胞瘤细胞中的氧化磷酸化偶联

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DOI：

10.3791/69789

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2026年4月28日

 , 
1Department of Psychology and Neuroscience, College of Psychology, Nova Southeastern University, 2Capillus

本文内容

摘要

我们提出了一种选择性通透细胞质膜的实验方案，可实现底物和抑制剂的靶向递送，从而在培养细胞中评估线粒体氧化磷酸化（OXPHOS），克服了通常阻碍此类分析的质膜转运屏障。利用该技术，我们展示了OXPHOS功能如何受到毒蕈碱受体激动剂和拮抗剂的调节。

摘要

本研究的目的是利用特定的底物-抑制剂组合，在保留分离线粒体制备过程中所丢失的细胞结构和胞质环境的前提下，评估培养细胞中的氧化磷酸化（OXPHOS）功能。由于完整细胞对多种三羧酸循环中间产物的通透性较差，因此难以直接评估通过特定电子传递链（ETC）入口支持的呼吸作用。为克服这一限制，我们采用皂苷介导的选择性质膜透化方法，并在BE(2)-C神经母细胞瘤细胞中进行基于细胞外通量分析仪的偶联和电子流测定。为确定细胞类型依赖性，我们在HEK293细胞和原代大鼠背根神经节（DRG）神经元中，使用琥珀酸盐+鱼藤酮来分离复合体II–IV驱动的呼吸作用，并据此对皂苷浓度进行经验性滴定。

在复合物I被抑制的条件下，以琥珀酸为底物支持的呼吸作用显示，与非透化细胞相比，透化细胞中由复合物II–IV驱动的氧气（O₂）消耗增加，这与膜不通透性底物更易进入线粒体的结果一致。相比之下，由通过内源性转运途径进入细胞的底物（如丙酮酸/苹果酸）支持的呼吸作用在不同条件下差异较小。利用该平台测试毒蕈碱受体配体时，我们在偶联测定中观察到激动剂与拮抗剂在O₂消耗上的差异，而电子流测定则在测试条件下显示配体相关效应极小。这些结果表明，在偶联定义的呼吸状态水平上，可检测到的配体效应比在最大电子传递能力水平上更为显著。总体而言，选择性透化可扩展培养细胞生物能量学测定中底物的可及性，并实现对线粒体呼吸药理学调节作用的分析。

引言

线粒体能量代谢的功能障碍或重编程与多种疾病密切相关，包括神经退行性疾病、癌症、炎症性疾病、心脑代谢性疾病以及各类遗传性疾病。为了深入理解线粒体代谢在疾病发病机制中的作用，研究人员已开发出多种分析策略。这些策略包括对氧气消耗2 消耗速率（光学字符识别），细胞外酸化率（ECAR），ATP 定量，底物利用，代谢谱分析或 Krebs 循环 循环代谢物分析，同位素示踪1在这些技术中，OCR 是线粒体呼吸的关键指标，可使用高分辨率呼吸测定仪（HRR；例如 Oroboros O2k)2，克拉克型电极，或细胞外通量分析仪

Oroboros O2k 系统测量 O2 使用克拉克型电化学氧传感器在密闭室中测定浓度2 传感器（POS）3,4,5 适用于分离的线粒体、透化细胞和组织匀浆等样品。该装置由一个金/铂阴极、一个银阳极以及一个通过25 µm O2 可渗透且耐化学腐蚀的氟化乙烯丙烯膜（FEP）FEP）。克拉克型电极3 同样在密闭腔室中运行，检测O的变化2 通过 O 浓度2-敏感电极，常用于分离的线粒体或细胞悬液。相比之下，细胞外通量分析仪利用嵌入微孔板中的荧光传感器，对活体贴壁细胞或分离线粒体的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）进行定量，从而实现高通量的代谢谱分析。 细胞外通量分析平台的一个实际优势是能够并行地对多种条件进行自动化、多参数评估，而封闭式反应室系统（如高分辨率呼吸测定系统或克拉克型电极）通常通量较低，且需要更多的人工操作。

