需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

快速扫描循环伏安法用于 离体 多巴胺释放的记录

487 次观看

⸱

DOI：

10.3791/69790

⸱

2026年3月17日

 ,  , 
1Department of Clinical and Biomedical Sciences, University of Exeter Medical School, Hatherly Laboratories

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

快速扫描循环伏安法（FCV）利用碳纤维微电极以亚秒级分辨率测量多巴胺的快速动态变化。本实验方案描述了在急性小鼠脑切片中进行快速扫描循环伏安法的完整流程，包括电极制备、脑切片准备、校准以及基于刺激的检测方法，用于研究胆碱能中间神经元在生理条件下如何调控纹状体多巴胺的释放。

摘要

快速扫描循环伏安法（Fast-Scan Cyclic Voltammetry, FCV）是一种电化学技术，能够以亚秒级时间分辨率实时检测可氧化的神经递质，包括多巴胺（DA）、去甲肾上腺素和5-羟色胺。通过向碳纤维微电极施加快速扫描的三角波电压，FCV可高灵敏度地测量细胞外神经递质浓度的快速瞬时变化，具有优异的时间精度。这使得FCV特别适用于记录快速的神经调制信号事件。本文描述了在离体（ex vivo）小鼠脑片中应用FCV测量诱发多巴胺释放的方法。该实验方案概述了碳纤维微电极制备、急性脑片制备、电极预处理、数据采集以及事后校准以将电流信号转换为绝对多巴胺浓度的关键步骤。通过使用选择性含β2亚基的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）拮抗剂二氢-β-赤藓碱（DHβE），我们证明了nAChR活性对纹状体多巴胺释放具有显著的调节作用。综上所述，本研究突显了FCV作为一种强大工具，在研究脑区单胺类神经传递中的应用价值。

引言

快速扫描循环伏安法（FCV）是一种电化学技术，用于监测电活性神经递质的快速波动1。与传统的循环伏安法采用较慢的扫描速率不同1，FCV通过微米级碳纤维微电极以更快的扫描速率（通常为400 V/s）施加三角波电位，从而实现对神经递质浓度的亚秒级测量2。这种高扫描速率会产生较大但稳定的背景充电电流，可通过数字方式减去，从而分离出由神经递质氧化和还原反应产生的法拉第电流2,3。

快速循环伏安法（FCV）能够实时测量特定脑区的细胞外神经递质浓度，具有高时间分辨率和中等化学选择性4。这些特性使FCV非常适合研究活体（in vivo）和离体（ex vivo）条件下快速的神经化学信号传递，包括自由活动或麻醉动物以及急性脑切片模型5,6,7。该技术具有多项优势：（1）可采用可控的刺激方案诱发明确的多巴胺能反应；（2）碳纤维微电极直径小，可最大限度减少组织损伤，并实现精确的空间记录；（3）FCV与药理学干预高度兼容，便于高效研究单胺类递质的释放与再摄取动力学；（4）其化学选择性与高时间分辨率的结合，相较于安培法等其他电化学方法以及微透析等取样技术，可实现更优的检测性能——后者通常难以快速捕捉短暂的神经递质事件，或在特异性分子的识别与定量方面存在挑战5。

多巴胺（DA）是一种关键的神经调节物质，参与奖赏、动机、运动控制以及学习和记忆的多个方面，其特点是具有快速且短暂的释放动力学特征8。在快速循环伏安法（FCV）中，通常对碳纤维微电极施加一个在 -0.4 V 至 +1.2 V 之间呈三角波形的周期性电压。在阳极（上升）扫描过程中，电极表面附近的 DA 在约 +0.6 V 处被氧化，释放出两个电子，生成多巴胺-o-醌。在阴极（下降）扫描过程中，该化合物在约 -0.2 V 处被还原，重新生成 DA，并吸收两个电子9。由此产生的电流-电压特征曲线能够以高空间和时间分辨率精确检测和定量快速的 DA 释放与清除过程，揭示细胞外 DA 水平的秒级波动。在本实验中，FCV 记录以 10 Hz 的频率持续采集 15–30 秒，足以捕捉由电刺激诱发的 DA 释放。

