基于深度学习的多关节同步跟踪，客观量化大鼠后肢运动运动学

Summary

该方案利用无标记跑步机测试和深度学习驱动的多关节轨迹自动标记，建立了大鼠后肢运动学评估流程，实现可重复的运动量化。

Abstract

对老鼠步态的准确和客观评估对神经科学和运动机能学研究领域至关重要。传统系统常依赖足迹成像来间接推断步态，但这无法完全捕捉后肢多关节运动学。本研究建立了一种基于无标记的跑步机步态分析系统，将定制深度学习算法与可编程负重支撑跑步机整合，实现多重下肢关节的实时追踪和多维运动学量化。该系统自动提取步态周期参数、关节轨迹、力分布模式以及在调制速度（0-300 mm/s）、倾斜（±30°梯度）和分级重量支撑（0-500 g）条件下的运动平滑度，为神经肌肉行为研究提供客观评估工具。利用脊髓损伤（SCI）模型，结果展示了该系统在检测关节活动范围、轨迹连续性、推进力输出及健康与受伤啮齿动物间运动平滑度等多维差异方面的敏感性，验证了其疾病识别和分级能力。与传统的主观评分或足迹方法相比，该平台消除了个人偏见和低维数据限制，同时结合了深度学习驱动的架构和高通量数据采集的优势。它适用于涉及中枢或周围神经损伤、神经退行性疾病、肌肉骨骼疾病和衰老过程的研究。通过同步整合神经电生理模块，系统进一步实现步态与神经信号的时间耦合，建立了解析中枢-外围控制机制和发展神经调节策略的方法论框架。

Introduction

在当代神经科学和运动学研究中，客观的步态量化现已成为剖析神经肌肉功能、阐明疾病机制和评估康复策略的关键。其高时空分辨率能够捕捉神经指令、肌肉激活特征和骨骼力学之间协同的细微变化，从而为研究脊髓上通路、外周反馈和机械情境的协调奠定了实证基础。可重复的运动学指标提升了病变、退行性变化和治疗效果的检测灵敏度，加速了药物和器械的开发流程^2。

传统评估平台如CatWalk、DigiGait或简化足迹分析，间接基于足底接触模式推断关节运动学。这些方法产生的指标分辨率低且不一致，未能捕捉后肢多关节运动学复杂性 ^3,4。我们方法的总体目标是建立一个高精度、无标记且重量支撑的步态分析系统，专为啮齿动物模型设计。因此，我们建立了一个新框架：（i） 在连续多关节成像过程中，在受控轴向载荷（0-100%体重）下保持啮齿动物直立姿势，（ii） 通过深度学习直接定位矢状面的解剖标志，生成二维空间轨迹，（iii） 导出时间解析的关节角度和段运动学数据用于统计建模⁵.从根本上讲，该框架基于深度学习在计算机视觉任务中的应用，从而实现从视频数据中稳健的联合特征提取。

与现有系统相比，该平台具有四大优势。其无标记操作消除了反光或植入标签，同时显著降低了程序复杂性和运动伪影⁶.集成的力反馈悬挂系统实现了精确的体重分级支撑（0-100%），便于在整个负载到卸载连续体中进行全面的步态评估，这是商用跑步机7所^缺乏的。深度学习架构允许对新菌株、年龄或病理状况进行快速再训练，在可扩展性⁸中优于手动跟踪。高精度的多关节空间坐标使得对关节间运动学进行细致分析，并结合对异常步态模式的定量剖析。

该协议广泛适用。它能够研究脊柱上控制、本体感觉反馈回路以及在调节机械需求下的肌肉协同^效应9。在病理生理学上，它为脊髓损伤（SCI）、中风、神经退行性疾病、周围神经病变和神经肌肉疾病提供敏感的运动生物标志物^8,10。在治疗上，它支持对药物或基于器械的干预进行纵向评估，并从高分辨率运动学中提升统计能力¹¹。模块化架构允许与辅助平台无缝集成，例如肌电图（EMG）或脑信号，促进下肢运动神经相关物的机械解码。

Protocol

所有动物操作均经北京脑研究所机构动物护理与使用委员会批准，并符合实验动物护理与使用指南。未观察到与手术相关的不良事件。

1. 设备准备

1. 打开跑步机系统的电源，选择触摸屏上的 速度控制 按钮。
2. 让皮带以低速运行30秒，观察跑步机皮带是否偏移。
3. 选择 倾斜控制 按钮，将倾斜度设为0°，点击零，确认显示值是否与水平气泡重合。
4. 进入 悬挂 接口，挂上10克的配重，检查张力读数是否接近0.10牛顿。
5. 打开工业个人电脑（IPC），进入视频采集和分析软件。
6. 为当天的实验创建一个目录，包括实验名称、动物编号、实验组、速度、坡度和减重百分比等信息。
7. 将高速工业相机（UC70，分辨率：1280X1024，帧率：60 fps），配备手动对焦镜头（f = 12 mm），安装在铝制支架上。将相机镜头垂直于跑步机的纵轴，以捕捉严格横向的视角，保持距离跑步机皮带平面15厘米的水平工作距离。
8. 用气泡水平仪将镜头水平放置，确保老鼠的躯干占据画面中央三分之二的位置。调整对焦和光圈，直到背面尺（1厘米网格）上的比例线清晰可见。
9. 点击 预览 确认没有拖曳，背景亮度均匀。如果图像太暗，可以使用发光二极管（LED）背光来增加亮度;如果曝光过多，请适当降低增益并缩小光圈。
10. 点击 开始录制 以测试数据录制质量。点击 停止录制 并设置数据存储路径。完成上述设备测试后，开始动物测试。

