本方案描述了一种利用激光捕获显微切割技术，从经多聚甲醛固定、OCT包埋的小鼠肝组织中分离特定组织学区域RNA的方法，可用于靶向性的下游基因表达分析。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
方法文章
激光捕获显微切割用于RNA分析的多聚甲醛固定小鼠肝组织
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
激光捕获显微切割（LCM）通过复杂组织中特定细胞群体的空间定位，实现对其的精确获取 原位 可视化与分离。为实现对固定组织中经组织学界定区域的转录组学分析，本文提供了一项详细的激光显微切割（LCM）方案，用于从多聚甲醛（PFA）固定、OCT包埋的小鼠肝脏切片中提取RNA。该方案详细描述了通过一系列流程识别并采集微尺度样本（约1,000个细胞），包括组织固定、蔗糖脱水、OCT包埋、冷冻切片、苏木精染色以及靶向组织区域的激光捕获。采用此方法可获得高纯度RNA（A260/A280：1.9-2.1）获得。RNA完整性指数（RIN）为6.7 ± 0.9，反映了与PFA固定相关的预期片段化程度。然而，定量PCR用于 β-actin 获得的Ct值为17-19，采用片段化优化的文库制备方法进行RNA测序，产生了高质量的读长，且 >90% 的碱基达到 Q20 和 Q30 阈值，证实该 RNA 适用于高灵敏度的下游分析。因此，本方案通过从 PFA 固定的肝组织特定组织学区域获取具有明确纯度和完整性的 RNA，实现了空间分辨的靶向基因表达分析。
引言
准确获取空间分辨的基因表达谱对于理解健康和疾病状态下的组织异质性至关重要。单细胞RNA测序（scRNA-seq）具有高细胞分辨率1,2，但会丢失原有的空间位置信息，并可能在组织解离过程中改变转录谱3,4对于缺乏公开明确特异性标志物的细胞类型，仍难以通过基于免疫荧光的分选或免疫磁珠分离方法获得纯细胞群体5,6空间转录组学技术（如 Visium 和 GeoMx）可实现 原位 获取高通量基因表达数据，但其在单细胞或亚细胞水平上的空间分辨率有限7,8相反，基于成像的空间转录组学可实现纳米级分辨率，但其基因检测通量有限9这凸显了在特定形态学区域进行假设驱动分析方面长期存在的空白。
激光捕获显微切割（LCM）技术可在显微镜引导下，根据可观察的表型特征，从组织切片或活细胞培养物中选择并分离特定细胞。该方法能够保持细胞结构和空间信息10。该技术已在肝脏疾病研究中广泛应用于下游分析。例如，LCM 已被用于从肝活检组织中收集胆管上皮细胞，以阐明其在原发性胆汁性胆管炎中的免疫调节作用11。此外，该技术还被用于从实验模型中分离γ-谷氨酰转移酶（GGT）阳性组织，以确认位点特异性的Ggt1基因表达12。然而，这些研究主要集中在新鲜冷冻组织上，而此类样本通常缺乏临床注释或长期随访信息13。相比之下，化学固定的组织更有利于组织病理学诊断14。尽管基于LCM的RNA测序（RNA-Seq）已成功应用于存档的大规模福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肝组织样本15，但目前仍缺乏专门针对多聚甲醛（PFA）固定并包埋于最佳切割温度（OCT）化合物中的肝组织微小样本的可靠LCM基因表达谱分析方案。
为解决这一尚未满足的需求，本研究优化了一种使用PFA固定、OCT包埋的冷冻切片的全面操作方案。该方案克服了福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）流程在敏感性激光显微切割- RNA（LCM-RNA）应用中的局限性（例如处理时间长、使用剧烈化学试剂）16。相比之下，PFA固定并经OCT包埋的样本其固定与包埋过程相对简便且灵活，能够快速制备高质量切片，同时保持RNA完整性与组织形态。此外，本方案采用基于紫外（UV）激光的激光显微切割系统。与红外系统相比，紫外激光显微切割（UV-LCM）具有更高的切割分辨率，可实现无接触式直接样本采集，最大限度减少污染，适用于从复杂组织结构中精确分离微小区域17,18。因此，本方案的操作价值在于能够从PFA固定的肝组织切片中，以保持形态学特征的前提下捕获微尺度区域（约1,000个细胞），所获得的RNA适用于靶向基因表达分析，从而实现组织病理学特征与局部转录组谱之间的直接关联。