在纹状体中，多巴胺（DA）的释放受到局部胆碱能中间神经元（ChIs）的严密调控。尽管ChIs仅占纹状体神经元的约1%–2%，但其轴突广泛分支，并通过轴-轴突触相互作用对多巴胺能轴突具有强大控制力10,11。这种调控机制可能在纹状体介导的学习过程中发挥关键作用。在学习过程中，中脑多巴胺神经元会对奖赏或预示奖赏的线索产生时相性放电12，而ChIs则表现出高度同步的多相性兴奋-暂停-反跳式放电模式13。ChIs的放电暂停与多巴胺的时相性活动在时间上的重合，进一步凸显了通过烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）介导的ChIs对DA释放的调控作用的重要性14,15。除了调控DA释放外，这种时间上的重合已被证明是诱导纹状体中学习相关突触可塑性的必要条件16，表明阐明ChIs与DA信号在此神经环路中的相互作用至关重要。

胆碱能中间神经元（ChIs）通过至少两种不同的机制影响多巴胺（DA）的释放。首先，ChIs的同步激活可通过作用于DA轴突上的烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs），引发快速、短潜伏期的DA释放，该过程独立于多巴胺能神经元胞体的放电活动via激活DA轴突上的nAChRs17,18,19。这种轴突内的DA释放可能由DA轴突内异位动作电位的产生所介导17。其次，ChIs的激活可通过阻止DA轴突的去极化，强烈抑制后续的DA释放20。值得注意的是，这种抑制作用潜伏期极短，且可由相对较低水平的ChIs活动诱发，而这些活动本身并不引起可检测到的DA释放，提示nAChRs的激活在抑制正在进行的DA释放方面比触发DA释放更为有效。因此，这些因素表明，在生理条件下，ChIs可能对DA释放总体上发挥抑制性影响。然而，在更精细的空间尺度上，ChIs可能局部促进DA轴突的释放。

总体而言，这些发现凸显了胆碱能中间神经元（ChIs）在调控纹状体多巴胺（DA）信号传导中所发挥的精细调节作用20。快速循环伏安法（FCV） 为解析这些ChI-DA相互作用提供了一种强有力的方法，因其具有高时间分辨率，能够精确测量ChI活动对DA释放的促进和抑制效应。

本文概述了制备碳纤维微电极并利用快速扫描循环伏安法（FCV）测量诱发电胞外多巴胺（DA）浓度的关键步骤 离体 制备物。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

所有动物实验程序均经埃克塞特大学动物福利与伦理审查委员会批准，并在英国内政部许可证 [PP262252] 下进行。所用试剂和设备列于材料表中。

1. 碳纤维微电极的制备

  1. 用一个干净的玻璃容器装入丙酮，将玻璃毛细管完全浸入丙酮中，确保每根毛细管内部均被丙酮充满。
  2. 使用镊子将单根碳纤维插入装有丙酮的毛细管中。将毛细管从丙酮中取出，并使其在空气中彻底干燥。
  3. 将干燥后的毛细管装入垂直式微电极拉制仪中，使毛细管的中点与加热丝对齐。
  4. 启动拉制仪，并将加热档位设为58.1，以从一根毛细管中拉制出两根碳纤维电极。收集拉制完成的电极用于后续修整。
    注意：加热温度和拉力并无通用设置参数，不同仪器之间参数各异，需根据各实验室的具体装置通过反复试验优化确定。
  5. 将拉制好的电极置于配备10×测微目镜的显微镜下。使用解剖刀将纤维尖端修剪至约100 µm的长度（图1A）。
  6. 将导线两端各剥去约1 cm的绝缘层。在其中一端裸露的金属部分涂上一层薄薄的导电银浆。
  7. 将涂有银浆的一端导线插入碳纤维电极的尾部，确保导线与纤维之间接触牢固。用瞬干胶密封连接处，并使其完全干燥。

