激光捕捉显微解剖对甲醛固定小鼠肝组织用于RNA分析

摘要

本协议描述了一种利用激光捕捉显微解剖，从对甲醛固定、最佳切割温度化合物嵌入小鼠肝脏组织的特定组织学区域中分离RNA的方法，实现针对性的下游基因表达分析。

摘要

激光捕捉显微解剖（LCM）通过原 位 可视化和分离，提供对复杂组织中特定细胞群体的空间访问。为实现对固定组织中组织学定义区域的转录组分析，提出了一种详细的LCM协议，用于从固定对甲醛（PFA）固定、最优切割温度（OCT）化合物嵌入的小鼠肝切片中提取RNA。该方案详细说明了通过组织固定、蔗糖脱水、OCT嵌入、冷冻切割、赤木精染色以及激光捕捉目标组织学区域的工作流程，识别和采集微尺度样本（约1000个细胞）。通过该方法，获得了高纯度RNA（A₂₆₀/A₂₈₀：1.9-2.1）。RNA完整性数（RIN）为6.7±0.9，反映了PFA固定时预期的碎片化。然而， β肌动蛋白 的定量PCR检测Ct值为17-19，且使用片段优化文库制备进行的RNA测序产生了高质量的读段，>90%的碱基达到Q20和Q30阈值，确认该RNA适合敏感的下游分析。因此，该方案通过提供来自PFA固定肝组织特定组织学区域的明确纯度和完整性RNA，实现空间分辨的靶向基因表达分析。

引言

准确获取空间分辨的基因表达谱对于理解健康和疾病中的组织异质性至关重要。单细胞RNA测序（scRNA-seq）具有高^{细胞分辨率1,2}，但会失去原生空间环境，并在组织解离过程中可能改变转录谱^3,4。对于缺乏公开特定标记的细胞类型，利用基于免疫荧光的分选或免疫磁分离获得纯细胞群仍然困难 ^5,6。空间转录组学技术如Visium和GeoMx允许原位捕获高通量基因表达数据，但其空间分辨率在单^细胞或亚细胞层面有限，^7,8。相反，基于成像的空间转录组学可达到纳米级分辨率，但基因检测通量有限，⁹。这凸显了针对特定形态区域假设驱动分析的持续空白。

激光捕捉显微切割（LCM）允许显微镜引导下，根据可观察的表型选择并分离组织切片或活细胞培养中的特定细胞。这种方法保留了细胞结构和空间信息¹⁰.该技术已被广泛应用于肝病研究的下游分析。例如，LCM已被用于从肝脏活检中采集胆道上皮细胞，以阐明它们在原发性胆管炎¹¹中的免疫调节作用。此外，它还被用于从实验模型中分离出γ-谷氨酰转移酶（GGT）阳性组织，以确认位点特异性的 Ggt1 基因表达¹²。但这些研究主要集中在新鲜冷冻组织上，这些组织通常缺乏临床注释或长期随^访。相比之下，化学固定组织在组织病理学诊断方面具有优势¹⁴。尽管基于LCM的RNA测序（RNA-Seq）已成功应用于存档的大规模福马林固定和石蜡嵌入（FFPE）肝样本，¹⁵.然而，目前尚缺乏针对对甲醛（PFA）固定及最佳切割温度（OCT）化合物嵌入肝组织微尺度样本的稳健的基于LCM的基因表达分析方案。

为满足这一未被满足的需求，采用了PFA固定、嵌入OCT的冷冻切割技术，优化了全面的方案。该协议解决了FFPE工作流程在敏感LCM-RNA应用中的局限性（如长时间处理和强烈化学品）¹⁶。相比之下，PFA固定且嵌入OCT的样品的固定和嵌入过程相对简单且灵活，能够快速制备高质量切片，同时保持RNA完整性和组织形态。此外，该协议采用紫外线（UV）激光激光LCM系统。与红外系统相比，UV-LCM提供了更细的切割分辨率，并支持直接、非接触式样本采集，最大限度地减少污染，并适合精确隔离复杂组织结构中的微尺度区域（^17,18）。因此，该协议的操作价值在于其能够从PFA固定肝切片中进行形态保持微观区域（~1000个细胞）的捕捉。它生成适合靶向基因表达分析的RNA，从而实现组织病理特征与局部转录组结构之间的直接关联。

本文介绍了一种激光捕捉显微解剖方法，用于从PFA固定、嵌入OCT的小鼠肝脏切片中提取微尺度组织（~1000个细胞），随后提取RNA，并通过定量逆转录PCR和RNA测序进行下游分析。这些程序可在五天内完成。

为了帮助读者评估该协议的适用性，以下总结了主要范围和局限性。该方案专门针对假设驱动、形态学引导的特定组织学区域采样，主要应用于小鼠肝脏。它适合需要将空间分辨的转录组数据与固定标本中保存的精确组织病理特征关联起来的研究人员。该工作流程在处理存档或临床注释固定组织时尤其有价值，且这些组织无法获得新鲜冷冻样本。然而，该方案并不适合需要高完整性、非片段化RNA（如RNA完整性数（RIN）>8）的研究，因为化学固定带来的固有断片限制了其在依赖全长转录本的应用中的作用。

方案

所有动物处理和护理程序均按照伦理指南执行，并经南方医科大学动物伦理委员会批准。该方法使用成年雄性 C57BL/6J 小鼠，并在高脂肪、高糖、缺乏胆碱的饮食下维持，以模拟代谢相关脂肪性肝炎（MASH）。在采集肝组织之前，动物们通过斩首安乐死。