本文介绍了一种从PFA固定、OCT包埋的小鼠肝脏切片中进行激光显微切割分离微小组织（约1,000个细胞）的实验方案，随后提取RNA，并通过定量反转录PCR和RNA测序进行下游分析。这些操作可在五天内完成。
为了帮助读者评估本实验方案的适用性，以下总结了其主要适用范围与局限性。本方案专为基于假设、形态学引导的特定组织学区域取样而优化，适用于经PFA固定、OCT包埋的组织样本，主要应用对象为小鼠肝脏。该方案适合需要将空间分辨的转录组数据与固定样本中保存的精确组织病理学特征相关联的研究人员。当研究涉及存档样本或具有临床注释的固定组织，且无法获得新鲜冷冻样本时，该工作流程尤为有价值。然而，本方案不适用于需要高完整性、非片段化RNA的研究（例如RNA完整性数值（RIN）> 8），因为化学固定所导致的RNA固有片段化限制了其在依赖全长转录本的应用中的使用。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
所有动物操作和护理程序均遵循伦理准则，并经南方医科大学动物伦理委员会批准。所述方法采用成年雄性 C57BL/6J 小鼠，并通过高脂、高糖、胆碱缺乏饮食诱导代谢相关性脂肪性肝炎（MASH）模型。在采集肝组织前，动物通过断头法实施安乐死。
1. PFA固定样本的制备
- 将新鲜肝组织样本（单个肝叶，厚度 ≤5 mm）置于 30 mL 冰冷的 4% 多聚甲醛（PFA，现配）中，于 4 °C 固定 °4 ℃孵育24小时。
注意：建议用磷酸盐缓冲液（PBS，1×，通常由137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂人类表型本体₄，以及 1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.4）溶液中于1× 5分钟内进行灌注固定，随后用4% PFA灌注固定5分钟。或者，也可将组织固定于10%福尔马林溶液中。
警告：PFA固定液具有毒性。所有PFA废弃物必须收集至指定的、正确标记的化学废液容器中，并遵守机构及当地法规。 - 洗涤固定后的组织样本3次× 用无RNase的水洗涤5分钟，重复1次× PBS 溶液
- 将固定后的肝组织放入装有50 mL新鲜配制于无菌1×磷酸盐缓冲液中的30%蔗糖的50 mL离心管中× PBS）。将样品置于4 °4°C 下 10–12 小时。
- 将组织样本从蔗糖溶液中取出，修整成易于操作的组织块（约 5 mm） × 3 mm × 5 毫米），然后将样本包埋于冷冻模具（7 毫米）中 × 7 mm × 含有OCT包埋剂的5 mm样品
注意：如有必要，可用镊子调整组织方向。 - 将OCT包埋剂覆盖于组织样本上方，确保完全浸没，随后立即将OCT包埋的组织置于液氮或干冰上，快速冷冻OCT包埋剂以形成固体块。此快速冷冻步骤对于获得高质量的冷冻切片至关重要。
警告：操作低温材料时，需佩戴耐低温手套以保护双手。 - 将OCT包埋的组织块置于-80 ℃保存。 °直至冷冻切片前均保存于 C。
2. 用于激光捕获显微切割的冷冻切片
- 将聚萘二甲酸乙二醇酯（PEN）膜载玻片暴露于紫外光下30分钟，然后用0.1 mg/mL的多聚赖氨酸包被载玻片，随后空气干燥。接着，用中性封固介质密封PEN膜载玻片的边缘。
注意：紫外照射和多聚赖氨酸处理PEN膜载玻片可提高组织样本在PEN膜载玻片上的附着性。用中性封固介质密封边缘可防止水分渗入或膜下产生气泡，这对维持激光捕获显微切割（LCM）效率至关重要。
警告：避免皮肤和眼睛暴露于紫外光。应佩戴防紫外护目镜或面罩（具备紫外防护等级），并穿戴实验服、丁腈手套和长袖衣物以遮盖暴露的皮肤。 - 使用RNase去污染剂擦拭冷冻切片机所有可接触表面及所有工具，并用75%乙醇清洁刷子。
警告：废弃的乙醇擦拭材料和溶液应按照当地机构的环境健康与安全规程进行处置。 - 使仪器降温并稳定至−20 °C。
- 从-80 °C取出肝组织样本，放入冷冻切片机中至少15分钟。
- 在样品台表面涂布一层薄薄的OCT包埋剂（2–3 mm）。将样品台置于速冻架（或冷冻切片机腔室）中，使OCT层预先固化。
- 在样品台上已预固化的OCT层上再加少量OCT。取出已平衡的组织块（步骤2.4），立即水平放置于该OCT上，保持10–15秒以实现部分冻结和粘附。固定后，将带有组织块的样品台安装至冷冻切片机的样品头。
