方法文章

激光捕捉显微解剖对甲醛固定小鼠肝组织用于RNA分析

DOI：

10.3791/69814

⸱

2026年4月17日

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Southern Medical University, 2School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 3School of Pharmaceutical Science, Southern Medical University, 4Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co., Ltd., 5The Seventh Affiliated Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本协议描述了一种利用激光捕捉显微解剖，从对甲醛固定、最佳切割温度化合物嵌入小鼠肝脏组织的特定组织学区域中分离RNA的方法，实现针对性的下游基因表达分析。

摘要

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激光捕捉显微解剖（LCM）通过原 位 可视化和分离，提供对复杂组织中特定细胞群体的空间访问。为实现对固定组织中组织学定义区域的转录组分析，提出了一种详细的LCM协议，用于从固定对甲醛（PFA）固定、最优切割温度（OCT）化合物嵌入的小鼠肝切片中提取RNA。该方案详细说明了通过组织固定、蔗糖脱水、OCT嵌入、冷冻切割、赤木精染色以及激光捕捉目标组织学区域的工作流程，识别和采集微尺度样本（约1000个细胞）。通过该方法，获得了高纯度RNA（A260/A280：1.9-2.1）。RNA完整性数（RIN）为6.7±0.9，反映了PFA固定时预期的碎片化。然而， β肌动蛋白 的定量PCR检测Ct值为17-19，且使用片段优化文库制备进行的RNA测序产生了高质量的读段，>90%的碱基达到Q20和Q30阈值，确认该RNA适合敏感的下游分析。因此，该方案通过提供来自PFA固定肝组织特定组织学区域的明确纯度和完整性RNA，实现空间分辨的靶向基因表达分析。

引言

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准确获取空间分辨的基因表达谱对于理解健康和疾病中的组织异质性至关重要。单细胞RNA测序（scRNA-seq）具有高细胞分辨率1,2，但会失去原生空间环境，并在组织解离过程中可能改变转录谱3,4。对于缺乏公开特定标记的细胞类型，利用基于免疫荧光的分选或免疫磁分离获得纯细胞群仍然困难 5,6。空间转录组学技术如Visium和GeoMx允许原位捕获高通量基因表达数据，但其空间分辨率在单细胞或亚细胞层面有限，7,8。相反，基于成像的空间转录组学可达到纳米级分辨率，但基因检测通量有限，9。这凸显了针对特定形态区域假设驱动分析的持续空白。

激光捕捉显微切割（LCM）允许显微镜引导下，根据可观察的表型选择并分离组织切片或活细胞培养中的特定细胞。这种方法保留了细胞结构和空间信息

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方案

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所有动物处理和护理程序均按照伦理指南执行，并经南方医科大学动物伦理委员会批准。该方法使用成年雄性 C57BL/6J 小鼠，并在高脂肪、高糖、缺乏胆碱的饮食下维持，以模拟代谢相关脂肪性肝炎（MASH）。在采集肝组织之前，动物们通过斩首安乐死。

1. PFA固定试样的制备

  1. 将新鲜肝组织样本（单个肝叶，厚度不超过5毫米）置于30毫升冷的4%PFA（新鲜制备）中，4°C浸泡24小时。
    注意：建议以×磷酸盐缓冲盐水（PBS，1×，通常成分为137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄和1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.4）溶液灌注肝脏5分钟，随后用4% PFA灌注固定5分钟。或者，组织也可以用10%福马林溶液固定。
    注意：PFA固定液有毒。所有PFA废弃物必须收集在指定且标识良好的化学废物容器中，以符合机构和地方法规。
  2. 用无RNase的1× PBS溶液清洗固定组织样本3×次，每次5分钟。
  3. 将固定的肝组织放入一个50毫升的管子，内装50毫升30%蔗糖（新鲜制备于无菌1×PBS）。将样品保持在4°C下10-12小时。
  4. 将组织样本从蔗糖溶液中取出。对样品进行修剪，获得易于操作的块状物（约5毫米×3毫米×5毫米），然后将样品嵌入含OCT化合物的低温软....

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结果

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实验工作流程包括PFA固定、30%蔗糖脱水、OCT嵌入与冷冻切割、血液素染色、通过LCM识别和精确采集目标区域（~1000个细胞）、细胞裂解、RNA分离、RNA质量控制指标以及两项关键分析应用，详见 图1。PEN载玻片上被血肉素染色的肝脏切片在显微镜下展示，在（图2A）和（图2B）激光捕捉微尺度肝组织之前。表现出微囊泡脂肪变的关注区域被精确收集到PCR管的盖子中，保持了完整的细胞形态（图2C）。

每次复制共提取约1,000和2,000个LCM捕获细胞的RNA，分别获得110.7±11.8 ng和213.3 ±26.2 ng（见图3A）。所有样品纯度较高，A260/A 280比值.......

