本方案建立了一种利用无标记跑台实验结合深度学习驱动的多关节轨迹自动标注技术的大鼠后肢运动学评估流程，可实现可重复的运动量化分析。
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摘要
摘要
大鼠步态的准确且客观评估对于神经科学和运动学研究领域至关重要。传统系统通常依赖足印成像来间接推断步态，无法全面捕捉后肢多关节的运动学特征。本研究建立了一种基于无标记跑台的啮齿类动物步态分析系统，通过将定制的深度学习算法与可编程承重跑台相结合，实现对多个下肢关节的实时追踪及多维运动学量化。该系统可在调节速度（0–300 mm/s）、坡度（±30°梯度）和分级承重（0–500 g）条件下，自动提取步态周期参数、关节轨迹、受力分布模式和运动平滑性，为神经肌肉行为研究提供一种客观的评估工具。利用脊髓损伤（SCI）模型，结果表明该系统在检测健康与损伤啮齿动物之间关节活动范围、轨迹连续性、推进力输出及运动平滑性等多维度差异方面具有高敏感性，验证了其疾病识别与分级能力。与传统的主观评分或足印方法相比，该平台消除了人为偏差和低维度数据的局限性，同时结合了深度学习驱动架构与高通量数据采集的优势。该系统适用于中枢或外周神经损伤、神经退行性疾病、肌肉骨骼疾病以及衰老过程的相关研究。通过同步整合神经电生理模块，该系统还可实现步态与神经信号的时间耦合，为解析中枢-外周控制机制及开发神经调节策略建立方法学框架。
引言
在当代神经科学和运动功能研究中，客观的步态量化对于解析神经-肌肉功能、阐明疾病机制以及评估康复策略至关重要1。其高时空分辨率能够捕捉神经指令、肌肉激活模式与骨骼力学之间协同作用的细微变化，从而为研究脑脊髓上通路、外周反馈与机械环境之间的协调机制建立实证基础。可重复的运动学指标提高了对损伤、退行性改变及治疗效应的检测敏感性，进而加速药物和医疗器械的研发进程2。
传统的评估平台（如 CatWalk、DigiGait 或简化的足迹分析）基于足底接触模式间接推断关节运动学。这些方法产生的指标分辨率低且不一致，难以捕捉后肢多关节运动学的复杂性3,4。本方法的总体目标是建立一种高精度、无标记点且具备体重支撑功能的步态分析系统，专为啮齿类动物模型设计。因此，我们提出一种新框架，该框架：（i）在连续多关节成像过程中，使啮齿类动物在可控轴向负荷（0–100% 体重）下保持直立姿势；（ii）通过深度学习对侧视图像进行分析，直接定位矢状面解剖标志点，生成二维空间轨迹；（iii）导出时间分辨的关节角度和节段性运动学参数，用于统计建模5。从根本上讲，该框架基于将深度学习应用于计算机视觉任务，从而实现从视频数据中稳健地提取关节特征。
与现有系统相比，该平台具有四项关键优势。其无标记操作无需反射性或植入式标记物，显著降低了操作复杂性和运动伪影6。集成的力反馈悬吊系统可实现精确分级的体重支持（0–100%），从而在从完全负重到非负重的整个连续过程中进行全面的步态评估，而这是商用跑步机所不具备的功能7。深度学习架构可快速针对新的品系、年龄或病理状态进行重新训练，在可扩展性方面优于手动追踪方法8。此外，高精度的多关节空间坐标可实现关节间运动学的精细分析，并可对异常步态模式进行定量表征。
该方案具有广泛适用性，可用于研究在调节后的机械负荷下，上脊髓控制、本体感觉反馈回路以及肌肉协同作用机制9。在病理生理学方面，它可为脊髓损伤（SCI）、脑卒中、神经退行性疾病、周围神经病变及神经肌肉疾病提供敏感的运动生物标志物8,10。在治疗应用中，该方法借助高分辨率运动学数据，支持对药物或基于设备的干预措施进行纵向评估，并提高统计效能11。其模块化架构可无缝整合其他互补平台，例如肌电图（EMG）或脑信号记录系统，有助于解析下肢运动中神经活动的潜在机制。
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方案
所有动物实验均经北京脑科学与类脑研究中心机构动物护理和使用委员会批准，并符合《实验动物护理和使用指南》的要求。未观察到与实验操作相关的不良事件。
1. 仪器设备准备
- 打开跑步机系统的电源，然后在触摸屏上选择速度控制按钮。
- 让跑带以低速运行30秒，观察跑步机跑带是否发生偏移。