- 从冷冻切片机一侧小心地将刀片插入夹紧板与背板之间，然后压紧夹紧杆。
- 将冷冻切片机的切片厚度设定为10 µm。
注意：可根据组织需要调整切片厚度，但应保持在5–15 µm之间19。 - 在维持于-20 °C的冷冻切片机腔室内，直接将切片切割并贴附于预处理过的PEN膜载玻片上。
注意：每张PEN膜载玻片可容纳6–8个组织切片。建议整个切片过程在1小时内完成。限制切片时间可最小化组织暴露于环境条件下的时间，从而降低RNA降解、组织脱水和形态学伪影的风险，这对于保持RNA质量和组织学完整性以进行LCM及后续分析至关重要。
3. 用于激光捕获显微切割的苏木精染色
- 使用前于室温（RT）下解冻载玻片20分钟。
- 用无RNase的1× PBS洗涤载玻片（每次10秒，共3次）。
- 将组织切片浸入过滤后的Mayer's苏木精溶液（由1.0 g/L苏木精、0.2 g/L碘酸钠、50 g/L十二水合硫酸铝铵、50 g/L水合氯醛和1.0 g/L柠檬酸组成）中染色5-10秒。
注意：染色前需将苏木精工作液经0.22 µm注射器滤膜过滤。 - 用无RNase的水洗涤载玻片（每次10秒，共3次），以去除残留的苏木精溶液。
- 在显微镜下评估染色质量。
注意：理想染色的细胞核应呈现清晰的蓝紫色，背景透明。染色不足会导致细胞核颜色过浅，而染色过度则会掩盖细胞结构细节。只有符合上述最佳染色标准的载玻片方可进入下一步操作。 - 用吸水纸轻轻吸干载玻片，随后完全空气干燥（10-15分钟）。
注意：进行激光显微切割（LCM）前，务必确保载玻片完全干燥。然后将载玻片放入50 mL离心管中，并暂时置于冰上保存，直至进行激光显微切割操作。
4. 激光捕获显微切割
注意：每张切片的激光捕获显微切割（LCM）实验时间应控制在30分钟至1小时之间。建议在4小时内完成整个LCM实验。此时间限制旨在最大限度减少室温下RNA的降解，并防止收集管盖中收集缓冲液的蒸发，这对于有效回收样本至关重要。实际操作中，可在4小时内稳定获取来自形态学定义区域的约1,000个细胞的目标产量。
- 使用RNase去污染剂擦拭实验台表面。
- 打开控制器，等待显微镜完成初始化过程。
- 将钥匙从关闭位置顺时针旋转至开启位置，以启动激光系统。
注意：激光系统需要约10分钟预热时间。 - 打开计算机并启动LCM软件，然后等待初始化过程完成。
- 将无菌0.2 mL PCR管（收集管）插入收集装置中。
- 向PCR管盖内加入10 µL蛋白酶K消化缓冲液（参见材料表）。
注意：蛋白酶K消化缓冲液的总体积将在后续步骤中（见步骤5.4.1）补至150 µL，作为完整裂解程序的一部分。 - 将收集装置装入显微镜的样品架中。
- 在更换收集装置窗口中，首先点击移至参考点按钮。然后调节相机焦距，确保清晰看到参考点。如有必要，使用窗口中的箭头将参考点居中于视野中。
- 将组织切片装入样品架，确保组织切片正面朝下，标签位于右侧。
- 选择10×物镜，识别并勾画出具有特定病理特征的感兴趣区域，例如微泡性脂肪变性（表现为肝细胞胞质内含有多个小而透明的空泡，细胞核位于中央）。然后进入激光菜单，点击校准按钮。在屏幕上确认提示信息，选择是，并继续进行校准。
注意：10×物镜并非微切割的唯一选择；可根据样本清晰度和所需分辨率选择其他放大倍数的物镜（如20×）。 - 在激光控制面板中，将切割参数设置为：激光功率 = 50，孔径（激光束直径）= 5，速度 = 9。
注意：上述参数值是针对本方案所用组织样本的紫外激光捕获显微切割（UV-LCM）系统的参考值。其他UV-LCM系统的使用者可将其作为起始点，并可能需要根据经验调整设置。最佳参数可能因组织类型、切片厚度及其他LCM系统而异。 - 使用图形工具栏在目标区域周围绘制一个圆圈。选择单个形状，点击开始切割按钮执行激光捕获显微切割，然后移动收集装置以收集被切割的组织。
注意：成功分离的标志是所选区域出现分离，通常可见间隙或碎片移动。为保持一致性，每个样本应从预定义数量、大小相似的区域进行收集。如果目标区域未自动脱离，可点击移动并切割按钮，使用鼠标手动切割样本。为更精确估算细胞数量，LCM软件可自动记录总切割面积。该数值除以目标细胞的平均横截面积，即可估算捕获的总细胞数。
