建立肾移植急性抗体介导排斥反应的大鼠模型

摘要

本文描述了建立肾移植中急性抗体介导排斥反应（AAMR）大鼠模型的方法。该模型通过在肾移植前14天，用供体布朗诺瓦鼠的皮肤移植物对受体刘易斯大鼠进行预先致敏而诱导，为研究AAMR的病理生理机制提供了可靠的平台。

摘要

急性抗体介导的排斥反应（AAMR）仍然是影响肾移植后移植物长期存活的主要障碍。AAMR 的病理生理机制主要由供体特异性抗体（DSA）驱动，这些抗体可激活补体系统，导致内皮细胞损伤、血管炎以及移植物功能障碍。尽管免疫抑制治疗已取得进展，但 AAMR 的治疗效果仍不理想。因此，建立可靠的 AAMR 动物模型对于深入理解其发病机制并评估潜在治疗干预措施至关重要。本研究通过在肾移植前 14 天对受体 Lewis 大鼠进行供体 Brown Norway 大鼠皮肤移植以诱导致敏，成功建立了大鼠 AAMR 模型。整个研究过程中未对受体大鼠使用任何免疫抑制剂。生存分析显示，预先致敏的同种异体移植组移植物存活时间显著短于未预先致敏组（6.2 ± 1.1 天 vs 10.0 ± 0.7 天，P < 0.001）。血清 DSA-IgG 水平自皮肤移植后第 7 天开始显著升高，并持续上升至肾移植后第 5 天；血清 DSA-IgM 水平则在皮肤移植后第 7 天和第 14 天显著升高。肾移植后 6 小时起，移植物开始出现肾小球炎、肾小管周围毛细血管炎及毛细血管内 C4d 沉积。自肾移植后第 3 天起，观察到明显的移植物损伤和肾小管坏死。这些病理改变随时间逐渐加重，均符合 AAMR 的典型特征。该模型有效再现了 AAMR 的关键特征，为今后研究其潜在机制及治疗方法提供了可靠的实验平台。

引言

肾移植（KT）已成为终末期肾病的关键治疗手段^1,2。然而，移植排斥反应仍是影响肾移植器官长期存活的主要因素^3,4。临床上观察到的主要排斥类型包括急性排斥反应（AR）和慢性排斥反应（CR）。急性排斥反应进一步分为急性T细胞介导的排斥反应（TCMR）和急性抗体介导的排斥反应（AAMR）^5,6,7。近年来，随着免疫抑制剂的发展与应用，TCMR的发生率已得到有效控制。然而，AAMR仍是导致移植器官功能障碍的主要原因之一^8,9。

目前普遍认为，急性抗体介导的排斥反应（AAMR）的病理生理学机制是由移植前或移植后产生的供体特异性抗体（DSA）所触发¹⁰。当DSA与移植物血管内皮细胞上的抗原结合时，会激活经典补体级联反应，导致膜攻击复合物的形成，进而造成移植物损伤¹¹。在补体激活过程中，裂解片段C4d共价结合于移植物毛细血管内皮细胞表面。此外，趋化因子如补体裂解产物C3a和C5a可招募炎症细胞（例如巨噬细胞）浸润移植物毛细血管，引起毛细血管炎及进一步的移植物损伤^12,13。因此，AAMR的临床诊断主要依赖于血清DSA水平升高、毛细血管炎、肾小管坏死以及移植物毛细血管中C4d沉积的证据^14,15,16。目前针对AAMR的治疗策略主要包括抑制B细胞或浆细胞活性、清除循环中的DSA以及抑制补体激活，具体方法包括血浆置换、免疫吸附、CD20单克隆抗体（利妥昔单抗）、蛋白酶体抑制剂（硼替佐米）、补体抑制剂（依库珠单抗）以及IgG降解酶（IdeS）^{17,18,19,20,21,22,23,24,25}。然而，总体治疗效果仍不理想，因为在随机对照试验中尚未证实任何标准化疗法具有显著疗效。此外，现有的免疫抑制策略常伴随显著的不良反应负担，尤其是严重感染并发症和恶性肿瘤的发生风险增加^21,25,26,27。因此，仍需进一步研究以阐明AAMR的病理生理机制，并开发更有效的治疗方案。

