多巴胺释放体 外 快速扫描循环伏安法

摘要

快速扫描循环伏安法（FCV）利用碳纤维微电极以亚秒分辨率测量快速多巴胺动态。本方案描述了急性小鼠脑切片中的FCV，包括电极制造、切片制备、校准及基于刺激的检测，以探讨胆碱能中间神经元在生理条件下如何调控纹状体多巴胺释放。

摘要

快速扫描循环伏安法（FCV）是一种电化学技术，能够实时检测可氧化性神经递质，包括多巴胺（DA）、去甲肾上腺素和血清素，分辨率达亚秒。通过将快速扫描的三角电压波形应用于碳纤维微电极，FCV能够以极高的时间精度测量细胞外神经递质浓度的快速、瞬态变化。这使得FCV特别适合记录快速的神经调节信号事件。本文介绍了FCV在体 外 小鼠大脑切片中检测诱发DA释放的应用。该方案概述了碳纤维微电极制造、急性脑切片准备、电极调节、数据采集及事后校准以将电流信号转换为绝对DA浓度的关键步骤。利用选择性含β2的尼古丁乙酰胆碱受体（nAChR）拮抗剂二氢β红滴氨酸（DHβE），我们证明nAChR活性对纹状体DA释放具有强烈调节作用。本研究共同强调了FCV作为研究单胺跨脑区传输的有力方法。

引言

快速扫描循环伏安法（FCV）是一种电化学技术，旨在监测电活性神经递质的快速^波动。与传统的循环伏安法使用慢^{扫描速率1}不同，FCV通过微米级碳纤维微电极以更快的扫描速率（通常为400 V/s）施加三角势波形，从而实现神经递质浓度^的亚秒级测量。这些高速扫描会产生一个大而稳定的背景充电电流，可以通过数字方式减去，以隔离由神经递质氧化和还原反应产生的法拉达电流 ^2,3。

FCV能够实时测量特定脑区的细胞外神经递质浓度，提供高时间分辨率和适中的化学选择性⁴。这些特征使FCV非常适合研究体内和体外制备中的快速神经化学信号传导，包括自由活动或麻醉动物以及急性脑切片^5、6、7。该技术具有多项优势：（1）可利用受控刺激方案诱发明确的多巴胺反应;（2）碳纤维微电极的小型直径最大限度地减少了组织损伤，并实现了....

方案

所有动物操作均经埃克塞特大学动物福利与伦理审查委员会批准，并依据内政部许可证[PP262252]进行。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 制备碳纤维微电极

1. 用丙酮装满一个干净的玻璃容器。将玻璃毛细管完全浸入丙酮中，确保每个毛细管都充满。
2. 用镊子将一根碳纤维插入充满丙酮的毛细血管中。将丙酮中的毛细血管清除，让它们完全自然风干。
3. 将干燥的毛细管装入垂直微电极拉拔器，将管子的中点与加热丝对齐。
4. 启动拉拔器，将加热器电平调至58.1，即可从单根毛细管产生两个碳纤维电极。收集被拔出的电极进行修剪。
   注意：加热温度或拉力没有通用设置。这些参数因仪器而异，必须通过试错针对每个实验室设备进行优化。
5. 将拉出的电极置于配备10×十字线的显微镜下。用手术刀将纤维尖端修剪至~100微米（见图1A）。
6. 从导电线的两端剥离大约1厘米的绝缘层。在一端裸露的一端涂一层薄薄的导电银墨。
7. 将镀银线的端插入碳纤维电极的后端，确保线与纤维之间有牢固的接触。用强力胶封住连接处，让它完全干燥。

2....

结果

DA释放幅度通过背景减去的FCV录音量化。每次试验的背景信号均通过五个稳定的预刺激伏安图平均生成，从而明确隔离氧化峰。DA释放以约+0.6伏的峰值氧化电流测量。每次实验结束时，电极进行校准，峰值氧化电流利用电极特异性敏感度因子（nA/μM）转换为DA浓度。为便于跨条件比较，对三项试验的反应进行平均，并归一化为同一切片内记录的基线单脉冲（1p）反应。

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讨论

该方案描述了利用FCV测量急性小鼠脑切片中诱发DA释放的基本程序，并提供了基本工作流程的全面指南。除了DA特异性应用外，FCV还可用于检测其他神经递质，如去甲肾上腺素和血清素，适用于体外和体内制剂^21,22,23。本文重点介绍该方法的关键组成部分，包括碳纤维微电极制造、急性切?.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酮	西格玛-奥尔德里奇	534064-500ml
氯化钙	西格玛-奥尔德里奇	21115-100毫升	1M解
碳纤维	古德费洛剑桥有限公司	LS596012通缉令
同心双极电极	FHC	300197	刺激电极
二氢-β;-赤丝氨酸溴化氢	托克里斯生物科学	12A/295293
多巴胺盐酸	顶峰	B1482
快速扫描循环伏安测电阻系统	WaveNeuro	AF01FSCV1
玻璃毛细管及nbsp;	哈佛设备	GC200F-10
葡萄糖	西格玛-奥尔德里奇	SLCQ7550
卤素电源	奥林匹斯	TH4
隔离电流刺激器	数码计时器	黑暗之魂3
六氢酸镁氯化物	西格玛-奥尔德里奇	M2670
多芯电缆	多合成专业版	3372784
高氯酸	费舍尔科学	联合国2920号	0.1M冰川醋酸
蠕动泵	吉尔森	迷你加3
氯化钾	西格玛-奥尔德里奇	P9541
BSI快线Prime	泰莱达恩	01-PRIME-BSI-EXP
银导电漆	RS组件	RS 186-3600
银/氯化银参考	世界精密仪器	0226E	参考电极
切片镜	科学	Pro 2000
碳酸氢钠	西格玛-奥尔德里奇	S5761
氯化钠	费舍尔科学	2402665
磷酸钠单碱性	西格玛-奥尔德里奇	S5011
刺激发生器	多通道系统	STG5
蔗糖	米利波尔	84100
垂直微电极拉拔器及nbsp;	成重	PC-100