细胞外通量分析仪特别适用于评估贴壁完整细胞或沉降到微孔板底部的悬浮细胞中的线粒体功能。在使用贴壁完整细胞的检测中，可通过葡萄糖或丙酮酸等底物对线粒体能量代谢进行分析6。 alternatively，使用少量富集的线粒体组分进行检测，可依次测定基础呼吸、ADP刺激的呼吸（状态3）、静息呼吸（状态4）以及解偶联剂刺激的呼吸，这些测定依赖于底物与抑制剂的组合7。然而，在完整细胞系统中，无法穿透细胞膜的三羧酸（TCA）循环代谢物不能直接用于评估其代谢情况。由于分离的线粒体不存在质膜屏障，因此可使用此类代谢物。但分离富集线粒体进行生物能量学分析存在局限性：线粒体结构可能在分离过程中发生改变，且影响线粒体代谢和代谢物转运的胞质因子可能减少或缺失。因此，选择性透化方法常被用作折中方案，既保留部分细胞结构特征，又可实现对线粒体的可控访问。为克服使用完整细胞或分离线粒体进行代谢检测的局限性，本实验方案描述了一种利用皂苷（digitonin）对贴壁神经母细胞瘤（BE(2)‑C)细胞进行透化的方法。该方法可促进原本不能穿透细胞膜的代谢物进入细胞质，同时维持线粒体对特定底物和抑制剂的功能性响应。

皂苷元（digitonin）的选择性基于细胞膜脂质组成的差异：质膜富含胆固醇，而线粒体膜——尤其是线粒体内膜——所含胆固醇极少8。在低浓度下，由于质膜胆固醇含量高，皂苷元（或皂苷类物质）可选择性且完全地使其通透化，而线粒体膜仅在较高浓度下才会受到影响9,10。皂苷元与胆固醇结合并在质膜上形成孔道，允许三羧酸循环中间产物等小分子进入胞质溶胶，同时在优化条件下不破坏线粒体的结构与功能。该方法最适合可重复接种为贴壁单层细胞的培养细胞，并需针对每种细胞类型和接种密度进行皂苷元浓度的经验性滴定。线粒体完整性保持的操作性指标包括：显著且受抑制剂敏感的氧耗率（OCR）反应（例如，使用鱼藤酮/抗霉素A后出现预期的下降，以及抗坏血酸/TMPD驱动的复合体IV功能完整的呼吸作用），同时无OCR崩溃现象，后者提示过度通透化。因此，在进行实验比较前应完成皂苷元的优化，并在培养条件或细胞密度发生任何变化时重复该过程。此外，最佳皂苷元浓度因细胞类型而异，必须通过实验确定，以建立一个允许不通透性底物（如琥珀酸）进入、同时维持抑制剂敏感性线粒体功能的通透化窗口。在本研究中，我们通过在BE(2)-C细胞、HEK293细胞以及原代大鼠背根神经节（DRG）神经元中优化皂苷元浓度，展示了这一原则的应用。

本方案使用 BE(2)-C 神经母细胞瘤细胞进行演示，该细胞系最初来源于一名患有神经母细胞瘤的男性患者的脑组织。BE(2)-C 细胞表达多种毒蕈碱型受体，尤其是胆碱能受体毒蕈碱型1（CHRM1）。在我们之前的研究中，我们已证明 CHRM1 在培养的大鼠背根神经节神经元的胞体和神经突中均与线粒体相关，同时也在转染 CHRM1 的 HEK293 细胞中观察到类似现象11。此外，小鼠中 Chrm1 基因的缺失会改变线粒体结构和功能的多个方面12,13。因此，我们假设 BE(2)-C 细胞可用于研究毒蕈碱配体对氧化磷酸化（OXPHOS）功能的调节作用。在本实验中，我们检测了多种毒蕈碱药物——包括激动剂乙酰胆碱、具有偏向性的拮抗剂匹仑齐平14以及拮抗剂阿托品——在线粒体呼吸中的作用，实验分别以琥珀酸或丙酮酸/苹果酸作为底物，并比较了这些药物的作用效果。

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方案

1. 解冻与初始铺板

注意：BE(2)-C 细胞的基础培养基为 ATCC 配方的 Eagle 最低必需培养基与 F12 培养基按 1:1 混合，并添加 10% 胎牛血清（FBS）。

  1. 将冻存的 BE(2)-C 细胞从冻存管中取出，在 37 °C 水浴中解冻。解冻后，以 200 × g 离心 5 分钟，去除冻存保护剂。
  2. 用完全培养基重悬细胞沉淀，并将细胞接种至 10 cm 细胞培养皿中。将培养物置于含 5% CO₂ 的湿润化培养箱中，于 37 °C 培养，直至细胞达到亚汇合状态。

