本研究利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas）数据，鉴定了肺鳞状细胞癌（LUSC）中一个由10个长链非编码RNA（lncRNA）组成的氧化应激相关特征。尽管验证结果显示其临床预测效能有限，但该特征可区分免疫微环境模式， 体外 支持的检测方法 LINC01615 作为迁移-侵袭相关候选分子，用于进一步的机制研究。
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研究文章
* These authors contributed equally
本研究利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas）数据，鉴定了肺鳞状细胞癌（LUSC）中一个由10个长链非编码RNA（lncRNA）组成的氧化应激相关特征。尽管验证结果显示其临床预测效能有限，但该特征可区分免疫微环境模式， 体外 支持的检测方法 LINC01615 作为迁移-侵袭相关候选分子，用于进一步的机制研究。
长链非编码RNA（lncRNA）对肺鳞状细胞癌（LUSC）的预后价值及免疫浸润具有重要影响。本研究旨在阐明与氧化应激相关的lncRNA如何影响肺鳞状细胞癌（SCC）。研究采用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据集，收集了LUSC的转录组信息及相关临床资料。通过一系列生物信息学分析，比较氧化应激相关基因在肿瘤组织与正常组织中的异常表达情况及其与恶性程度的关联，筛选出10个与预后相关的基因，用于构建预后模型。根据该10基因特征所计算的中位风险评分，将研究对象分为高风险组与低风险组。尽管该数学风险模型在验证队列中的独立预测效能有限（AUC约0.5），但功能与免疫学评估显示，不同风险分层间的肿瘤微环境（TME）存在显著差异。具体而言，高风险患者相较于低风险患者表现出独特的免疫细胞浸润特征及不同的免疫评分。因此，该氧化应激相关lncRNA特征虽不直接作为临床预测工具，却为深入理解LUSC的免疫图谱提供了重要的生物学见解，并提示了潜在的治疗靶点，值得进一步开展机制研究。
肺癌在全球恶性肿瘤中的发病率和死亡率均居首位1。在非小细胞肺癌（NSCLC）的组织学亚型中，肺鳞状细胞癌（LUSC）是主要亚型之一，常与较差的临床预后相关，且相较于肺腺癌，缺乏高效的靶向治疗手段2。尽管主要治疗方式包括手术干预、放射治疗和化学治疗，但晚期肺鳞状细胞癌患者常出现治疗耐药3。因此，迫切需要鉴定可靠的分子生物标志物，以改善肺鳞状细胞癌的预后分层，并指导探索性治疗策略的制定4。
氧化应激以活性氧（ROS）的病理性积聚为特征，在肿瘤的发生、生长和转移过程中发挥关键作用。当缺乏有效的ROS清除机制时，升高的ROS水平会诱导DNA损伤和基因毒性，最终导致多种基因组改变，从而促进癌症的发展。值得注意的是，多项研究一致表明，在肺癌的发病机制中，ROS水平和氧化应激显著升高5,6。最近的研究进一步指出，与氧化应激相关的基因簇可能在肺部恶性肿瘤中作为潜在的预后生物标志物发挥作用7。长链非编码RNA（lncRNA）已被确认为基因表达的关键调控因子，并在多种恶性肿瘤中展现出作为预后生物标志物的良好前景。尽管先前一项重要研究7已成功建立了与氧化应激相关的肺腺癌（LUAD）lncRNA预后模型，但此类lncRNA在肺鳞状细胞癌（LUSC）中的具体预后特征及其免疫学意义仍 largely 未被探索。
在本研究中，作者系统分析了TCGA数据集，以构建一种新型的与氧化应激相关的lncRNA特征，专门用于LUSC。此外，与纯生物信息学分析不同，本研究还整合了 体外 通过实验验证来确认关键鉴定出的长链非编码RNA（如Linc01615）的生物学功能作用。本研究并非旨在立即主张其在诊断和治疗决策中的临床适用性，而是主要探索氧化应激在肺鳞状细胞癌（LUSC）中的潜在作用机制及其与肿瘤免疫微环境的相关性。这些发现旨在提供有价值的生物学见解，并为后续的机制研究揭示潜在的治疗靶点。
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数据采集与预处理
本研究中分析的所有数据均来自公开可获取的TCGA数据库，如文中所列 材料表本研究严格遵守美国国立卫生研究院（NIH）基因组数据共享政策以及癌症基因组图谱（TCGA）提供的发表指南。由于所用数据集由去标识化的公开临床与多组学数据组成，本研究免于进一步的机构审查委员会（IRB）审批。肺鳞状细胞癌（LUSC）的转录组数据及相应临床信息从癌症基因组图谱（TCGA）数据库中下载获取。初始队列共包含551个样本（502个肿瘤样本和49个正常样本）。为确保本预后模型的稳健性，剔除了缺乏完整总生存期（OS）数据、生存状态或关键临床特征的患者，未纳入后续生存分析。经过严格筛选后，最终确定包含470例LUSC患者的分析队列。这470例患者随后被随机分为训练集（n = 235）和测试集（n = 235），用于构建和验证风险模型。通过GeneCards数据库共收集到792个与氧化应激相关的基因，列于 材料表，采用相关性评分≥7作为纳入标准。使用limma软件包（版本3.66.0）筛选差异表达的氧化应激基因。利用ggplot2软件包（版本4.0.2）生成火山图。训练组与测试组之间的临床特征无明显差异（p > 0.05）。训练集用于模型构建，测试集用于内部验证。
