本方案描述了一种利用激光捕获显微切割技术，从经多聚甲醛固定、OCT包埋的小鼠肝组织中分离特定组织学区域RNA的方法，可用于靶向性的下游基因表达分析。
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方法文章
激光捕获显微切割用于RNA分析的多聚甲醛固定小鼠肝组织
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
激光捕获显微切割（LCM）通过复杂组织中特定细胞群体的空间定位，实现对其的精确获取 原位 可视化与分离。为实现对固定组织中经组织学界定区域的转录组学分析，本文提供了一项详细的激光显微切割（LCM）方案，用于从多聚甲醛（PFA）固定、OCT包埋的小鼠肝脏切片中提取RNA。该方案详细描述了通过一系列流程识别并采集微尺度样本（约1,000个细胞），包括组织固定、蔗糖脱水、OCT包埋、冷冻切片、苏木精染色以及靶向组织区域的激光捕获。采用此方法可获得高纯度RNA（A260/A280：1.9-2.1）获得。RNA完整性指数（RIN）为6.7 ± 0.9，反映了与PFA固定相关的预期片段化程度。然而，定量PCR用于 β-actin 获得的Ct值为17-19，采用片段化优化的文库制备方法进行RNA测序，产生了高质量的读长，且 >90% 的碱基达到 Q20 和 Q30 阈值，证实该 RNA 适用于高灵敏度的下游分析。因此，本方案通过从 PFA 固定的肝组织特定组织学区域获取具有明确纯度和完整性的 RNA，实现了空间分辨的靶向基因表达分析。
引言
准确获取空间分辨的基因表达谱对于理解健康和疾病状态下的组织异质性至关重要。单细胞RNA测序（scRNA-seq）具有高细胞分辨率1,2，但会丢失原有的空间位置信息，并可能在组织解离过程中改变转录谱3,4对于缺乏公开明确特异性标志物的细胞类型，仍难以通过基于免疫荧光的分选或免疫磁珠分离方法获得纯细胞群体5,6空间转录组学技术（如 Visium 和 GeoMx）可实现 原位 获取高通量基因表达数据，但其在单细胞或亚细胞水平上的空间分辨率有限7,8相反，基于成像的空间转录组学可实现纳米级分辨率，但其基因检测通量有限9这凸显了在特定形态学区域进行假设驱动分析方面长期存在的空白。
激光捕获显微切割（LCM）技术可在显微镜引导下，根据可观察的表型特征，从组织切片或活细胞培养物中选择并分离特定细胞。该方法能够保持细胞结构和空间信息
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方案
所有动物操作和护理程序均遵循伦理准则，并经南方医科大学动物伦理委员会批准。所述方法采用成年雄性 C57BL/6J 小鼠，并通过高脂、高糖、胆碱缺乏饮食诱导代谢相关性脂肪性肝炎（MASH）模型。在采集肝组织前，动物通过断头法实施安乐死。
1. PFA固定样本的制备
- 将新鲜肝组织样本（单个肝叶，厚度 ≤5 mm）置于 30 mL 冰冷的 4% 多聚甲醛（PFA，现配）中，于 4 °C 固定 °4 ℃孵育24小时。
注意：建议用磷酸盐缓冲液（PBS，1×，通常由137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂人类表型本体₄，以及 1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.4）溶液中于1× 5分钟内进行灌注固定，随后用4% PFA灌注固定5分钟。或者，也可将组织固定于10%福尔马林溶液中。
警告：PFA固定液具有毒性。所有PFA废弃物必须收集至指定的、正确标记的化学废液容器中，并遵守机构及当地法规。 - 洗涤固定后的组织样本3次× 用无RNase的水洗涤5分钟，重复1次× PBS 溶液
- 将固定后的肝组织放入装有50 mL新鲜配制于无菌1×磷酸盐缓冲液中的30%蔗糖的50 mL离心管中× PBS）。将样品置于4 °4°C....