2. 传代培养

  1. 将细胞传代培养2–3代，以确保其进入稳定的指数生长期。

3. 胰蛋白酶消化与单细胞悬液制备

  1. 当细胞培养至60–80%融合度时，用胰蛋白酶消化细胞。使用尖端光滑的细口移液管反复吹打细胞悬液，以解离细胞团块，获得单细胞悬液。
  2. 加入含胎牛血清（FBS）的新鲜培养基以中和胰蛋白酶。在200 × g 条件下离心5分钟，使细胞沉淀。

用于细胞外通量分析仪的24孔细胞培养微孔板细胞接种方案

  1. 将沉淀重悬于完全培养基中，最终浓度为每孔 100 µL 含 10,000 个细胞。
  2. 以优化的密度接种细胞，确保细胞在 1–2 天内达到完全汇合。根据实验设计，留出四个角孔或一个角孔不接种细胞，作为空白对照。
    注意：此过程可能需要反复尝试，包括对培养基体积和换液时间进行调整。
  3. 观察培养液颜色变化——培养基变黄提示 pH 下降，需立即更换新鲜培养基以维持细胞健康。

5. 基于细胞外通量分析仪检测的准备工作

注意：此处使用的偶联和电子传递测定方法遵循既定的基于微孔板的线粒体呼吸作用实验流程7，并进行了若干修改，包括采用毛地黄皂苷滴定法对BE(2)-C细胞进行透化处理，以及毒蕈碱受体配体处理条件。

  1. 配制储备液和2倍浓缩的线粒体检测溶液（MAS）。提前配制2倍MAS混合液以及工作试剂（底物和抑制剂）的储备液（见表1、表2和表3）。
  2. 将所有储备液和MAS储存于-20 °C，以备后续使用，便于高效进行检测。
    ​安全提示：鱼藤酮、抗霉素A、寡霉素、FCCP、皂苷和TMPD具有危害性，应按照机构安全指南操作。所有抑制剂储备液的配制和操作均应在经认证的化学通风橱内进行，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、腈类手套和眼部防护装置）。含有这些试剂的溶液以及含DMSO的废弃物应收集并根据机构和当地法规作为危险化学废物处理。使用后应对工作台面进行去污处理。
  3. 传感器微孔板的水化
    1. 实验前一晚，在每个孔中加入1 mL传感器微孔板校准缓冲液或磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），以水化细胞外通量分析仪的传感器微孔板。将传感器微孔板在室温（20–25 °C）下静置过夜（12–18小时）。
      ​注意：无需在37 °C的无CO₂培养箱中孵育，因为在加载过程中微孔板将自然平衡至室温。一旦放入细胞外通量分析仪进行校准，微孔板将在约15分钟内达到37 °C。

6. 实验当天

注意：所有溶液均需新鲜配制，必要时调节 pH，并在使用前置于冰上保存。

  1. 在室温（20–25 °C）下解冻冷冻的底物储备液和2x MAS，持续15–30分钟，或在37 °C水浴中解冻5–10分钟。
  2. 配制所有底物和注射溶液（参见表4、表5、表6和表7），并确认pH值为7.4。必要时进行调节，并将溶液置于冰上直至使用。进行偶联实验时，请参考表4和表5；进行电子传递实验时，请参考表6和表7。
  3. 将抑制剂和底物加入相应的传感器微孔板端口，并准备开始实验。根据实验类型——偶联实验或电子传递实验7——分别参考表4和表5，或表6和表7，按需操作。
  4. 将所有底物和抑制剂工作溶液配制为指定的终体积（批量混合液：15 mL；微孔板注射混合液：每端口2 mL）。计算浓度，以确保注射后达到目标孔内终浓度（D端口注射后孔内总体积：700 µL）。
  5. 将450 µL配制好的实验溶液加入含有毒蕈碱配体的24孔细胞外通量分析板的每个孔中（最终配体浓度：1 µM；孔内总体积：500 µL）。确保每个孔中已含有50 µL的1x MAS缓冲液以及浸没的细胞。
    注意：此步骤应在将分析板装入仪器前立即进行。
  6. 将每种配制好的试剂各50 µL加入传感器微孔板相应的注射端口中。