研究疾病机制并探索新的预防策略依赖于小型动物模型，因此在肾移植（KT）中建立可靠的抗体介导的急性排斥反应（AAMR）模型至关重要。本研究团队在构建大鼠肾移植AAMR模型方面具有丰富经验²⁸。本研究采用布朗-挪威（Brown Norway, BN）大鼠向路易斯（Lewis）大鼠进行肾移植。BN（RT1ⁿ）与Lewis（RT1^l）大鼠属于完全主要组织相容性复合体（MHC）不匹配的品系组合，为同种异体排斥反应提供了坚实的遗传学基础²⁹。相较于其他建模方法，本研究所采用的皮肤移植物预致敏策略在稳健性和生理相关性方面具有明显优势。与依赖短暂抗体注射且缺乏宿主免疫系统参与的被动抗体转移模型不同，这种主动致敏方法可建立长期的免疫记忆，更贴近临床中高度致敏患者的真实情况³⁰。此外，与其他致敏方案（如供体特异性输血）相比，后者可能因实验方案不同而导致抗体滴度不稳定，甚至诱导免疫耐受，而皮肤移植则提供了一种单一、强烈且高度免疫原性的刺激²⁹。这确保了可在明确的5至7天时间窗内，可重复地产生高滴度的供体特异性抗体（DSA），并稳定出现AAMR表型特征（如毛细血管炎、C4d沉积），使其成为评估治疗效果的高效可行平台。我们通过对这些同种异体大鼠在皮肤移植预致敏两周后实施肾移植，成功建立了AAMR模型，并通过血清学、组织病理学及免疫学分析对模型进行了系统评估。

关于该模型的适用性，使用本方案的研究者可预期在移植后第5至7天之间稳定地出现抗体介导的急性排斥反应（AAMR）表型。验证此模型所需的关键检测指标包括：血清供体特异性抗体（DSA，IgG和IgM）产生的动力学特征、肾小球炎和肾小管周围毛细血管炎等微血管炎症的组织学证据，以及肾小管周围毛细血管中弥漫性C4d沉积。然而，读者需注意一个根本性局限：皮肤预致敏方法会引发广泛的同种免疫反应，同时涉及体液免疫和细胞免疫两个分支。因此，该模型通常表现为混合性排斥病理特征——即以AAMR为主，同时伴有T细胞介导的排斥反应（TCMR），而非单纯的抗体介导排斥过程。

方案

所有动物实验均严格遵守机构指南，并经山东第一医科大学机构动物伦理委员会批准 & 山东省千佛山医院。所有实验程序均遵循3R原则和《赫尔辛基宣言》（批准号：JENNIO-IACUC-2024-A066）。本研究中使用的所有试剂和设备详见于 材料表.

1. 动物准备

1. 成年雄性BN大鼠（RT1ⁿ）和 Lewis（RT1^l）大鼠（200-250 g），饲养于特定无病原体（SPF）环境中。由于近交系个体间具有相同的遗传背景，可确保供体的一致性。
2. 将大鼠分为四个实验组，具体分组如下所述 图1：（1）同基因型肾移植（KT），（2）同基因型肾移植后皮肤移植（ST），（3）异基因型肾移植，以及（4）异基因型肾移植后皮肤移植。
   注意：所有外科手术均应在SPF级手术室内的体视显微镜下进行。整个操作过程中，使用恒温手术台维持动物体温在37 °C。
3. 在诱导室中使用100%氧气为载体、流速为1.0 L/min、浓度为4%-5%的异氟烷诱导麻醉（遵循机构批准的方案）。诱导完成后，以1.5%-2%异氟烷维持麻醉 通过 鼻锥。通过在整个过程中检测足底回缩反射的消失来监测麻醉深度。

2. 预致敏 通过 ST（适用于第2组和第4组）

1. 从供体大鼠（第2组为Lewis大鼠；第4组为BN大鼠）尾部切取一块2 cm × 2 cm的全层皮肤移植物。
   注：用于皮肤移植的供体大鼠与后续的肾脏供体为不同个体，但均来自同一近交品系。
2. 在受体大鼠背部制备一个相同大小的移植床。
3. 将供体皮肤移植物放置于制备好的移植床上，并使用间断缝合法固定，方法如前所述³¹。
4. 在进行肾脏移植前，给予14天的致敏时间。