风险模型的构建与验证
为了鉴定与氧化应激相关的长链非编码RNA（lncRNA），进行了皮尔逊（Pearson）共表达分析。作者评估了TCGA-LUSC数据集中鉴定出的差异表达氧化应激相关基因的表达谱与所有已注释的lncRNA之间的相关性。共表达lncRNA的筛选标准设定为相关系数 |R| > 0.4 且 p 值 < 0.001。根据这些阈值，共获得并提取出6,088个候选的氧化应激相关lncRNA。随后，通过LASSO回归及互补性分析方法对这6,088个候选lncRNA进行评估，以构建预后风险模型。利用处理后的数据，将患者分为高风险和低风险组别。
独立因素与ROC曲线
采用单变量和多变量 Cox 回归模型来确定独立的预后变量。具体而言，在进行多次单变量 Cox 回归分析（n = 236 次检验）时，为控制整体误差率，应用了 Bonferroni 校正，将严格调整后的显著性阈值设定为 p < 0.00021（计算方法为 0.05 / 236）。
生存分析与主成分分析
采用生存分析包（survival package，版本 3.8-6）计算总生存率（OS），并使用主成分分析（PCA）评估风险模型的稳健性。
列线图
使用 R 中的 rms 包评估列线图的拟合指数以评价其可靠性。采用 maftools 包（版本 2.22.0）对肿瘤突变负荷（TMB）进行评估和可视化。使用包括 ssGSEA 在内的算法检测免疫浸润情况。此外，使用 ggpubr 包（版本 0.6.3）比较不同风险组之间的免疫检查点。采用 ESTIMATE 算法对肿瘤微环境（TME）进行特征分析。
功能分析
使用 R 中的 clusterProfiler 软件包（版本 4.14.6）进行富集分析。为进一步探索功能通路，进行了 GSEA 分析。利用 Cytoscape 构建共表达网络以进行观察。
实验方法
细胞培养条件与分组
人肺鳞状细胞癌细胞系 NCI-H520（RRID: CVCL_1566；见材料表）在添加了10%（v/v）胎牛血清和1%青霉素-链霉素的 RPMI-1640 培养基中培养。将对数生长期的细胞接种至6孔培养板中。待细胞成功贴壁后，随机分为三个不同的实验组：在标准培养条件下维持的空白对照组、转染非靶向 siRNA 的阴性对照组（si-NC），以及转染LINC01615特异性 siRNA 的实验敲低组（si-LINC01615）。
细胞转染
将si-LINC01615和si-NC试剂在冰上解冻。在制备转染复合物时，向无菌离心管中加入95 µL无血清RPMI-1640培养基，随后依次加入3 µg相应的siRNA和5 µL Lipo3000转染试剂。siLINC01615组和siNC组均采用相同的步骤。轻轻混匀后，于室温孵育5分钟以促进复合物形成，每管总体积约为200 µL。随后，将该混合液均匀加入含有800 µL RPMI-1640基础培养基的指定培养孔中。在37 °C孵育6小时后，小心吸除转染培养基，并更换为新鲜的完全培养基。
伤口愈合（划痕）实验
在伤口愈合实验中，将对数生长期的 NCI-H520 细胞（RRID: CVCL_1566）以每孔 5.6 × 105 个细胞的密度接种于 6 孔培养板中。当细胞融合度达到 95–100% 时，使用无菌的 200 µL 移液枪头沿孔板中央垂直划线，人为制造一条线性划痕以形成伤口。随后用 PBS 洗涤孔板三次，以去除脱落的细胞和细胞碎片，并将细胞置于无血清的 RPMI-1640 培养基中培养。使用倒置显微镜在 0、24 和 48 小时捕获相同划痕区域的图像。使用 ImageJ（RRID: SCR_003070；见材料表）测量划痕间隙距离，定量分析伤口愈合面积，并以 0 小时的初始伤口面积为基准计算细胞迁移率。
Transwell 迁移和侵袭实验
细胞迁移和侵袭能力通过配备孔径为8.0 µm聚碳酸酯膜插件的24孔Transwell小室进行评估，相关材料列于材料表中。在侵袭实验中，将50 µL Matrigel（用无血清培养基按1:8稀释；见材料表）预先包被于上室，并在37 °C孵育2 h以使其聚合；而迁移实验则使用未包被的插件。细胞转染并经24 h无血清饥饿处理后，收集NCI-H520细胞，重悬于无血清RPMI-1640培养基中，并以每孔200 µL接种至Transwell上室，密度为1.8 × 105 个细胞/孔。下室加入600 µL含10% FBS的RPMI-1640培养基作为趋化因子。在37 °C、5% CO₂条件下孵育48 h后，取出插件并用PBS洗涤三次。用湿润的棉签轻轻擦去膜上表面未迁移的细胞。穿过膜并迁移或侵袭至下表面的细胞用4%多聚甲醛固定20 min，随后在室温下用吉姆萨染液（见材料表）染色30 min。使用倒置显微镜在40倍放大倍数下，对每个插件随机选取的三个光学视野中的迁移或侵袭细胞进行观察和计数。
统计学分析