2. 溶液的配制

  1. 制备基于蔗糖的切割溶液。
    1. 配制 1 L 基于蔗糖的切割溶液（pH 7.4，约 300 mOsm/L），溶解以下组分（单位为 mM）：85 NaCl、25 NaHCO3、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、7 MgCl2、10 葡萄糖和 65 蔗糖。
    2. 将 200 mL 基于蔗糖的切割溶液转移至一个洁净的瓶中。加入 200 µL 的 1 M CaCl2·H2O，使终浓度达到 1 mM CaCl2。使用 95% O2 / 5% CO2 气体混合物通气至少 30 分钟后使用。
  2. 制备用于记录的人工脑脊液（aCSF，pH 7.4，300 mOsm/L）。
    1. 通过将以下成分溶解于 1 L 蒸馏水中，配制 10× aCSF 储存液：1300 mM NaCl、250 mM NaHCO3、25 mM KCl 和 12.5 mM NaH2PO4。将储存液保存在 4 °C 条件下。
    2. 配制 1× aCSF 时，取 100 mL 的 10× aCSF 储存液与 52 mL 的 0.5 M NaHCO3 混合，用蒸馏水定容至 1 L。加入 2 mL 的 1 M CaCl2·H2O，使终浓度为 2 mM CaCl2。使用前用 95% O2/5% CO2 气体混合物通气至少 30 分钟。
  3. 制备用于校准的 2.5 mM 多巴胺（DA）标准储备液。
    1. 将 20 µL 的 0.1 M 高氯酸稀释至 20 mL 蒸馏水中，配制 0.1 mM 高氯酸溶液。充分混匀以确保完全稀释。
    2. 称取 9.48 mg DA 盐酸盐粉末，溶于上述配制的 0.1 mM 高氯酸溶液中，得到终浓度为 2.5 mM 的溶液。将该溶液保存于 4 °C，并避光以防止氧化。

3. 脑切片制备

  1. 处死动物，迅速取出脑组织，并立即转移至冰冻的蔗糖基切割液中。
  2. 将脑组织固定于振动切片机平台上，在相对于前囟+1.5 mm至+0.5 mm的范围内以0.34 mm/s的切速切割成300 µm厚的冠状切片。
  3. 将切片转移至含有aCSF的恢复室中，于32 °C条件下孵育30–40分钟。
  4. 恢复后，将切片置于持续充氧的aCSF中，在室温下保存以备后续使用。

4. 仪器设置与电极预处理

  1. 开启灌流系统。用蒸馏水对整个装置进行灌流，至少持续 10 分钟。打开加热系统，并将温度设定为 32 °C。
    注意：在启动加热器前，确保温度传感器已完全浸入溶液中。
  2. 启动刺激发生器软件、相机、显微操作器和显微镜背景照明。
  3. 打开 HDCV 软件以进行 FCV 数据采集。将电压参数设置为三角波形，扫描范围从 -0.4 V 到 +1.2 V，扫描速率为 400 V/s，施加频率为 10 Hz。
  4. 将脑片置于切片室中央，并使用网格固定器将其固定。
  5. 使用显微操作器将电极尖端移入显微镜视野范围内。
  6. 在显微镜下检查电极尖端，确认其完整无损，未发生断裂。
  7. 开始数据采集，并查看电流-电压曲线图。
  8. 通过将新电极置入皮层组织并施加至少 30 分钟的三角波循环来活化电极，再进行记录。
    注意：正常的循环伏安图应显示特征性的充电曲线（图 1B）。若伏安图出现畸变（图 1C-E）或背景电流不稳定，则应更换电极。若不稳定性持续存在，请检查接地连接。