3. 肾移植供体手术

1. 麻醉供体大鼠（第1组为Lewis大鼠） & 2；第3组和第4组的BN。
2. 将大鼠置于仰卧位，从剑突至耻骨联合沿正中线进行剖腹手术（切口长约3-4 cm），充分暴露腹腔器官³².
3. 轻柔地移开肠道以暴露左肾及其相关血管。
4. 在腹主动脉起始处分离左侧肾动脉，并在左肾静脉与下腔静脉汇合处进行分离。
   注意：我们选择直接在血管起始部（ostia）进行分离和横断，而不获取主动脉或腔静脉补片（Carrel补片）。尽管该技术对吻合操作要求较高的显微外科技巧，但我们更倾向于采用此方法，以尽量减少受体主动脉上的动脉切开范围，并降低补片重建所导致的湍流相关血栓形成风险。
5. 用约 2 mL 冷（4 °C）肝素化生理盐水（125 U/mL）灌注左侧肾脏 通过 腹主动脉直至肾脏变苍白³¹.
6. 横断左肾静脉，随后横断左肾动脉。
7. 横断输尿管，确保保留一小块与之相连的膀胱组织。
8. 取出肾脏后立即置于冰上预冷的0.5–1.0 mL高渗柠檬酸盐腺嘌呤（HCA）肾脏保存液中。

4. 肾移植受体手术

1. 麻醉受体Lewis大鼠。
2. 行正中腹切口，暴露腹主动脉和下腔静脉，位置位于受体自身肾血管水平以下。
3. 分离一段腹主动脉和下腔静脉。
4. 使用血管夹钳夹闭所分离的血管段。
5. 在腹主动脉上做一个小的纵行切口（长度约1.0–1.5 mm，与供体肾动脉直径相匹配），并使用10-0尼龙缝线连续缝合，将供体肾动脉与受体腹主动脉行端侧吻合。
6. 在下腔静脉上做相应切口，并使用8-0尼龙缝线将供体肾静脉与受体下腔静脉行端侧吻合。
   注意：受体不进行全身肝素化，以防止过度出血。
7. 首先移除下腔静脉上的血管夹，以建立静脉流出道；随后缓慢移除腹主动脉上的动脉夹，恢复移植肾的血流灌注。
8. 检查止血情况并评估移植物灌注效果，使用棉签压迫任何轻微出血点。
   注意：成功灌注的肾脏应迅速变为粉红色且质地坚实。
9. 通过将供体膀胱片与受体膀胱顶部吻合，完成泌尿道重建，使用10-0尼龙缝线缝合。
10. 切除受体大鼠的双侧自身肾脏，以确保其存活完全依赖于移植肾的功能。
    注意：整个手术过程中，总冷缺血时间（从供体器官获取至再灌注）保持在60分钟以内，热缺血时间（吻合期间）控制在30分钟以内，以最大程度减少缺血性损伤。
11. 使用5-0丝线逐层缝合腹部切口。
12. 伤口缝合后立即皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）以镇痛，肌内注射青霉素（40,000 U/kg）预防感染，并皮下注射1–2 mL温热无菌生理盐水以防止脱水。

5. 术后护理与监测

1. 每日监测受体大鼠的存活情况、行为（警觉性、活动能力）及生理状态（摄食量、排泄情况）。
2. 每日检查手术切口，观察是否有感染或裂开的迹象。
3. 术后前24小时内每小时监测一次大鼠，第2至3天每天至少监测三次，之后每天监测一至两次。
4. 因技术性并发症（如血管血栓、尿液渗漏或出血）导致移植后24小时内死亡的受体大鼠应从最终分析中排除。本研究中，总体手术成功率约为90%。