- 选择坡度控制按钮，将坡度设置为0°，点击“归零”，并确认显示数值与水平气泡管一致。
- 进入悬挂界面，挂上10 g的砝码，检查张力读数是否接近0.10 N。
- 开启工业个人计算机（IPC），并进入视频采集与分析软件。
- 为当天的实验创建一个目录，包含实验名称、动物编号、实验分组、速度、坡度和减重百分比等信息。
- 将配备手动对焦镜头（f = 12 mm）的高速工业相机（UC70，分辨率：1280×1024，帧率：60 fps）固定在铝型材支架上。将相机镜头垂直于跑步机的纵向轴线放置，以获取严格的侧视图像，并保持与跑带平面15 cm的水平工作距离。
- 使用水平气泡管将镜头调至水平，确保大鼠躯干占据画面中央的2/3区域。调节焦距和光圈，直至背侧标尺上的刻度线（1 cm网格）清晰可见。
- 点击预览，确认图像无拖影且背景亮度均匀。若图像过暗，可使用发光二极管（LED）背光源增强亮度；若曝光过度，则适当降低增益并缩小光圈。
- 点击开始录制以测试数据记录质量。点击停止录制并设置数据存储路径。完成上述设备检测后，开始动物实验。
2. 动物准备与跑台实验
- 将大鼠连同其原始笼子一起转移至实验室内，静置 10 分钟。在此期间，自由提供食物和饮水。
- 使用电子天平（精确至 0.1 g）记录体重。选择体重相近（±10 g）的大鼠，以尽量减少体型差异带来的混杂效应。
- 若后肢毛色与背景对比度不足，可使用电动剃毛器轻轻去除大腿外侧和小腿后部一条约 1 cm 宽的毛发区域，以提高关节识别的准确性。剃毛过程中，由经验丰富的操作人员手动固定大鼠，无需麻醉，以尽量减少动物应激。密切观察大鼠是否出现应激或疲劳迹象，例如不愿移动或长时间排便。
- 随后使用软尺测量髋部至踝部的直线距离（mm），该数值将作为后续步态归一化的依据。
- 戴上手套，抓握大鼠，并将弹性胸带绕过前腋下，连接至可调节的滑轨上。确保胸带松紧适度，能插入一根手指且不影响动物呼吸。
- 缓慢旋转悬吊臂手柄，同时观察屏幕上的张力数值，逐步增加至目标减重比例。确认大鼠后肢仍能完全接触地面。
- 调节握杆高度。松开顶部旋钮，将前握杆位置调整至大鼠直立时鼻尖略下方，确保动物能够轻松抓握，而无需过度仰头或弯腰。
- 在触摸控制屏上，将 速度 设置为 150 mm/s ，坡度 设置为 0°。进行为期 10 分钟的适应性训练，使动物适应特定的体重支持水平。监测大鼠是否出现应激表现，例如僵直、排便等。
- 若步态仍不规则（定义为每分钟中断次数[>3 次]），每次延长 2 分钟，最多延长至 20 分钟。若大鼠持续出现拖足或严重应激反应，应立即终止适应性训练。将动物放回其原笼中，至少休息 24 小时后再进行下一次尝试。最多允许进行 3 次适应性训练；若所有尝试均失败，则该动物被排除在正式实验之外。
- 当大鼠能够持续、均匀行走至少 60 秒且无拖足现象，同时尾巴自然下垂无僵硬时，视为适应性训练成功。在达到最大适应时间后仍不符合上述标准的动物应予以剔除。
- 输入正式实验所需参数。在触摸屏上依次输入所需速度（0–300 mm/s 范围内任意值）和坡度（−30° 至 +30°），并选择跑带运行方向。
- 正式实验前连续进行五天预训练：每天以 150 mm/s 速度、0° 坡度、零减重条件下行走 10 分钟，观察步态表现。
- 启动跑台后，观察大鼠行走姿势。若其偏离中央 1/3 区域，可用指关节轻敲右侧壁一次。大多数动物会自行纠正位置。若连续两次纠正无效，则需重新放置大鼠并重新记录试验。如需重新定位和重录试验，应让动物在中性环境中休息 3–5 分钟。
- 待状态稳定后，点击 开始记录 ，连续采集至少五个完整的步态周期。
- 每次试验结束后，立即降低速度至 0，解开胸带，并将大鼠放回相应笼中。
- 试验结束后，将动物放回其原笼，并通过标准饮水瓶自由供水。
- 在相同条件下至少记录三次试验。若某动物连续完成超过六次试验，应额外增加 2 分钟休息时间，以防止累积性疲劳。
3. 步态数据提取
- 首先，提取包含目标步态的片段，通常约为 10 秒，应包含至少 10 个可分析的稳定步态周期。
- 将 .mov 文件导入分析软件，并注册大鼠的个体信息，包括编号、分组和实验条件。