2. 动物准备与运行测试

1. 将老鼠和原来的笼子一起转移到实验室，让它休息10分钟。在此期间，允许自由获取食物和水。
2. 用电子秤（精确到0.1克）记录体重。加入体重相匹配（±10克）的大鼠，以减少体型带来的混淆影响。
3. 如果后肢的毛色与背景对比不够明显，可以用电动剃须刀轻轻去除大腿外侧和小腿后侧一条1厘米宽的毛发条，以提高关节识别的准确性。
4. 然后用软卷尺测量从臀部到脚踝的直线距离（毫米），这将作为后续步幅标准化的基础。
5. 戴上手套，抓住老鼠，将弹性胸带绕在前腋下，固定在可调节滑轨上。确保带子足够松，可以插入一根手指而不影响动物的呼吸。
6. 在观察屏幕上张力值的同时，缓慢旋转悬挂臂手柄，逐步将其提升到目标减重比。确认老鼠的后肢是否完全接触地面。
7. 调整握把高度。松开顶部的旋钮，将前握杆稍微放在老鼠直立时鼻尖下方，确保动物能轻松抓住，无需过度仰头或弯腰。
8. 在触摸控制屏幕上，将 速度 设置为150毫米/秒， 坡度 为0°。进行10分钟的适应训练，使动物适应特定的体重支持水平。监测大鼠是否有压力信号，比如冻结、排便。
   1. 如果步态保持不规则（定义为[>3次中断/分钟]），则延长持续时间2分钟，最多20分钟。
9. 当大鼠保持连续且均匀的步伐至少60秒且没有拖爪，且尾巴自然垂挂且不僵硬时，适应过程即被视为成功。排除那些在最大适应期后仍未达到这些标准的动物。
10. 输入正式实验所需的参数。在触摸屏上依次输入所需速度（0-300毫米/秒之间的任意值）和倾斜度（−30°到+30°），并选择跑步机皮带的方向。
11. 启动跑步机后，观察老鼠的行走姿势。如果偏离中央三分之一区域，用指节轻轻敲击右侧墙壁一次。大多数动物会自行纠正姿势。如果连续两次纠正无效，则重新定位老鼠并重新录制试验。
12. 稳定后，点击 开始录制 ，并持续录制至少五个完整的步态周期。
13. 每次试炼结束时，立即将速度降至0，解开胸带，将老鼠放回相应的笼子。
14. 休息时给水，试验间至少间隔3分钟。
15. 至少记录三场在相同条件下的试验。如果动物连续跑超过六次，则额外增加2分钟休息，以防止累积疲劳。
16. 在正式实验前连续五天进行预训练：每天以150毫米/秒、0°坡度、零减重速度步行10分钟，观察步态。

3. 步态数据提取

1. 首先，提取包含目标步态的段子，通常约10秒，其中应包含至少10个可分析的稳定步态周期。
2. 将.mov文件导入分析软件，登记大鼠的个体信息，包括编号、组别和实验条件。
   注意：该系统采用YOLO-NAS姿态架构，这是一种为高性能姿态估计优化的先进神经网络。
   数据集构建：模型在一个由6,000帧视频帧组成的稳健数据集上进行训练。这些框架通过DeepLabCut图形用户界面手动标注了五个关键后肢关节（髂嵴、髋关节、膝盖、脚踝和脚趾）的坐标，以确保地面真实的精确性。
   训练：网络在NVIDIA RTX 3080 GPU上进行了迁移学习，将YOLO-NAS Pose权重调整以适应大鼠后肢的具体特征。
   初始化：在软件中选择预训练的“Rat_Hindlimb_YOLO_v1”模型，并将置信阈值设为0.8以排除低确定性关键点。
   在分析阶段，YOLO-NAS姿态模型逐帧处理视频流。与依赖背景减法的传统计算机视觉方法不同，这种深度学习架构直接定位老鼠，并预测边界框内的联合坐标。
   后处理：算法从概率映射中提取x和y坐标。为减轻高频抖动，对原始轨迹施加中位数滤波器（窗口大小：3帧）。
   输出：系统成功锁定视频帧内的五个目标关节，生成整个步态序列的时间分辨率空间坐标。这些数据会自动导出为 .csv 文件用于运动学计算。利用同时捕获的背板尺（1厘米网格），系统建立换算关系，自动计算缩放因子，并将像素坐标批量转换为毫米。
3. 将每个节点随时间变化的空间位置坐标导出为.csv文件，以便后续计算索引。
   注意：软件会自动计算步幅、步频和脚高，并导出五个下肢关节随时间变化的空间位置和角度变化。软件基于脚趾高度，自动将每一步划分为摆动阶段和站姿阶段，并计算每个步态周期中挥杆阶段和站姿阶段的比例。