警告：在激光捕获显微切割过程中，切勿直视激光束，以防受到激光辐射伤害。 - 可选操作：在文件菜单中选择另存为图像命令，保存切割部位的切割前与切割后图像。在弹出对话框中选择保存位置、文件名，并以首选格式（如.tif）保存。
- 在收集到所需数量的细胞后，点击卸载按钮，将收集装置从载物台上移除。在密封PCR管之前，确认管盖内的蛋白酶K消化缓冲液体积仍为10 µL；若在激光捕获显微切割过程中发生蒸发，需补充缓冲液（参见步骤4.6）。
注意：加入10 µL缓冲液可确保管盖表面充分润湿，有利于在步骤4.16的离心过程中高效转移显微切割所得的组织沉淀。 - 充分涡旋振荡收集管。
- 短暂离心收集管，并将样本管储存于-80 °C，直至进行RNA提取。
注意：对下一个样本重复步骤4.5至4.16。本方案可在RNA提取前暂停。
5. 显微切割样品的总RNA提取
- 使用RNase去污染剂擦拭实验台表面。
- 将激光捕获显微切割（LCM）样品从-80 °C冰箱转移至冰浴中。如有需要，可合并同一种类但不同批次的捕获样品。
- 将显微切割后的样品管倒置，在42 °C孵育30分钟。
注意：此倒置操作可确保在短暂离心（步骤4.16）后仍粘附于管盖的组织释放至消化缓冲液中，从而在步骤5.4.1进行体积调整和高速离心前实现样品向缓冲液的最大转移。 - 使用专为固定组织优化的标准RNA提取试剂盒（参见材料表）从LCM样品中提取总RNA。
- 用蛋白酶K消化缓冲液（参见材料表）将每个样品管的体积调整至终体积150 µL。在11,000 × g条件下离心1分钟，然后将样品转移至无菌1.5 mL离心管中。
- 每管加入10 µL蛋白酶K（20 mg/mL），通过反复吹打轻轻混匀。最终反应体积为160 µL，每份样品消化反应中蛋白酶K终浓度约为1.25 mg/mL。
- 进行两步孵育：先在56 °C孵育15分钟，随后在80 °C孵育15分钟。每次孵育期间，每隔5分钟短暂涡旋振荡各管一次。
注意：为获得最佳操作流程，建议使用两个预热的水浴锅。若仅使用一个水浴锅，则在56 °C孵育结束后暂停：将样品置于室温，待水浴升温至80 °C后再继续操作。 - 将样品置于冰上3分钟，随后在20,000 × g条件下离心15分钟。
- 小心吸取澄清的上清液至新的1.5 mL离心管中，避免触及沉淀。
- 向每份样品中加入16 µL DNase孵育缓冲液和10 µL DNase I酶（2.73 单位/µL，参见材料表），然后通过轻轻颠倒混匀管内液体。最终反应体积为186 µL，每份样品中DNase I终浓度约为0.15 单位/µL。
- 短暂离心以收集管壁残留液体。
- 在室温下孵育样品管15分钟。
- 向每份样品中加入320 µL高盐洗涤缓冲液（参见材料表），充分混匀。每份样品终体积为506 µL。
- 向每管加入720 µL无水乙醇，通过移液器吹打混匀（无需离心），并立即进行后续操作。每份样品终体积为1,226 µL。
注意：无水乙醇高度易燃。废液中的乙醇应收集至指定的非卤化有机溶剂废液容器中，以便妥善处理。 - 将700 µL样品混合液转移至纯化柱（置于2 mL收集管中，参见材料表）。轻轻盖紧盖子，在8,000 × g条件下离心15秒。
- 弃去收集管中的穿流液，保留纯化柱。
- 重复步骤5.4.11至5.4.12。
- 向每份样品管中加入500 µL乙醇基洗涤缓冲液（参见材料表）。轻轻盖紧盖子，在8,000 × g条件下离心15秒，然后弃去收集管中的穿流液。
- 完整重复步骤5.4.14，唯一修改为将离心时间延长至8,000 × g条件下2分钟。
- 将每个纯化柱转移至新的2.0 mL离心管中，开盖在14,000 × g条件下离心5分钟，随后弃去离心管及残留液体。
- 将每个纯化柱转移至新的1.5 mL离心管中，用移液器将16 µL无RNase水加至膜上，盖紧盖子，在14,000 × g条件下离心5分钟，以促进总RNA的洗脱。
注意：在步骤5.5和5.6期间，请将所有洗脱的RNA样品置于冰上，以防降解。
- 通过分光光度法测定RNA样品浓度并检测纯度（A260/A280比值）。
注意：本步骤中的浓度与纯度（A260/A280比值）测定，结合步骤5.6中的完整性评估，构成RNA成功回收的最终定量检查点。预期获得澄清的RNA洗脱液。 - 使用1%琼脂糖凝胶进行电泳，并利用Bioanalyzer系统测定RNA完整性数（RIN），以评估RNA质量。
- 将RNA样品储存于-80 °C，直至进行qRT-PCR或RNA-Seq分析。