注意：该系统采用 YOLO-NAS Pose 架构，这是一种先进的神经网络，专为高性能姿态估计而优化。
数据集构建：模型在包含 6,000 个视频帧的高质量数据集上进行训练。这些帧通过 DeepLabCut 图形用户界面手动标注了五个后肢关键关节的坐标（髂嵴、髋关节、膝关节、踝关节和趾尖），以确保真实值的精确性。
训练过程：该网络在 NVIDIA RTX 3080 GPU 上进行迁移学习，以使 YOLO-NAS Pose 的权重适应大鼠后肢的特定特征。
初始化设置：在软件中选择预训练的 'Rat_Hindlimb_YOLO_v1' 模型，并将置信度阈值设为 0.8，以排除置信度较低的关键点。
在分析阶段，YOLO-NAS Pose 模型逐帧处理视频流。与依赖背景减除的传统计算机视觉方法不同，该深度学习架构可直接定位大鼠并在边界框内预测关节坐标。
后处理：算法从概率图中提取 x 和 y 坐标。为减少高频抖动，对原始轨迹应用中值滤波器（窗口大小：3 帧）。
输出结果：系统成功锁定视频帧内的五个目标关节，生成整个步态序列的时间分辨空间坐标。这些数据自动导出为 .csv 文件，用于运动学计算。通过同步采集的背板标尺（1 cm 网格），系统建立转换关系，自动计算缩放因子，并批量将像素坐标转换为毫米单位。 - 将各关节随时间变化的空间位置坐标导出为 .csv 文件，用于后续指标计算。
注意：软件自动计算步长、步频和足部高度，并导出五个下肢关节随时间变化的空间位置和角度数据。基于趾尖高度，软件自动将每一步划分为摆动相和支撑相，并计算每个步态周期中摆动相和支撑相所占比例。
4. 组间运动学比较
- 将组内每个步态周期从 0%（足部接触）到 100%（同侧足部再次接触）进行归一化处理，以统一不同的周期长度，便于进行组均值计算和比较。可用于展示步态动态的图像类型详见补充文件 1。
5. 统计分析
- 使用 GraphPad Prism 软件进行所有统计分析。
- 使用 Shapiro-Wilk 检验验证数据分布的正态性。
- 对于运动学验证和体重指数（BMI）演示比较，数据以均值 ± 标准误（SEM）表示。
- 采用非配对 Student's t 检验评估两种实验条件之间的差异。
- 定义统计学显著性阈值为 *p < 0.05，**p < 0.01，以及 ***p < 0.005。请注意，本初步验证研究共纳入 n = 3 只大鼠。
6. 电生理模块的嵌入
注意：为建立实验模型，使用异氟烷对动物进行麻醉（诱导浓度为3%，维持浓度为1.5%–2%）。术前给予布托啡诺（0.05 mg/kg）以提供围手术期镇痛。在完成标准皮肤准备和无菌铺巾后，根据具体记录方式暴露目标组织，以固定记录电极：脑电图（EEG）记录时暴露颅骨表面，脊髓记录时暴露椎间孔，肌电图（EMG）记录时暴露目标后肢肌肉。动物术后每日接受监测。术后前三天继续给予镇痛药物，以确保充分的疼痛管理。在上述相同的麻醉条件下，进行标准的T10椎板切除术。在伤口缝合前，使用校准的落重装置诱导挫伤损伤。所有操作均严格遵循机构动物护理指南。
- 完成动物模型构建后，植入电生理记录装置。
- 进行神经记录时，将电极放置于颅骨表面、硬脑膜外腔或大脑皮层，以记录脑信号。
- 进行脊髓记录时，将记录电极插入椎间孔的硬膜外腔。
- 进行肌电图（EMG）记录时，将双极银丝电极埋入肌肉中，以记录肌肉的电活动。
- 植入手术完成后，让动物在笼中恢复5–7天，每日检查伤口和步态，确保无感染或疼痛迹象后再进行跑台实验。在此期间，不允许进行任何步态记录或跑台测试，以确保动物完全恢复至正常基础步态并完成伤口愈合。
- 按照上述方法完成设备和动物的准备工作。
- 同步采集电生理参数与运动视频，确保电生理数据与视频数据具有相同的时间戳。
- 数据采集完成后，在分析过程中将神经信号与视频帧对齐，以直观观察步态周期不同阶段的电生理活动模式，为探究中枢-外周耦合机制提供直接证据。
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结果