7. 仪器编程与检测执行

  1. 在实验开始前至少1–2小时开启细胞外通量分析仪，使仪器内部培养箱温度稳定在37 °C。在整个校准过程和检测运行期间，保持腔室温度为37 °C。
  2. 根据表8设置分析仪程序，执行相应的混匀、等待和检测循环。
  3. 根据实验设计，在软件中对孔板和实验分组进行标记。
  4. 启动检测运行，使仪器对传感器微孔板进行校准（约15分钟）。
  5. 在校准传感器微孔板的同时准备检测用板并加样；如需延迟加样，传感器微孔板可在仪器内37 °C条件下保持稳定。
  6. 当D孔注射后的最后一次检测循环完成后，检测结束。立即进行检测后标准化处理和数据分析。

8. 细胞板制备用于胞外通量分析仪检测

  1. 将传感器微孔板放入分析仪进行校准后，立即开始准备细胞板。向含有贴壁细胞的每个孔中加入 700 µL 的 1x MAS 缓冲液。在室温（20–25 °C）下孵育 1 分钟。
  2. 小心吸除缓冲液，避免扰动贴壁细胞。重复洗涤步骤至少 3 次，每次 1 分钟，以去除残留的培养基，并在 10 分钟内完成所有洗涤。
  3. 向指定的背景孔（无细胞）中加入 50 µL 的 1x MAS 缓冲液，以建立可视化的体积参考。
  4. 吸除实验孔中的缓冲液，每个孔中保留约 50 µL 的残留缓冲液。
  5. 将细胞板置于水浴中 37 °C 孵育，保持细胞板位于水面以上以防止蒸发。在上机前维持 37 °C 孵育 10 分钟（最长不超过 20 分钟）。
  6. 在即将上机前，向每个孔中加入 450 µL 含有适当底物的 1x MAS 缓冲液，使最终体积达到 500 µL。
  7. 将细胞板插入细胞外通量分析仪中。

9. 实验结束与数据分析

  1. 运行结束后，从分析仪中取出细胞板和传感器盒。
  2. 根据总蛋白定量或总细胞数对每个孔的耗氧率（OCR）值进行归一化。使用RIPA缓冲液裂解细胞，并通过Bradford法或其他分光光度法蛋白测定方法定量总蛋白。
  3. 使用分析软件对OCR值进行归一化处理，并按需导出数据。
  4. 应用以下接受标准：确认基础OCR稳定性（连续两个测量周期内漂移≤15%），并确认在注射鱼藤酮、寡霉素或抗霉素A后OCR降低≥60%。
  5. 排除不符合上述标准的运行结果，并根据需要重新优化透化剂浓度或细胞接种密度。

10. 导出结果

  1. 将U盘插入仪器。
  2. 导出检测数据。

11. 数据处理

  1. 使用仪器配套软件分析数据。
  2. 将处理后的数据导出为与所选分析软件兼容的格式，以便进一步分析和可视化。

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结果

耦合实验中 BE(2)C 细胞透化所需皂苷素浓度的优化
在本实验方案开始阶段，我们对实现有效细胞透化同时不损害线粒体呼吸功能所需的最优皂苷素浓度进行了标准化确定。在本方案中，我们以 5 µM 和 10 µM 皂苷素作为起始浓度进行测试，并开展了耦合实验。该实验用于评估电子传递链（ETC）与氧化磷酸化（OXPHOS）系统之间的耦合程度，使我们能够区分由 ETC 和 OXPHOS 驱动的呼吸作用。实验中使用鱼藤酮抑制复合体 I，而以琥珀酸作为电子供体作用于复合体 II，驱动电子从复合体 II 经 III 至 IV 的传递，从而支持 O2 的消耗（图 1A）。在 10 µM 皂苷素条件下，由复合体 II–IV 介导的基础呼吸显著高于 5 µM 条件，表明较高浓度下琥珀酸透过透化细胞膜的转运效率更高（图 1A，B）。需要注意的是，初始实验每孔使用了 5 × 104 个细胞。鉴于 10 µM 皂苷素可实现最佳透...