5. 细胞外多巴胺浓度的测定

  1. 使用显微操作器将记录电极从其 conditioning 位点移动至脑片内的目标记录位置。
  2. 将同心双极刺激电极置于所需的记录位点。将记录电极放置在距离刺激电极约 50 µm 的位置（图 2A，B）。
  3. 以 0.65 mA 的强度、200 µs 的脉宽和 150 s 的刺激间间隔施加单脉冲电刺激。验证氧化峰和还原峰出现在预期电压（图 2C），且多巴胺（DA）瞬时信号表现出典型的释放与清除动力学特征（图 2D）。
  4. 记录 10 次基线 DA 信号，并检查最后三次基线记录。确认这些信号之间的变异小于 5%。
    注意：若信号幅度较低或持续下降，请检查碳合气（carbogen）供应、温度稳定性以及 aCSF 的渗透压和 pH 值。
  5. 采用伪随机化序列施加刺激脉冲，包括单脉冲（1p）和四脉冲（4p，100 Hz）两种刺激模式。
    注意：4p 100 Hz 刺激可模拟多巴胺能神经元的自然高频放电11，常用于评估胆碱能中间神经元（ChI）依赖性抑制的最大程度，该抑制通常在 ChI 激活后约 7–8 ms 出现20。在整个记录过程中交替使用不同的刺激模式，以最小化序列偏差。
  6. 将所需的药理学试剂溶解于 aCSF 中，并用 95% O2/5% CO2 气体至少 bubbled 10 分钟。
  7. 将药物加入灌流浴槽中，孵育至药理效应完全显现（例如，DHβE 约需 10–15 分钟）。在药物处理条件下重复刺激与记录步骤。

6. 校准

  1. 通过将20 µL的2.5 mM多巴胺（DA）储备液稀释至25 mL含氧人工脑脊液（aCSF）中，配制2 µM的DA校准溶液。
  2. 将电极置于进样口附近。调节显微镜焦距，清晰观察进样口的上下边缘。重新对焦至进样管中心，并调节显微操作器（升高或降低），直至电极尖端清晰可见。
  3. 以较快流速用含氧aCSF对电极进行灌注，持续约10秒，以清洗电极表面。在显微镜下观察切换过程，将灌注管路从aCSF切换至DA校准溶液。
  4. 维持DA溶液灌注30–60秒。随后将管路切换回aCSF，并继续灌注以清除电极中的DA。重复整个校准程序三次。
  5. 利用三次DA应用所获得的平均电流响应（ΔI）计算校准因子（nA/µM）（图2E）。每次应用的ΔI按以下公式计算：ΔI = IDApeak − IDAbase。取三次ΔI值的平均值，除以已知的DA浓度（2 µM），得到电极的校准因子。
  6. 在校准完成后，用电极记录实验日期，并保存所有校准数据文件以供后续参考。
    注意：每个记录电极均在实验当天结束时进行校准，且不用于后续实验记录，以确保最佳的灵敏度和准确性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

多巴胺（DA）释放幅度通过扣除背景信号的快速扫描循环伏安法（FCV）记录进行定量。每次试验中，背景信号通过平均五次稳定的刺激前伏安图获得，从而清晰分离出氧化峰。多巴胺释放量以约+0.6 V处的峰值氧化电流进行测量。每次实验结束后对电极进行校准，并利用电极特异性的灵敏度因子（nA/µM）将峰值氧化电流转换为多巴胺浓度。为了便于在不同条件下进行比较，将三次试验的反应结果取平均值，并以同一脑片中记录的单脉冲（1p）基线反应为参照进行归一化处理。

在基线条件下，四脉冲（4p，100 Hz）刺激诱发的细胞外多巴胺（[DA]o）释放量仅略高于单脉冲（1p）刺激所诱发的释放量（图3）。在浴施用DHβE（1 µM）后，4p与1p刺激所诱发的[DA]o释放比率显著升高。这表明，在对照条件下，胆碱能中间神经元（ChI）的激活通过烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）强烈抑制后续的多巴胺释放。阻断nAChRs可解除这种依赖于ChI的抑制作用，从而提高4p刺激在驱动多巴胺释放方面的相对效能。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本方案描述了在急性小鼠脑切片中使用快速循环伏安法（FCV）测量诱发电多巴胺（DA）释放的基本步骤，并提供了核心实验流程的全面指南。除了针对多巴胺的应用外，FCV 还可用于检测去甲肾上腺素和5-羟色胺等其他神经递质，在离体（ex vivo）和在体（in vivo）样本中均有应用21,22,23。本文重点介绍该方法的关键组成部分，包括碳纤维微电极的制备、急性脑切片的制备、数据采集以及电极校准。

