本文描述了建立肾移植中急性抗体介导排斥反应(AAMR)大鼠模型的方法。该模型通过在肾移植前14天,用供体布朗诺瓦鼠的皮肤移植物对受体刘易斯大鼠进行预先致敏而诱导,为研究AAMR的病理生理机制提供了可靠的平台。
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本文描述了建立肾移植中急性抗体介导排斥反应(AAMR)大鼠模型的方法。该模型通过在肾移植前14天,用供体布朗诺瓦鼠的皮肤移植物对受体刘易斯大鼠进行预先致敏而诱导,为研究AAMR的病理生理机制提供了可靠的平台。
急性抗体介导的排斥反应(AAMR)仍然是影响肾移植后移植物长期存活的主要障碍。AAMR 的病理生理机制主要由供体特异性抗体(DSA)驱动,这些抗体可激活补体系统,导致内皮细胞损伤、血管炎以及移植物功能障碍。尽管免疫抑制治疗已取得进展,但 AAMR 的治疗效果仍不理想。因此,建立可靠的 AAMR 动物模型对于深入理解其发病机制并评估潜在治疗干预措施至关重要。本研究通过在肾移植前 14 天对受体 Lewis 大鼠进行供体 Brown Norway 大鼠皮肤移植以诱导致敏,成功建立了大鼠 AAMR 模型。整个研究过程中未对受体大鼠使用任何免疫抑制剂。生存分析显示,预先致敏的同种异体移植组移植物存活时间显著短于未预先致敏组(6.2 ± 1.1 天 vs 10.0 ± 0.7 天,P < 0.001)。血清 DSA-IgG 水平自皮肤移植后第 7 天开始显著升高,并持续上升至肾移植后第 5 天;血清 DSA-IgM 水平则在皮肤移植后第 7 天和第 14 天显著升高。肾移植后 6 小时起,移植物开始出现肾小球炎、肾小管周围毛细血管炎及毛细血管内 C4d 沉积。自肾移植后第 3 天起,观察到明显的移植物损伤和肾小管坏死。这些病理改变随时间逐渐加重,均符合 AAMR 的典型特征。该模型有效再现了 AAMR 的关键特征,为今后研究其潜在机制及治疗方法提供了可靠的实验平台。
肾移植(KT)已成为终末期肾病的关键治疗手段1,2。然而,移植排斥反应仍是影响肾移植器官长期存活的主要因素3,4。临床上观察到的主要排斥类型包括急性排斥反应(AR)和慢性排斥反应(CR)。急性排斥反应进一步分为急性T细胞介导的排斥反应(TCMR)和急性抗体介导的排斥反应(AAMR)5,6,7。近年来,随着免疫抑制剂的发展与应用,TCMR的发生率已得到有效控制。然而,AAMR仍是导致移植器官功能障碍的主要原因之一8,9。
目前普遍认为,急性抗体介导的排斥反应(AAMR)的病理生理学机制是由移植前或移植后产生的供体特异性抗体(DSA)所触发10。当DSA与移植物血管内皮细胞上的抗原结合时,会激活经典补体级联反应,导致膜攻击复合物的形成,进而造成移植物损伤11。在补体激活过程中,裂解片段C4d共价结合于移植物毛细血管内皮细胞表面。此外,趋化因子如补体裂解产物C3a和C5a可招募炎症细胞(例如巨噬细胞)浸润移植物毛细血管,引起毛细血管炎及进一步的移植物损伤12,13。因此,AAMR的临床诊断主要依赖于血清DSA水平升高、毛细血管炎、肾小管坏死以及移植物毛细血管中C4d沉积的证据14,15,16。目前针对AAMR的治疗策略主要包括抑制B细胞或浆细胞活性、清除循环中的DSA以及抑制补体激活,具体方法包括血浆置换、免疫吸附、CD20单克隆抗体(利妥昔单抗)、蛋白酶体抑制剂(硼替佐米)、补体抑制剂(依库珠单抗)以及IgG降解酶(IdeS)17,18,19,20,21,22,23,24,25。然而,总体治疗效果仍不理想,因为在随机对照试验中尚未证实任何标准化疗法具有显著疗效。此外,现有的免疫抑制策略常伴随显著的不良反应负担,尤其是严重感染并发症和恶性肿瘤的发生风险增加21,25,26,27。因此,仍需进一步研究以阐明AAMR的病理生理机制,并开发更有效的治疗方案。
研究疾病机制并探索新的预防策略依赖于小型动物模型,因此在肾移植(KT)中建立可靠的抗体介导的急性排斥反应(AAMR)模型至关重要。本研究团队在构建大鼠肾移植AAMR模型方面具有丰富经验28。本研究采用布朗-挪威(Brown Norway, BN)大鼠向路易斯(Lewis)大鼠进行肾移植。BN(RT1n)与Lewis(RT1l)大鼠属于完全主要组织相容性复合体(MHC)不匹配的品系组合,为同种异体排斥反应提供了坚实的遗传学基础29。相较于其他建模方法,本研究所采用的皮肤移植物预致敏策略在稳健性和生理相关性方面具有明显优势。与依赖短暂抗体注射且缺乏宿主免疫系统参与的被动抗体转移模型不同,这种主动致敏方法可建立长期的免疫记忆,更贴近临床中高度致敏患者的真实情况30。此外,与其他致敏方案(如供体特异性输血)相比,后者可能因实验方案不同而导致抗体滴度不稳定,甚至诱导免疫耐受,而皮肤移植则提供了一种单一、强烈且高度免疫原性的刺激29。这确保了可在明确的5至7天时间窗内,可重复地产生高滴度的供体特异性抗体(DSA),并稳定出现AAMR表型特征(如毛细血管炎、C4d沉积),使其成为评估治疗效果的高效可行平台。我们通过对这些同种异体大鼠在皮肤移植预致敏两周后实施肾移植,成功建立了AAMR模型,并通过血清学、组织病理学及免疫学分析对模型进行了系统评估。