6. RNA分析
注意：qRT-PCR 在步骤 6.1 和 6.2 中描述，RNA-Seq 在步骤 6.3 中描述。
- 在冰上配制反转录反应体系，每反应加入50 ng总RNA。根据提供的说明书，使用热循环仪进行反转录反应（参见材料表）。
- 在冰上根据生产商说明书配制用于β-actin的定量PCR预混液（引物序列见材料表）。使用定量PCR系统进行实时PCR扩增，按照生产商推荐的循环程序，每反应加入10 ng cDNA。
- 使用低起始量链特异性建库试剂盒（见材料表），从50 ng总RNA构建RNA-Seq文库。使用生物分析仪系统（见材料表）测定文库大小和浓度，随后在高通量测序平台（见材料表）上进行双端测序。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
实验流程包括PFA固定、30%蔗糖脱水、OCT包埋和冷冻切片、苏木精染色、通过激光显微切割技术（LCM）识别并精确采集目标区域（约1,000个细胞）、细胞裂解、RNA提取、RNA质量控制指标，以及两个关键的分析应用，如图1所示。在激光捕获微尺度肝组织前后，PEN载玻片上经苏木精染色的肝组织切片在显微镜下的图像分别如图2A和图2B所示。表现出微泡性脂肪变性的感兴趣区域被精确采集至PCR管盖中，同时保持了完整的细胞形态（图2C）。
每份重复实验分别从约 1,000 和 2,000 个激光显微切割捕获的细胞中提取总 RNA，产量分别为 110.7 ± 11.8 ng 和 213.3 ± 26.2 ng（图 3A）。所有样本均显示高纯度，A260/A280
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
LCM 的优势在于其精确性， 原位 特定细胞或组织区域的捕获，有助于对异质性组织内特定区域的研究。但该技术存在样本得率低、耗时长、成本高以及需要专用设备等局限性，限制了其在实验室中的广泛应用23本研究建立了LCM-RNA实验方案，以克服以往的关键技术局限。该方案采用快速苏木精染色步骤（约10秒），并通过使用PFA/OCT包埋替代FFPE，避免了多种固定组织方案中耗时的二甲苯脱蜡步骤。单管收集策略避免了中间转移过程，减少了样本损失和移液操作。使用封片介质密封膜的边缘可防止常见的水化问题，提高首次操作成功率并提升实验效率22通过使用适配PFA的RNA提取试剂盒，确保了交联RNA的高效回收。结合超灵敏文库构建试剂盒，该方法能够成功从皮克量级的RNA产出中提取RNA。此外，组织切片厚度设定为5-15 µm。上述参数选择得到了先前方法学研究的支持。10,19切片厚度小于5 µm可能无法提供完整的细胞轮廓，从而影响可靠捕...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作部分得到了中国国家自然科学基金（82070589）、广东省自然科学基金（2022A1515010218）和广州市科技计划项目（206077078001）对王 Yan 教授的资助。我们感谢南方医科大学 biomedical research center 提供技术支持以及使用激光捕获显微切割系统的机会。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>材料 | |||
| 0.2 ml 薄壁管 | Axygen | PCR-02-C | 用于LCM收集的管子 |
| 1.5 mL 离心管 | Axygen | 339653 | |
| 4% 多聚甲醛 | Leagene | DF0135 | |
| 50 mL 离心管 | 赛默飞世尔科技 | 339653 | |
| DEPC（焦碳酸二乙酯） | Sigma | D-5758 | |
| DNase I 消化试剂盒 | Qiagen | 73504 | RNeasy FFPE 试剂盒组分，包含 DNase I 储存液和 DNase 增强缓冲液 |
| 乙醇（100%） | 赛默飞世尔科技 | BP2818 | 分子生物学纯化 |
| 基于乙醇的洗涤缓冲液 | Qiagen | 73504 | Buffer RPE（RNeasy FFPE试剂盒组分） |
| 高盐洗涤缓冲液 | Qiagen | 73504 | 缓冲红细胞（RNeasy FFPE 试剂盒组分） |