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讨论

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LCM的优势在于其精准的原位捕捉选定的细胞或组织区域，便于研究异质组织中特定区域。但其样品产率低、工艺耗时、成本高以及对专业设备的依赖限制了该技术在实验室23的广泛应用。本研究建立了LCM-RNA协议，以克服关键的历史局限性。该方案实现了快速的血液染色步骤（约10秒），并通过采用PFA/OCT嵌入代替FFPE，消除了许多固定组织方案中耗时的二甲苯脱烷烃步骤。单管采集策略避免中间转移，减少样品损失和移液步骤。用安装介质密封膜周边可以防止常见的水化问题，提高首次尝试的成功率和切割效率22。通过使用PFA适应RNA提取试剂盒，确保了交联RNA的高效回收。配合超灵敏的文库制备试剂盒，该方法成功从皮克克级RNA中提取RNA。此外，组织切片厚度被设定在5-15微米范围内。正如先前方法学研究10,19所示，5微米以下的切片可能无法提供完整的细胞剖面以实现可.......

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披露

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作者无需声明利益冲突。

致谢

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这项工作部分得到了中国国家自然科学基金会（82070589）、广东自然科学基金会（2022A1515010218）以及广州科技计划项目（206077078001）对王严教授的资助。我们感谢南方医科大学生物医学研究中心提供技术支持并提供激光捕捉显微解剖系统的访问权限。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>材料<强>
0.2毫升薄壁管阿克西根PCR-02-CLCM采集管
1.5毫升离心管阿克西根339653
4% 对甲醛利阿金东风0135
50毫升离心管热飞世科学339653
DEPC（二乙基焦碳酸酯）西格玛D-5758
DNase I 消化集奇根73504RNeasy FFPE套件的组成部分，包括DNase I库存溶液和DNase增强缓冲液
乙醇（100%）赛莫飞世尔科学BP2818分子生物学纯化
乙醇基洗涤缓冲剂奇根73504缓冲 RPE（RNeasy FFPE 套件的组成部分）
高盐洗冲缓冲液奇根73504缓冲红细胞（RNeasy FFPE套件的组成部分）
低矮切片机刀片徕卡生物系统819
迈耶S型血液素利阿金DH0001
OCT复合体樱花4583
PEN膜涂层载玻片徕卡11505188
磷酸盐缓冲盐水利阿金CC0010无DNase/RNase
聚L-赖氨酸麦克林P875131S
蛋白酶K消化缓冲液奇根73504缓冲液PKD（RNeasy FFPE套件的组成部分）
净化柱奇根73504RNeasy MinElute 旋转柱（RNeasy FFPE套件的组成部分）
定量PCR主混合宝简介RR820ATB Green 预混 Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）
逆转录套件奇根205411QuantiNova 反向转录套件
RNA提取套件奇根73504RNeasy FFPE套件
RNA测序套件（低输入，链条）宝简介634412SMARTer链全RNA测序套件——pico输入哺乳动物v2
RNase去污剂太阳生物SR0040清洁
蔗糖麦克林S818049
<强壮的>动物和饮食<强壮的强壮者>
鼠标：C57BL/6J广东省实验动物中心03
<强健>特殊饮食与喝水
高脂肪、缺乏胆碱的饮食（基础饮食）TROPHIC动物饲料高科技有限公司TP36310M三大营养素：蛋白质，14千卡%;碳水化合物，26千卡%;脂肪，60千卡）
含糖饮用水麦克林不适用（内部准备）在高压灭菌饮用水中加入了D-葡萄糖（Macklin，编号#F87500）和D-果糖（Macklin，编号#S818049），最终浓度为42克/升，葡萄糖与果糖的比例为55：45（水对水）
<强力>鼠底漆
β-actin（前发：AGAGGGAAATCGTGGGTGAC ）华大测序定制版高效液相色谱纯化
β-actin（反向：CAATAGTGATGACCTGGCCGT）华大测序定制版高效液相色谱纯化
<强壮>装备
低温切片机徕卡生物系统CM3050 S
生物分析仪系统安捷伦G2939BA
高通量测序平台光辉;公司NovaSeq 6000 系统
激光捕捉显微解剖系统徕卡微系统徕卡LMD6500
定量PCR系统应用生物系统QuantStudio 5 实时PCR系统
分光光度计热飞世科学NP80纳米滴落
热循环器BioRadT100
<强>软件
Adobe Illustrator CC 2019（版本 23.0.2）土坯屋https://www.adobe.com/products/illustrator.html
GraphPad 棱镜（版本 8.3.0）GraphPad 软件https://www.graphpad.com

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  2. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global ....

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