关于该模型的适用性,使用本方案的研究者可预期在移植后第5至7天之间稳定地出现抗体介导的急性排斥反应(AAMR)表型。验证此模型所需的关键检测指标包括:血清供体特异性抗体(DSA,IgG和IgM)产生的动力学特征、肾小球炎和肾小管周围毛细血管炎等微血管炎症的组织学证据,以及肾小管周围毛细血管中弥漫性C4d沉积。然而,读者需注意一个根本性局限:皮肤预致敏方法会引发广泛的同种免疫反应,同时涉及体液免疫和细胞免疫两个分支。因此,该模型通常表现为混合性排斥病理特征——即以AAMR为主,同时伴有T细胞介导的排斥反应(TCMR),而非单纯的抗体介导排斥过程。
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所有动物实验均严格遵守机构指南,并经山东第一医科大学机构动物伦理委员会批准 & 山东省千佛山医院。所有实验程序均遵循3R原则和《赫尔辛基宣言》(批准号:JENNIO-IACUC-2024-A066)。本研究中使用的所有试剂和设备详见于 材料表.
1. 动物准备
2. 预致敏 通过 ST(适用于第2组和第4组)
3. 肾移植供体手术
4. 肾移植受体手术
5. 术后护理与监测
6. 移植后评估
7. 统计学分析
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肾移植存活时间
在同系移植组(syngeneic KT)和同系移植后ST组(syngeneic KT after ST)中,受体在整个为期一个月的观察期内均长期存活,未发生排斥反应。相反,异系移植组(allogeneic KT)和异系移植后ST组(allogeneic KT after ST)的移植物存活时间分别为 (10.0 ± 0.7) 天和 (6.2 ± 1.1) 天,两组之间差异具有统计学意义(图 2A)。
DSA(IgG 和 IgM)水平
在同种异体肾移植(KT)受者接受干细胞移植(ST)后,其血清 DSA-IgG 水平从 ST 后第 7 天至 KT 后第 5 天均显著高于接受 ST 后进行同系肾移植组的受者。在 ST 后第 0 天和第 3 天,两组之间的 DSA-IgG 水平无统计学显著差异。具体而言,在 ST 后第 7 天,同种异体 KT 后 ST 组的 DSA-IgG 水平显著高于对照组(135.0 ± 11.8 vs 76...
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由于急性抗体介导的排斥反应(AAMR)进展迅速且临床预后不良,其在肾移植(KT)中仍然是一个重大挑战33,34,35,36。即使现有的抗排斥治疗能够有效逆转急性发作,仍有超过40%的患者发展为慢性抗体介导的排斥反应(AMR)。在确诊慢性AMR后,移植物的5年存活率通常低于50%。C4d阳性患者的4年移植物存活率仅为50%,而C4d阴性患者在8年时的移植物存活率仍可维持在约50%37。AAMR的发生主要源于受者免疫抑制不足,导致B细胞活化并产生供体特异性抗体(DSA)24,29,38,39
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作者声明无利益冲突。
本研究由国家自然科学基金(82373042)和临床联合创新团队项目资助 & 基础研究(202409),以及山东省自然科学基金(ZR2022QH291,ZR2025MS1199)。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗CD31单克隆抗体 | Abcam (UK) | ab64543 | 用于免疫组织化学(标记血管内皮细胞) 克隆号:TLD-3A12 |
| 抗C4d 抗体 | Hycult Biotech (荷兰) | HP8034 | 用于免疫组织化学(检测补体沉积),稀释比例为1:50 克隆号:NA (多克隆) |
| FITC标记的抗大鼠IgG抗体 | Abcam (UK) | ab6840 | 用于流式细胞术定量检测DSA-IgG水平 克隆号:多克隆 |
| 气体麻醉系统 | 南京卡文生物科技有限公司 | KW-MZJ-4 | 配备异氟烷用于全身麻醉 克隆号:NA (多克隆) |
| PE标记的抗大鼠IgM抗体 | Bio Legend | 408918 | 用于流式细胞术定量检测DSA-IgM水平 克隆号:MRM-47 |
| 立体定位手术显微镜 | 北京中天广正科技有限公司 | TS-39NK | 用于大鼠肾移植手术操作 克隆号:NA |
| 血管夹(Bulldog夹) | ROBOZ SURGICAL INSTRUMENT CO. | RS-5481T | 用于肾移植过程中阻断血流 克隆号:NA |
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