所有统计分析和数据可视化均使用 R 软件（版本 4.1.2；RRID: SCR_001905；列于 材料表）。本研究中使用的所有R软件包的具体版本号均已在其相应的方法学小节中明确列出。显著性值按惯例定义为 p < 0.05，除非另有说明。当进行多重比较时（例如，多个单变量Cox回归），严格应用Bonferroni法以控制整体误差率（FWER），具体调整后的阈值（例如，p < 0.00021）详见相应的方法学小节。定量 体外 数据以均值 ± 标准差表示，并根据情况采用 Student's t 检验或单因素方差分析（one-way ANOVA）进行分析。
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氧化应激相关差异表达基因的鉴定
工作流程如图1所示。最终纳入分析的470例肺鳞状细胞癌（LUSC）患者的临床特征详见表1。根据相关性评分≥7的预设阈值，作者从GeneCards数据库中检索到共792个与氧化应激相关的基因（补充文件1）。在正常组织与LUSC样本之间，有178个氧化应激相关基因的表达水平发生显著改变（补充文件2）。这些基因的表达模式在火山图（图2A）和热图（图2B）中进行了可视化展示。其中，10个基因表达上调，168个基因表达下调。
风险建模与验证
首先，通过共表达分析鉴定出6,088个候选的氧化应激相关lncRN...
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肺鳞状细胞癌（LUSC）是非小细胞肺癌中一种主要且高度侵袭性的组织学亚型，常表现为极差的生存率以及对传统治疗方式的耐药性8,9。越来越多的证据表明，氧化应激在多种恶性肿瘤的发病机制和进展过程中起着关键驱动作用。活性氧（ROS）的病理性积累以及细胞抗氧化防御系统（如KEAP1/NRF2信号轴）的失调，深刻影响着肺癌的肿瘤起始、细胞凋亡及治疗耐药性10,11,12。因此，识别可靠的与氧化应激相关的预后生物标志物，对于优化LUSC患者的危险分层并探索新的治疗脆弱性至关重要。
在本研究中，作者选取了10个与氧化应激相关的lncRNA构建风险模型。尽管这10个特定lncRNA在肺鳞状细胞癌（LUSC）中的综合功能机制仍有待进一步阐明，但其中部分成员已在其他...
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作者声明无任何竞争利益。在手稿撰写过程中未使用任何人工智能（AI）工具或AI辅助技术；所有科学内容、分析、原始数据和结论均由作者独立生成、审阅和批准。
本工作得到国家自然科学基金（项目编号：8200430）的资助。我们诚挚感谢参与本研究的各方贡献者与机构，包括湖南中医药大学及湖南省中医药研究院附属医院，感谢他们提供的资源与支持。同时，我们也向所有为本研究作出贡献的研究人员和参与者表示衷心感谢。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 4% 多聚甲醛 | Beyotime | P0099 | 用于固定细胞 |
| Cytoscape | Cytoscape 联盟 | https://cytoscape.org/ | 用于共表达网络的构建 |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10099-141 | 终浓度 10% (v/v) |
| GeneCards 数据库 | GeneCards 人类基因数据库 | https://www.genecards.org/ | 氧化应激相关基因筛选 |
| 吉姆萨染色 | Sigma-Aldrich | GS500 | 用于染色迁移/侵袭的细胞 |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | https://imagej.nih.gov/ij/ | 用于伤口间隙的定量分析 |
| Lipo3000 转染试剂 | GLPBIO | GK20006 | 用于siRNA转染 |
| Matrigel | 康宁 | 356234 | 用无血清培养基按1:8比例稀释 |
| 人肺鳞状细胞癌 NCI-H520 细胞系 | ATCC | HTB-182 | 用于体外验证实验 |
| PBS（磷酸盐缓冲盐水） | Gibco | 10010-023 | 用于细胞洗涤 |
| 青霉素-链霉素（1%） | Gibco | 15140-122 | 细胞培养抗生素添加剂 |
| R 软件（v4.1.2） | R 基金会 | https://www.r-project.org/ | 统计分析与可视化 |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875-093 | 细胞培养基 |
| 癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA） | 基因组数据共享平台 | https://portal.gdc.cancer.gov/ | 转录组 &和临床数据来源 |
| Transwell 小室（8.0 μm) | 康宁 | 3422 | 用于迁移和侵袭实验 |