6. 移植后评估

1. DSA 水平的检测
   1. 在 ST 后第 0、3、7 和 14 天以及 KT 后第 1、3 和 5 天从小鼠尾静脉采集血液样本。
   2. 将样本在约 1500 × g 条件下离心 10 分钟以分离血清，并于 -20 °C 保存至分析前。
   3. 取供体大鼠的脾脏，通过 70 µm 细胞筛在冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）中进行机械解离。使用 ACK 裂解缓冲液裂解红细胞 5 分钟，然后用 PBS 洗涤两次（每次在 300 × g 条件下离心 5 分钟）。计数细胞并将最终浓度调整为 1 × 10⁷ 个细胞/mL。
   4. 用 PBS 将受体血清稀释 1:25。
   5. 将 50 µL 稀释后的血清与 5 × 10⁵ 个供体大鼠脾细胞在 37 °C 下孵育 30 分钟。
   6. 用 2 mL PBS 在 4 °C 条件下以 400 × g 离心 5 分钟，洗涤细胞两次。
   7. 将细胞与 FITC 标记的抗大鼠 IgG 抗体和 PE 标记的抗大鼠 IgM 抗体（具体克隆见材料表）在 4 °C 下孵育 1 小时。
   8. 洗涤细胞后重悬于 PBS 中，调整细胞浓度为 5 × 10⁶ 个细胞/mL。
   9. 使用流式细胞仪分析样本，定量 DSA-IgG 和 IgM 的平均荧光强度（MFI）。
2. 肾移植组织的病理学检查
   1. 在指定时间点获取肾移植组织（ST 后同基因型 KT 组于 KT 后第 5 天取材；ST 后异基因型 KT 组于 KT 后 6 小时、12 小时、1 天、2 天、3 天、4 天和 5 天取材）。
   2. 将组织样本在室温下用 4% 多聚甲醛固定 24 小时。经脱水和透明处理后，将组织包埋于石蜡中并切成 4 µm 厚的切片。
   3. 对切片进行苏木精-伊红（HE）和过碘酸-雪夫（PAS）染色。
   4. 进行免疫组织化学染色时，将切片浸入 EDTA 缓冲液（pH 9.0）中，在压力锅内加热进行抗原修复。达到完全压力后维持 5 分钟，随后自然冷却至室温。
   5. 用 3% 过氧化氢处理切片 10 分钟。
   6. 在 4 °C 下与抗 CD31 和 C4d 的一抗抗体孵育过夜。
   7. 在室温下使用 DAB+ 底物-发色剂显色 30 秒。
   8. 使用数字切片扫描仪扫描染色后的切片。

7. 统计学分析

1. 定量数据以均值 ± 标准差（SD）表示。统计分析使用适当的统计学软件进行。
2. 使用Kaplan-Meier分析评估受体的生存率。
3. 使用Student t检验比较组间的定量数据。
   注：P值 < 0.05 被认为具有统计学显著性。

结果

肾移植存活时间
在同系移植组（syngeneic KT）和同系移植后ST组（syngeneic KT after ST）中，受体在整个为期一个月的观察期内均长期存活，未发生排斥反应。相反，异系移植组（allogeneic KT）和异系移植后ST组（allogeneic KT after ST）的移植物存活时间分别为 (10.0 ± 0.7) 天和 (6.2 ± 1.1) 天，两组之间差异具有统计学意义（图 2A）。

DSA（IgG 和 IgM）水平
在同种异体肾移植（KT）受者接受干细胞移植（ST）后，其血清 DSA-IgG 水平从 ST 后第 7 天至 KT 后第 5 天均显著高于接受 ST 后进行同系肾移植组的受者。在 ST 后第 0 天和第 3 天，两组之间的 DSA-IgG 水平无统计学显著差异。具体而言，在 ST 后第 7 天，同种异体 KT 后 ST 组的 DSA-IgG 水平显著高于对照组（135.0 ± 11.8 vs 76...

讨论

由于急性抗体介导的排斥反应（AAMR）进展迅速且临床预后不良，其在肾移植（KT）中仍然是一个重大挑战^33,34,35,36。即使现有的抗排斥治疗能够有效逆转急性发作，仍有超过40%的患者发展为慢性抗体介导的排斥反应（AMR）。在确诊慢性AMR后，移植物的5年存活率通常低于50%。C4d阳性患者的4年移植物存活率仅为50%，而C4d阴性患者在8年时的移植物存活率仍可维持在约50%³⁷。AAMR的发生主要源于受者免疫抑制不足，导致B细胞活化并产生供体特异性抗体（DSA）^24,29,38,39

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗CD31单克隆抗体	Abcam (UK)	ab64543	用于免疫组织化学（标记血管内皮细胞） 克隆号：TLD-3A12
抗C4d  抗体	Hycult Biotech (荷兰)	HP8034	用于免疫组织化学（检测补体沉积），稀释比例为1:50 克隆号：NA (多克隆)
FITC标记的抗大鼠IgG抗体	Abcam (UK)	ab6840	用于流式细胞术定量检测DSA-IgG水平 克隆号：多克隆
气体麻醉系统	南京卡文生物科技有限公司	KW-MZJ-4	配备异氟烷用于全身麻醉 克隆号：NA (多克隆)
PE标记的抗大鼠IgM抗体	Bio Legend	408918	用于流式细胞术定量检测DSA-IgM水平 克隆号：MRM-47
立体定位手术显微镜	北京中天广正科技有限公司	TS-39NK	用于大鼠肾移植手术操作 克隆号：NA
血管夹（Bulldog夹）	ROBOZ SURGICAL INSTRUMENT CO.	RS-5481T	用于肾移植过程中阻断血流 克隆号：NA