跑步机系统结构的示意图和实际照片分别如图1A、B所示。该设备能够在无需标记物的情况下获取高对比度的侧向图像。跑步机支持速度、坡度、方向和减重的调节，并配备有数控面板。配套软件界面包含实时监控与数据采集界面，以及视频上传与步态提取分析界面。系统内嵌深度学习模块，可实现自动步态标注，无需人工标注即可以高帧率和高精度获取后肢髂嵴、髋关节、膝关节、踝关节和趾关节的连续运动数据（图1C）。
在健康大鼠与脊髓损伤（SCI）大鼠的比较中，通过视频提取并对同一视野内的关键身体点进行自动标注，可揭示出不同的运动学表型。重度脊髓损伤大鼠按照标准方案构建：在T9椎板切除术后，以2.0 m/s的速度和2.0 mm的深度施加可控的机械冲击。SCI个体表现出明显的摆动相丧失、不规则且无节律的髂嵴位移曲线、关节角度波动增加以及站立相与摆动相的紊乱。摆动相的持续时间及其所占比例显著减少，而这些指标在健康个体中基本保持稳定的周期性（见
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讨论
本方案阐述了一种基于跑台的大鼠步态分析系统及其操作流程，为神经肌肉行为学研究提供了一种多维度、客观的评估工具。如示例研究中脊髓损伤（SCI）大鼠与健康大鼠之间的组间步态参数比较所示，该系统通过连续高帧率步态视频记录结合人工智能驱动的自动化多关节标注算法，获取受试动物后肢的空间运动坐标原始数据。由此可实现全面的定量分析与图形化呈现，包括步态轨迹、时相分割以及力指数分布模式等。除脊髓损伤研究外，该系统还可用于中枢神经系统损伤（如脑卒中、脑出血）、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病）、周围神经肌肉病变（如坐骨神经损伤、肌营养不良）以及衰老相关步态改变的研究13。
成功实施本方案依赖于若干关键步骤。首先，动物的适应性至关重要，若在跑台上缺乏充分的预训练，常会导致步态模式异常，从而干扰运动学分析。我们建议严格按照本方案所述进行10分钟的适应性训练。其次，光照的均匀性直接影响深度学习算法的稳定性，阴影或过曝可能导致关键点抖动。第三，确保受试对象之间的可比性是进行有效组间分析的决定性因素。在比较绝对动力学指标时，我们强调必须严格匹配受试对象（...
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披露
本文中使用的 MOVEMETRICS 跑台及 MouseAI 软件算法由上海林岸研科技有限公司开发。作者声明除技术合作外无其他经济利益，该公司未参与数据收集、分析或结果解读，因此不影响研究的客观性。
致谢
本研究得到国家自然科学基金（项目编号：82501640）和中国医学研究院（北京）（项目编号：CX25YQ06）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 步态AI标注 &与采集软件 | 上海ClinAITrial科技有限公司 | MouseAI | MouseAI是集成分析 用于MOVEMETRICS跑带的软件，将视频录制、元数据记录和自动化步态分析整合到单一工作流程中。 |
| 机械冲击 | RWD Life Science，中国深圳 | ||
| 多通道电生理记录系统 | 科都（苏州）脑机技术有限公司 | KedouBC RHD128A | KedouBC RHD128A 是一款紧凑型、128通道 适用于小型至大型实验动物的高分辨率神经记录在体电生理采集系统，集成了轻量化即插即用式前置放大器头级≤ 1.3 克）、16 位 A/D 转换和可编程放大器，可采集频率范围为 0.1 Hz 至 30 kHz 的 EEG、ECoG、LFP、锋电位、EMG 和 ECG 信号 ≤ 2.4 µV系统噪声和 > 10 GΩ 输入阻抗。RHD128A 提供稳定且用户可扩展的神经数据，以加速脑机接口领域的研究， 神经退行性疾病与康复 |
| 跑步机 | 上海ClinAITrial科技有限公司 | MOVEMETRICS | MOVEMETRICS 是一个高精度 用于高级啮齿类动物步态分析的仪器化跑台 |
参考文献
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