4. 组间运动学比较

1. 将组内每个步态周期从0%（脚接触）归一化为100%（同样的足接触），以统一不同周期长度，便于组别平均和比较。可用于展示步态动态的图像类型见 补充文件1。

5. 统计分析

1. 所有统计分析均使用GraphPad Prism软件进行。
2. 使用Shapiro-Wilk检验验证数据分布的正态性。
3. 对于运动学验证和身体质量指数（BMI）示范比较，数据以平均±SEM呈现。
4. 使用未配对学生t检验评估两种实验条件之间的差异。
5. 统计显著阈值定义为 *p < 0.05、**p < 0.01 和 ***p < 0.005。请注意，本次试点验证研究共纳入了n=3只大鼠。

6. 电生理模块的嵌入

1. 完成动物建模后，植入电生理记录装置。
2. 在神经记录中，可以在颅骨表面、硬膜外空间或大脑皮层放置电极以记录脑信号。
3. 对于脊髓记录，将记录电极插入椎间孔硬膜外空间。
4. 用于肌电图记录，将双极银线埋入肌肉中以记录肌肉电活动。
5. 植入后，让动物恢复5-7天，每天检查伤口和步态，确保无感染或疼痛迹象，然后再进行跑步机实验。
6. 完成上述设备和动物准备工作。
7. 同步电生理参数和运动视频的收集，确保电生理和视频数据共享相同的时间戳。
8. 数据收集后，在分析过程中将神经信号与视频帧对齐，直观地观察步态周期不同阶段的电生理模式，为探索中枢-外围耦合机制提供直接证据。

Results

跑步机系统结构的示意图和实际照片分别见 图1A和B。该设备能够在无标记的情况下获得高对比度横向图像。跑步机支持速度、坡度、方向和减重调节，并配备数值控制面板。配套软件界面包括实时监控与采集接口，以及视频上传和步态提取分析接口。它内置了深度学习模块，用于自动步态标注，能够在无需人工标注的情况下，以高帧率和高精度获取后肢髂嵴、髋关节、膝盖、脚踝和脚趾关节的连续运动数据（见图1C）。

在健康大鼠与SCI大鼠的比较中，视频提取和同一视野内关键体点的自动注释揭示了不同的运动学表型。重度脊髓损伤大鼠的构建遵循标准方案：T9椎板切除术后，分别以2.0米/秒的速度和2.0毫米深度施加受控机械冲击。SCI患者表现出显著的摆动丧失、髂嵴移位曲线不规则和不齐、关节角度波动增加以及站姿摆动阶段紊乱。摇摆期的持续时间和比例显著减少，而这些指标基本可以保持健康个体的稳定周期性（见

Discussion

该方案描述了基于跑步机的老鼠步态分析系统及其操作程序，为神经肌肉行为研究提供多维度且客观的评估工具。正如在示例研究中SCI与健康大鼠步态参数的组间比较所示，该系统通过连续的高帧率步态视频和AI驱动的自动多关节注释算法，获取受试者下肢的原始空间运动坐标。这支持全面的定量分析和图形表示，包括步态轨迹、相位分割和力指数分布模式。除了脊髓损伤应用外，该系统还促进了对中枢神经系统损伤（如中风、脑出血）、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）、周围神经肌肉病理（如坐骨神经损伤、肌营养不良）以及衰老研究中的步态变化的研究¹³。

该协议的成功实施取决于几个关键步骤。首先，动物适应至关重要，跑步机上的预先训练不足常导致步态不规则，影响运动学分析。我们建议按照方案规定严格的10分钟适应期。其次，光照均匀性直接影响深度学习算法的稳定性。阴影或过曝会导致关键点抖动。第三，确保受试者可比性对于有效的组间分析至关重要。我们强调在比较绝对动力学指标时必须严格匹配受试者（如体重和体型）。然而，对...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
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机械冲击	RWD生命科学，深圳，中国
多通道电物理逻辑记录系统	柯斗（苏州）脑算技术有限公司，及nbsp;	KedouBC RHD128A	KedouBC RHD128A 是一款紧凑型、拥有128通道、具有128个通道 的体内电生理采集系统，专为小型到大型实验动物的高分辨率神经记录而设计。它集成了轻量化的即插即用前置（& 1.3 g）、16位模数转换和可编程放大器，能够捕捉脑电图（EEG）、电磁（ECoG）、LFP、尖峰、肌电图（EMG）和心电图（ECG）信号，范围从0.1 Hz到30 kHz，并配有 ≤2.4 和微距;V系统噪音和>10 GΩ输入阻抗。RHD128A提供强大且可用户扩展的神经数据，加速脑机接口、 神经退行性退行及康复的研究。
跑步机	上海克林科技有限公司	移动计量	MOVEMETRICS 是一款高精度 仪器化跑步机，用于高级啮齿动物步态分析。