建立肾移植急性抗体介导排斥反应的大鼠模型

摘要

本文描述了建立肾移植中急性抗体介导排斥反应（AAMR）大鼠模型的方法。该模型通过在肾移植前14天，用供体布朗诺瓦鼠的皮肤移植物对受体刘易斯大鼠进行预先致敏而诱导，为研究AAMR的病理生理机制提供了可靠的平台。

摘要

急性抗体介导的排斥反应（AAMR）仍然是影响肾移植后移植物长期存活的主要障碍。AAMR 的病理生理机制主要由供体特异性抗体（DSA）驱动，这些抗体可激活补体系统，导致内皮细胞损伤、血管炎以及移植物功能障碍。尽管免疫抑制治疗已取得进展，但 AAMR 的治疗效果仍不理想。因此，建立可靠的 AAMR 动物模型对于深入理解其发病机制并评估潜在治疗干预措施至关重要。本研究通过在肾移植前 14 天对受体 Lewis 大鼠进行供体 Brown Norway 大鼠皮肤移植以诱导致敏，成功建立了大鼠 AAMR 模型。整个研究过程中未对受体大鼠使用任何免疫抑制剂。生存分析显示，预先致敏的同种异体移植组移植物存活时间显著短于未预先致敏组（6.2 ± 1.1 天 vs 10.0 ± 0.7 天，P < 0.001）。血清 DSA-IgG 水平自皮肤移植后第 7 天开始显著升高，并持续上升至肾移植后第 5 天；血清 DSA-IgM 水平则在皮肤移植后第 7 天和第 14 天显著升高。肾移植后 6 小时起，移植物开始出现肾小球炎、肾小管周围毛细血管炎及毛细血管内 C4d 沉积。自肾移植后第 3 天起，观察到明显的移植物损伤和肾小管坏死。这些病理改变随时间逐渐加重，均符合 AAMR 的典型特征。该模型有效再现了 AAMR 的关键特征，为今后研究其潜在机制及治疗方法提供了可靠的实验平台。

引言

肾移植（KT）已成为终末期肾病的关键治疗手段^1,2。然而，移植排斥反应仍是影响肾移植器官长期存活的主要因素^3,4。临床上观察到的主要排斥类型包括急性排斥反应（AR）和慢性排斥反应（CR）。急性排斥反应进一步分为急性T细胞介导的排斥反应（TCMR）和急性抗体介导的排斥反应（AAMR）^5,6,7。近年来，随着免疫抑制剂的发展与应用，TCMR的发生率已得到有效控制。然而，AAMR仍是导致移植器官功能障碍的主要原因之一^8,9。

目前普遍认为，急性抗体介导的排斥反应（AAMR）的病理生理学机制是由移植前或移植后产生的供体特异性抗体（DSA）所触发¹⁰。当DSA与移植物血管内皮细胞上的抗原结合时，会激活经典补体级联反应，导致膜攻击复合物的形成，进而造成移植物损伤¹¹

方案

所有动物实验均严格遵守机构指南，并经山东第一医科大学机构动物伦理委员会批准 & 山东省千佛山医院。所有实验程序均遵循3R原则和《赫尔辛基宣言》（批准号：JENNIO-IACUC-2024-A066）。本研究中使用的所有试剂和设备详见于 材料表.

1. 动物准备

1. 成年雄性BN大鼠（RT1ⁿ）和 Lewis（RT1^l）大鼠（200-250 g），饲养于特定无病原体（SPF）环境中。由于近交系个体间具有相同的遗传背景，可确保供体的一致性。
2. 将大鼠分为四个实验组，具体分组如下所述 图1：（1）同基因型肾移植（KT），（2）同基因型肾移植后皮肤移植（ST），（3）异基因型肾移植，以及（4）异基因型肾移植后皮肤移植。
   注意：所有外科手术均应在SPF级手术室内的体视显微镜下进行。整个操作过程中，使用恒温手术台维持动物体温在37 °C。
3. 在诱导室中使用100%氧气为载体、流速为1.0 L/min、浓度为4%-5%的异氟烷诱导麻醉（遵循机构批准的方案）。诱导完成后，以1.5%-2%异氟烷维持麻醉 通过 鼻锥。通过在整个过程中检测足底回缩反射的消失来监测麻醉深度。

结果

肾移植存活时间
在同系移植组（syngeneic KT）和同系移植后ST组（syngeneic KT after ST）中，受体在整个为期一个月的观察期内均长期存活，未发生排斥反应。相反，异系移植组（allogeneic KT）和异系移植后ST组（allogeneic KT after ST）的移植物存活时间分别为 (10.0 ± 0.7) 天和 (6.2 ± 1.1) 天，两组之间差异具有统计学意义（图 2A）。

DSA（IgG 和 IgM）水平
在同种异体肾移植（KT）受者接受干细胞移植（ST）后，其血清 DSA-IgG 水平从 ST 后第 7 天至 KT 后第 5 天均显著高于接受 ST 后进行同系肾移植组的受者。在 ST 后第 0 天和第 3 天，两组之间的 DSA-IgG 水平无统计学显著差异。具体而言，在 ST 后第 7 天，同种异体 KT 后 ST 组的 DSA-IgG 水平显著高于对照组（135.0 ± 11.8 vs 76.......

讨论

由于急性抗体介导的排斥反应（AAMR）进展迅速且临床预后不良，其在肾移植（KT）中仍然是一个重大挑战^33,34,35,36。即使现有的抗排斥治疗能够有效逆转急性发作，仍有超过40%的患者发展为慢性抗体介导的排斥反应（AMR）。在确诊慢性AMR后，移植物的5年存活率通常低于50%。C4d阳性患者的4年移植物存活率仅为50%，而C4d阴性患者在8年时的移植物存活率仍可维持在约50%³⁷。AAMR的发生主要源于受者免疫抑制不足，导致B细胞活化并产生供体特异性抗体（DSA）^24,29,38,39

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗CD31单克隆抗体	Abcam (UK)	ab64543	用于免疫组织化学（标记血管内皮细胞） 克隆号：TLD-3A12
抗C4d  抗体	Hycult Biotech (荷兰)	HP8034	用于免疫组织化学（检测补体沉积），稀释比例为1:50 克隆号：NA (多克隆)
FITC标记的抗大鼠IgG抗体	Abcam (UK)	ab6840	用于流式细胞术定量检测DSA-IgG水平 克隆号：多克隆
气体麻醉系统	南京卡文生物科技有限公司	KW-MZJ-4	配备异氟烷用于全身麻醉 克隆号：NA (多克隆)
PE标记的抗大鼠IgM抗体	Bio Legend	408918	用于流式细胞术定量检测DSA-IgM水平 克隆号：MRM-47
立体定位手术显微镜	北京中天广正科技有限公司	TS-39NK	用于大鼠肾移植手术操作 克隆号：NA
血管夹（Bulldog夹）	ROBOZ SURGICAL INSTRUMENT CO.	RS-5481T	用于肾移植过程中阻断血流 克隆号：NA