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结果
实验流程包括PFA固定、30%蔗糖脱水、OCT包埋和冷冻切片、苏木精染色、通过激光显微切割技术（LCM）识别并精确采集目标区域（约1,000个细胞）、细胞裂解、RNA提取、RNA质量控制指标，以及两个关键的分析应用，如图1所示。在激光捕获微尺度肝组织前后，PEN载玻片上经苏木精染色的肝组织切片在显微镜下的图像分别如图2A和图2B所示。表现出微泡性脂肪变性的感兴趣区域被精确采集至PCR管盖中，同时保持了完整的细胞形态（图2C）。
每份重复实验分别从约 1,000 和 2,000 个激光显微切割捕获的细胞中提取总 RNA，产量分别为 110.7 ± 11.8 ng 和 213.3 ± 26.2 ng（图 3A）。所有样本均显示高纯度，A260/A280
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讨论
LCM 的优势在于其精确性， 原位 特定细胞或组织区域的捕获，有助于对异质性组织内特定区域的研究。但该技术存在样本得率低、耗时长、成本高以及需要专用设备等局限性，限制了其在实验室中的广泛应用23本研究建立了LCM-RNA实验方案，以克服以往的关键技术局限。该方案采用快速苏木精染色步骤（约10秒），并通过使用PFA/OCT包埋替代FFPE，避免了多种固定组织方案中耗时的二甲苯脱蜡步骤。单管收集策略避免了中间转移过程，减少了样本损失和移液操作。使用封片介质密封膜的边缘可防止常见的水化问题，提高首次操作成功率并提升实验效率22通过使用适配PFA的RNA提取试剂盒，确保了交联RNA的高效回收。结合超灵敏文库构建试剂盒，该方法能够成功从皮克量级的RNA产出中提取RNA。此外，组织切片厚度设定为5-15 µm。上述参数选择得到了先前方法学研究的支持。10,19切片厚度小于5 µm可能无法提供完整的细胞轮廓，从而影响可靠捕.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分得到了中国国家自然科学基金（82070589）、广东省自然科学基金（2022A1515010218）和广州市科技计划项目（206077078001）对王 Yan 教授的资助。我们感谢南方医科大学 biomedical research center 提供技术支持以及使用激光捕获显微切割系统的机会。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>材料 | |||
| 0.2 ml 薄壁管 | Axygen | PCR-02-C | 用于LCM收集的管子 |
| 1.5 mL 离心管 | Axygen | 339653 | |
| 4% 多聚甲醛 | Leagene | DF0135 | |
| 50 mL 离心管 | 赛默飞世尔科技 | 339653 | |
| DEPC（焦碳酸二乙酯） | Sigma | D-5758 | |
| DNase I 消化试剂盒 | Qiagen | 73504 | RNeasy FFPE 试剂盒组分，包含 DNase I 储存液和 DNase 增强缓冲液 |
| 乙醇（100%） | 赛默飞世尔科技 | BP2818 | 分子生物学纯化 |
| 基于乙醇的洗涤缓冲液 | Qiagen | 73504 | Buffer RPE（RNeasy FFPE试剂盒组分） |
| 高盐洗涤缓冲液 | Qiagen | 73504 | 缓冲红细胞（RNeasy FFPE 试剂盒组分） |
| 低剖面切片机刀片 | Leica Biosystems | 819 | |
| Mayer’苏木精染色 | Leagene | DH0001 | |
| OCT包埋剂 | 樱花 | 4583 | |
| 聚乙烯膜包被载玻片 | Leica | 11505188 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Leagene | CC0010 | 无DNase/RNase |
| 聚-L-赖氨酸 | Macklin | P875131S | |
| 蛋白酶K消化缓冲液 | Qiagen | 73504 | Buffer PKD（RNeasy FFPE 试剂盒组分） |
| 纯化柱 | Qiagen | 73504 | RNeasy MinElute 离心柱（RNeasy FFPE 试剂盒组分） |
| 定量PCR预混液 | Takara Bio | RR820A | TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) |
| 逆转录试剂盒 | Qiagen | 205411 | QuantiNova 反转录试剂盒 |
| RNA提取试剂盒 | Qiagen | 73504 | RNeasy FFPE 试剂盒 |
| 低输入量链特异性RNA测序试剂盒 | Takara Bio | 634412 | SMARTer链特异性总RNA测序试剂盒 - 超低起始量哺乳动物v2 |
| RNase 去污染剂 | Solarbio | SR0040 | 清洗 |
| 蔗糖 | Macklin | S818049 | |
| <强>动物与饮食 | |||
| 小鼠：C57BL/6J | 广东省实验动物中心 | 03 | |
| <强>特殊饮食 &和饮用水 | |||
| 高脂、胆碱缺乏饮食（基础饮食） | TROPHIC 动物饲料高科技有限公司 | TP36310M | 宏量营养素：蛋白质，14 kcal%；碳水化合物，26 kcal%；脂肪，60 kcal% |
| 含糖饮用水 | Macklin | N/A（实验室自制） | 将D-葡萄糖（Macklin，货号# F87500）和D-果糖（Macklin，货号# S818049）的混合物加入已灭菌的饮水中，终浓度为42 g/L，葡萄糖与果糖的质量比为55:45。 |
| <强>小鼠引物 | |||
| β-肌动蛋白 （正向：AGAGGGAAATCGTGCGTGAC） | BGI 测序 | 定制化 | HPLC 纯化 |
| β-肌动蛋白 （反向：CAATAGTGATGACCTGGCCGT） | BGI 测序 | 定制化 | HPLC 纯化 |
| <强>仪器设备 | |||
| 冷冻切片机 | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| 生物分析系统 | 安捷伦 | G2939BA | |
| 高通量测序平台 | Illumina公司 | NovaSeq 6000 系统 | |
| 激光捕获显微切割系统 | 徕卡显微系统 | Leica LMD6500 | |
| 定量PCR系统 | 应用生物系统公司 | QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统 | |
| 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | NP80 | NanoDrop |
| 热循环仪 | 伯乐（BioRad） | T100 | |
| <强>软件 | |||
| Adobe Illustrator CC 2019（版本 23.0.2） | Adobe | https://www.adobe.com/products/illustrator.html | |
| GraphPad Prism（版本 8.3.0） | GraphPad Software | https://www.graphpad.com |
参考文献
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global ....
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重印与许可