| 低剖面切片机刀片 | Leica Biosystems | 819 | |
| Mayer’苏木精染色 | Leagene | DH0001 | |
| OCT包埋剂 | 樱花 | 4583 | |
| 聚乙烯膜包被载玻片 | Leica | 11505188 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Leagene | CC0010 | 无DNase/RNase |
| 聚-L-赖氨酸 | Macklin | P875131S | |
| 蛋白酶K消化缓冲液 | Qiagen | 73504 | Buffer PKD（RNeasy FFPE 试剂盒组分） |
| 纯化柱 | Qiagen | 73504 | RNeasy MinElute 离心柱（RNeasy FFPE 试剂盒组分） |
| 定量PCR预混液 | Takara Bio | RR820A | TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) |
| 逆转录试剂盒 | Qiagen | 205411 | QuantiNova 反转录试剂盒 |
| RNA提取试剂盒 | Qiagen | 73504 | RNeasy FFPE 试剂盒 |
| 低输入量链特异性RNA测序试剂盒 | Takara Bio | 634412 | SMARTer链特异性总RNA测序试剂盒 - 超低起始量哺乳动物v2 |
| RNase 去污染剂 | Solarbio | SR0040 | 清洗 |
| 蔗糖 | Macklin | S818049 | |
| <强>动物与饮食 | |||
| 小鼠：C57BL/6J | 广东省实验动物中心 | 03 | |
| <强>特殊饮食 &和饮用水 | |||
| 高脂、胆碱缺乏饮食（基础饮食） | TROPHIC 动物饲料高科技有限公司 | TP36310M | 宏量营养素：蛋白质，14 kcal%；碳水化合物，26 kcal%；脂肪，60 kcal% |
| 含糖饮用水 | Macklin | N/A（实验室自制） | 将D-葡萄糖（Macklin，货号# F87500）和D-果糖（Macklin，货号# S818049）的混合物加入已灭菌的饮水中，终浓度为42 g/L，葡萄糖与果糖的质量比为55:45。 |
| <强>小鼠引物 | |||
| β-肌动蛋白 （正向：AGAGGGAAATCGTGCGTGAC） | BGI 测序 | 定制化 | HPLC 纯化 |
| β-肌动蛋白 （反向：CAATAGTGATGACCTGGCCGT） | BGI 测序 | 定制化 | HPLC 纯化 |
| <强>仪器设备 | |||
| 冷冻切片机 | Leica Biosystems | CM3050 S | |
| 生物分析系统 | 安捷伦 | G2939BA | |
| 高通量测序平台 | Illumina公司 | NovaSeq 6000 系统 | |
| 激光捕获显微切割系统 | 徕卡显微系统 | Leica LMD6500 | |
| 定量PCR系统 | 应用生物系统公司 | QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统 | |
| 分光光度计 | 赛默飞世尔科技 | NP80 | NanoDrop |
| 热循环仪 | 伯乐（BioRad） | T100 | |
| <强>软件 | |||
| Adobe Illustrator CC 2019（版本 23.0.2） | Adobe | https://www.adobe.com/products/illustrator.html | |
| GraphPad Prism（版本 8.3.0） | GraphPad Software | https://www.graphpad.com |
参考文献
- Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
- Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 543 (7647), 352-356 (2017).