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讨论

本研究介绍了一种快速且经济高效的方案，用于评估毒蕈碱配体对培养神经母细胞瘤细胞中氧化磷酸化（OXPHOS）的调节作用。通过使用选择性细胞膜透化剂皂苷（digitonin），并结合特定的底物-抑制剂组合，我们实现了将琥珀酸等代谢底物直接靶向递送至线粒体 原位该方法克服了完整细胞膜通常限制关键三羧酸（TCA）循环中间产物获取的局限性。重要的是，该方案保留了细胞结构和胞质内的相互作用，为在多种实验条件下（包括与神经退行性疾病模型相关的药物处理）评估线粒体功能提供了一个具有生理相关性的研究平台。

成功最关键的决定因素是针对特定细胞类型和接种密度，对皂苷（digitonin）浓度进行经验性优化。支持这种细胞类型依赖性的观察表明，不同细胞类型之间的最佳皂苷浓度存在显著差异。例如，HEK293细胞在约15 µM皂苷浓度下表现出最大琥珀酸支持的复合体II–IV呼吸，而培养的大鼠背根神经节（DRG）神经元则在约10 µM时反应最佳。这些观察结果进一步说明，必须针对每种细胞类型和接种密度经验性地滴定皂苷浓度，以确保选择性透化的同时不损害线粒体完整性。可接受的透化表现为对非细胞膜通透性...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢加拿大曼尼托巴省温尼伯市圣博尼法斯医院研究所、曼尼托巴大学以及美国佛罗里达州劳德代尔堡诺瓦东南大学提供的资金和基础设施支持。作者还感谢美国加利福尼亚州圣地亚哥Alzo Biosciences公司和佛罗里达州迈阿密Capillus公司提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯化乙酰胆碱MilliporeSigmaA6625毒蕈碱型受体激动剂
ADPMP Biomedicals, IncICN19014901电子受体，ATP合成的底物
抗霉素AAAJ63522MAThermo Scientific抑制线粒体复合体III
阿托品MilliporeSigma1044990毒蕈碱型受体拮抗剂
Be2C细胞美国模式培养物集存库（ATCC）CRL-2268一种从男性神经母细胞瘤患者脑组织中分离得到的神经母细胞，表达毒蕈碱型受体
皂苷MilliporeSigmaD141温和去垢剂，用于细胞膜通透化
D-甘露醇Thermo Scientific ChemicalsAA3334236一种不可代谢的糖醇，用于渗透压稳定和细胞膜保护
EGTAMilliporeSigmaE0396钙螯合剂，防止钙依赖性蛋白酶及其他可能降解线粒体蛋白的酶被激活
无脂肪酸BSAMilliporeSigma126575防止脂肪酸的非特异性作用，稳定线粒体
FCCPCayman ChemicalNC0904863质子载体，线粒体氧化磷酸化的解偶联剂
HEPESMilliporeSigma391340用于pH缓冲，与线粒体功能相容
L-抗坏血酸TCI AmericaA053925G三羧酸循环中间产物，氧化磷酸化的底物
氯化镁MilliporeSigmaM8266维持离子平衡，支持酶活性
N1,N1,N1,N1-四甲基-1,4-亚苯基二胺（TMPD）细胞色素c的电子供体，通过绕过复合体I和II来评估复合体IV的功能，TMPD/抗坏血酸体系可直接测量复合体IV依赖性耗氧量
寡霉素MilliporeSigma1404-19-9抑制线粒体ATP合成，作用于复合体V
盐酸匹仑西平MilliporeSigmaP7412具有偏向性的毒蕈碱型受体激动剂
丙酮酸Thermo Scientific ChemicalsAC132155000三羧酸循环底物
鱼藤酮MilliporeSigma557368抑制线粒体复合体I
Seahorse XF24 V7 PS 细胞培养微孔板Agilent102340-100细胞培养微孔板
Seahorse XFe24 分析仪AgilentS7801BRAgilent Seahorse XFe24 分析仪用于在24孔板体系中测量活细胞的耗氧率（OCR）和细胞外酸化率（ECAR）
琥珀酸Fisher ChemicalAC158742500三羧酸循环中间产物，氧化磷酸化的底物
XFe24 传感器微孔板校准缓冲液Agilent102340100pH 7.2 的 PBS 缓冲液
XFe24 传感器微孔板Agilent102340-100用于OCR和ECAR测量的传感器

参考文献

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胆碱能配体皂苷素透化BE(2)-C 细胞细胞外通量分析仪线粒体呼吸复合体 II 呼吸质膜透化电子传递链
胆碱能配体依赖性调节Digitonin透化的BE(2)-C神经母细胞瘤细胞中的氧化磷酸化偶联
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