DA 的可靠检测 使用FCV检测信号时需考虑若干技术要点。首先，碳纤维电极应修剪至约100 µm的最佳长度，以在组织内实现灵敏度与精确定位之间的平衡。其次，碳纤维与周围玻璃之间必须形成高质量的密封，以最大限度降低背景噪声并确保信号的长期稳定性。第三，采用HDCV记录稳定且可重复的电流-电压曲线，对于验证多巴胺（DA）检测的可靠性至关重要。 信号可以被稳定分...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

Yan-Feng Zhang 是 Oxbio 的创始人。

致谢

本工作由英国医学科学院Springboard奖（项目编号：SBF009\1125）资助，该奖项由英国心脏基金会、糖尿病英国协会、英国政府科学、创新与技术部（DSIT）以及维康基金会共同支持，授予Y. -F. Z.。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
丙酮Sigma-Aldrich534064-500ml
氯化钙Sigma-Aldrich21115-100ml1M 溶液
碳纤维Goodfellow Cambridge LimitedLS596012 APB
同心双极电极FHC300197刺激电极
二氢-β-红古豆碱氢溴酸盐Tocris Biosciences12A/295293
盐酸多巴胺apexbtB1482
快速扫描循环伏安法恒电位仪系统WaveNeuroAF01FSCV1
玻璃毛细管 Harvard apparatusGC200F-10
葡萄糖Sigma-AldrichSLCQ7550
卤素电源Olympus TH4
隔离式电流刺激器DigitimerDS3
六水合氯化镁Sigma-AldrichM2670
多芯电缆 Multicomp Pro3372784
高氯酸Fisher scienceUN29200.1M 冰醋酸溶液
蠕动泵Gilson MINIPLUS 3
氯化钾Sigma-AldrichP9541
Prime BSI ExpressTeledyne01-PRIME-BSI-EXP
导电银漆RS ComponentsRS 186-3600
银/氯化银参比电极World Precision Instruments0226E参比电极
SliceScopeScientificaPro 2000
碳酸氢钠Sigma-AldrichS5761
氯化钠Fisher science2402665
磷酸二氢钠Sigma-AldrichS5011
刺激发生器Multichannel systemsSTG5 
蔗糖Millipore84100
垂直微电极拉制仪 NarishigePC-100