- Aizarani, N., et al. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Baron, C. S., et al. Cell Type Purification by Single-Cell Transcriptome-Trained Sorting. Cell. 179 (2), 527-542.e19 (2019).
- Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
- Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
- Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
- Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).
- Baba, N., et al. Gene expression profiling in biliary epithelial cells of primary biliary cirrhosis using laser capture microdissection and cDNA microarray. Transl Res. 148 (3), 103-113 (2006).
- Mena, J. E. T., et al. Laser capture microdissection after γ-glutamyl transferase histochemistry: An optimization for gene expression analysis. Anal Biochem. 447, 126-132 (2014).
- Liu, Y., et al. Next-generation RNA Sequencing of Archival Formalin-fixed Paraffin-embedded Urothelial Bladder Cancer. Eur Urol. 66 (6), 982-986 (2014).
- Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Arch. 460 (2), 131-140 (2012).
- Mägel, L., Bartels, S., Lehmann, U. Next-Generation Sequencing Analysis of Laser-Microdissected Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue Specimens. Methods Mol Biol. 1723, 111-118 (2018).
- Von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA Quality from FFPE Samples. PLoS One. 2 (12), e1261(2007).
- Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. Am J Pathol. 151 (1), 63-67 (1997).
- Schütze, K., et al. Cut out or poke in--the key to the world of single genes: laser micromanipulation as a valuable tool on the look-out for the origin of disease. Genet Anal. 14 (1), 1-8 (1997).
- Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histol Histopathol. 30 (11), 1255-1269 (2015).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565(2010).
- Ge, S. J., Gan, W. Q., Karlinsey, K., Zhou, B. Y., Pachter, J. S. Immuno-laser capture microdissection of perfusion-fixed mouse brain tissue coupled to RNA-seq. J Neurosci Methods. 423, 110548(2025).
- Takahashi, K., Beltran, W. A., Sudharsan, R. An optimized workflow for transcriptomic analysis from archival paraformaldehyde-fixed retinal tissues collected by laser capture microdissection. Exp Eye Res. 246, 109989(2024).
- Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods Mol Biol. 1723, 1-17 (2018).
- Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Converg. 4 (1), (2017).
- Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nat Protoc. 4 (6), 902-922 (2009).
- Pan, D. Y., et al. Laser Capture Microdissection-Based RNA Microsequencing Reveals Optic Nerve Crush-Related Early mRNA Alterations in Retinal Ganglion Cell Layer. Transl Vis Sci Technol. 9 (11), 30(2020).
- Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482(2019).
- Phan, H. V., et al. High-throughput RNA sequencing of paraformaldehyde-fixed single cells. Nat Commun. 12 (1), 5636(2021).
- Thomsen, E. R., et al. Fixed single-cell transcriptomic characterization of human radial glial diversity. Nat Methods. 13 (1), 87-93 (2016).
- Lin, X. J., et al. A comparative analysis of RNA sequencing methods with ribosome RNA depletion for degraded and low-input total RNA from formalin-fixed and paraffin-embedded samples. Bmc Genomics. 20 (1), 831(2019).
- Luzzi, V., Mahadevappa, M., Raja, R., Warrington, J. A., Watson, M. A. Accurate and reproducible gene expression profiles from laser capture microdissection, transcript amplification, and high density oligonucleotide microarray analysis. J Mol Diagn. 5 (1), 9-14 (2003).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