参考文献

  1. Roberts, J. G., Sombers, L. A. Fast-scan cyclic voltammetry: Chemical sensing in the brain and beyond. Anal Chem. 90 (1), 490-504 (2018).
  2. Venton, B. J., Cao, Q. Fundamentals of fast-scan cyclic voltammetry for dopamine detection. Analyst. 145 (4), 1158-1168 (2020).
  3. Movassaghi, C. S., et al. Maximizing electrochemical information: A perspective on background-inclusive fast voltammetry. Anal Chem. 96 (16), 6097-6105 (2024).
  4. Zhao, S., Piatkevich, K. D. Techniques for in vivo serotonin detection in the brain: State of the art. J Neurochem. 166 (3), 453-480 (2023).
  5. Rodeberg, N. T., Sandberg, S. G., Johnson, J. A., Phillips, P. E. M., Wightman, R. M. Hitchhiker's guide to voltammetry: Acute and chronic electrodes for in vivo fast-scan cyclic voltammetry. ACS Chem Neurosci. 8 (2), 221-234 (2017).
  6. Wickham, R. J., Park, J., Nunes, E. J., Addy, N. A. Examination of rapid dopamine dynamics with fast scan cyclic voltammetry during intra-oral tastant administration in awake rats. J Vis Exp. (102), e52468(2015).
  7. Maina, F. K., Khalid, M., Apawu, A. K., Mathews, T. A. Presynaptic dopamine dynamics in striatal brain slices with fast-scan cyclic voltammetry. J Vis Exp. (59), e3464(2012).
  8. Klein, M. O., et al. Dopamine: Functions, signaling, and association with neurological diseases. Cell Mol Neurobiol. 39 (1), 31-59 (2019).
  9. Clark, P. J., España, R. A. In dopaminergic system function and dysfunction: Experimental approaches. Fuentealba-Evans, J. A., Henny, P. , Springer US. New York, NY. 249-281 (2023).
  10. Zhang, Y. -F., Cragg, S. J. Pauses in striatal cholinergic interneurons: What is revealed by their common themes and variations. Front Syst Neurosci. 11, 80(2017).
  11. Rice, M. E., Cragg, S. J. Nicotine amplifies reward-related dopamine signals in striatum. Nat Neurosci. 7 (6), 583-584 (2004).
  12. Schultz, W., Dayan, P., Montague, P. R. A neural substrate of prediction and reward. Science. 275 (5306), 1593-1599 (1997).
  13. Aosaki, T., et al. Responses of tonically active neurons in the primate's striatum undergo systematic changes during behavioral sensorimotor conditioning. J Neurosci. 14 (6), 3969-3984 (1994).
  14. Joshua, M., Adler, A., Mitelman, R., Vaadia, E., Bergman, H. Midbrain dopaminergic neurons and striatal cholinergic interneurons encode the difference between reward and aversive events at different epochs of probabilistic classical conditioning trials. J Neurosci. 28 (45), 11673-11684 (2008).
  15. Morris, G., Arkadir, D., Nevet, A., Vaadia, E., Bergman, H. Coincident but distinct messages of midbrain dopamine and striatal tonically active neurons. Neuron. 43 (1), 133-143 (2004).
  16. Reynolds, J. N. J., et al. Coincidence of cholinergic pauses, dopaminergic activation and depolarisation of spiny projection neurons drives synaptic plasticity in the striatum. Nat Commun. 13 (1), 1296(2022).
  17. Liu, C., et al. An action potential initiation mechanism in distal axons for the control of dopamine release. Science. 375 (6587), 1378-1385 (2022).
  18. Threlfell, S., et al. Striatal dopamine release is triggered by synchronized activity in cholinergic interneurons. Neuron. 75 (1), 58-64 (2012).
  19. Cachope, R., et al. Selective activation of cholinergic interneurons enhances accumbal phasic dopamine release: Setting the tone for reward processing. Cell Rep. 2 (1), 33-41 (2012).
  20. Zhang, Y. -F., et al. An axonal brake on striatal dopamine output by cholinergic interneurons. Nat Neurosci. 28 (4), 783-794 (2025).
  21. Nguyen, M. D., Venton, B. J. Fast-scan cyclic voltammetry for the characterization of rapid adenosine release. Comput Struct Biotechnol J. 13, 47-54 (2015).
  22. Dunham, K. E., Venton, B. J. Improving serotonin fast-scan cyclic voltammetry detection: New waveforms to reduce electrode fouling. Analyst. 145 (22), 7437-7446 (2020).
  23. Rafi, H., Zestos, A. G. Recent advances in FSCV detection of neurochemicals via waveform and carbon microelectrode modification. J Electrochem Soc. 168 (5), 057520(2021).
  24. Salinas, A. G., et al. Distinct sub-second dopamine signaling in dorsolateral striatum measured by a genetically-encoded fluorescent sensor. Nat Commun. 14 (1), 5915(2023).
  25. Schmidt, K. T., McElligott, Z. A. Dissecting the catecholamines: How new approaches will facilitate the distinction between noradrenergic and dopaminergic systems. ACS Chem Neurosci. 10 (4), 1872-1874 (2019).
  26. Farassat, N., et al. In vivo functional diversity of midbrain dopamine neurons within identified axonal projections. Elife. 8, 48408(2019).
  27. John, C. E., Jones, S. R. In electrochemical methods for neuroscience. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC Press/Taylor & Francis Taylor & Francis Group, LLC. Boca Raton. (2007).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

碳纤维微电极脑切片制备神经递质检测电极预处理数据采集单胺类神经传递烟碱型乙酰胆碱受体

本文已发表

视频即将推出

联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。