1. PFA固定试样的制备

1. 将新鲜肝组织样本（单个肝叶，厚度不超过5毫米）置于30毫升冷的4%PFA（新鲜制备）中，4°C浸泡24小时。
   注意：建议以×磷酸盐缓冲盐水（PBS，1×，通常成分为137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄和1.8 mM KH₂PO₄，pH 7.4）溶液灌注肝脏5分钟，随后用4% PFA灌注固定5分钟。或者，组织也可以用10%福马林溶液固定。
   注意：PFA固定液有毒。所有PFA废弃物必须收集在指定且标识良好的化学废物容器中，以符合机构和地方法规。
2. 用无RNase的1× PBS溶液清洗固定组织样本3×次，每次5分钟。
3. 将固定的肝组织放入一个50毫升的管子，内装50毫升30%蔗糖（新鲜制备于无菌1×PBS）。将样品保持在4°C下10-12小时。
4. 将组织样本从蔗糖溶液中取出。对样品进行修剪，获得易于操作的块状物（约5毫米×3毫米×5毫米），然后将样品嵌入含OCT化合物的低温软胚（7毫米×7毫米×5毫米）中。
   注意：如有需要，请用镊子调整组织的方向。
5. 在上面加入OCT化合物，完全覆盖组织样本，然后立即将嵌入OCT的组织块置于液氮或干冰上，迅速冷冻OCT化合物并形成固体块。这种快速冷冻对于获得高质量的冷冻切割至关重要。
   注意：在处理低温材料时，请佩戴耐低温手套以保护双手。
6. 将嵌入OCT的块体置于-80°C，直到冷冻切割。

2. 用于激光捕捉显微解剖的冷冻切片

1. 将聚萘二甲酸乙二酯（PEN）膜载玻片暴露在紫外线下30分钟，然后涂上0.1 mg/mL聚L-赖氨酸，最后进行自然风干。然后，用中性安装介质封住PEN膜滑套的边缘。
   注意：对PEN膜载玻片进行紫外照射和聚L-赖氨酸处理，可以改善组织样本对PEN膜载玻片的附着力。用中性安装介质封闭周边可以防止水渗透或膜下气泡形成，这对保持LCM效率至关重要。
   注意：保护皮肤和眼睛免受紫外线伤害。佩戴防紫外线护目镜或具备紫外线防护等级的面罩，以及实验服、丁腈手套和长袖以遮盖暴露皮肤。
2. 用RNase消毒剂擦拭低温箱和所有工具的所有可接触表面，并用75%乙醇清洁刷子。
   注意：按照当地机构的环境健康与安全规定，处理用过的乙醇湿巾及溶液。
3. 让仪器达到并稳定在−20°C。
4. 从-80°C取出肝样，放入低温容器，至少15分钟。
5. 在样品台表面涂上一层薄薄的OCT化合物（2-3毫米）。将样品台放置在快速冷冻架（或低温箱内）进行OCT层预固化。
6. 在样品阶段的预固化OCT层上涂少量OCT。取出平衡组织块（步骤2.4），立即水平放置于该OCT上，保持10-15秒以实现部分冻结和粘连。固定好后，将样品台（连同组织块）安装到低温静存器头上。
7. 小心地将刀片从低温容器一侧插入夹紧板和背板之间，然后夹紧夹紧杆。
8. 将低温器厚度设置调至10微米。
   注意：根据组织需要调整切片厚度，但厚度保持在5-15^微米之间。
9. 切割并直接将切片安装在冷温室内的预处理PEN膜载玻片上，温度保持在-20°C。
   注意：每张PEN膜载玻片可容纳6至8个组织切片。建议整个剖面过程在1小时内完成。限制切片时间可减少组织暴露于环境条件，从而降低RNA降解、组织脱水和形态伪影的风险，这些对于保持RNA质量和组织学完整性，适用于LCM及下游分析。

3. 用于激光捕捉显微解剖的血液染色

1. 使用前在室温（RT）下解冻20分钟。
2. 用无RNase 1× PBS洗涤载玻片（3次，每次10秒）。
3. 将组织载玻片浸入过滤后的迈耶血液素溶液中（含1.0克/升的苏木素、0.2克/升碘酸钠、50克/升十二水合铝硫酸铵酸盐、50克/升氯醛水合物和1.0克/升柠檬酸组成）浸泡5-10秒。
   注意：染色前，将血液酶工作液通过0.22微米注射器过滤膜。
4. 用无RNase水清洗载玻片（3次，每次10秒），以去除残留的血液素溶液。
5. 在显微镜下评估染色质量。
   注意：最佳染色的核应在清晰背景上呈现清晰的蓝紫色。染色不足会导致细胞核较淡，过度染色则会遮蔽细胞细节。只有符合这些最佳染色标准的切片应进入下一步。
6. 用吸水纸吸干载玻片，然后完全自然风干（10-15分钟）。
   注意：确保滑套完全干燥后再使用LCM。然后将载玻片放入50毫升离心管中，暂时冰上保存，直到进行液化液处理。

4. 激光捕捉显微解剖

注意：每张玻片的LCM实验时长应保持在30分钟至1小时之间。建议整个LCM实验在4小时内完成。该限值旨在最小化RT下的RNA降解，并防止管帽内收集缓冲液蒸发，这对高效取样至关重要。实际上，约1000个形态区的细胞目标产出可在4小时内可靠采集。

1. 用RNase去污剂擦拭实验台表面。
2. 打开控制器，让显微镜完成初始化过程。
3. 将按键顺时针从 关闭 位置旋转到 开 启位置以启动激光系统。
   注意：激光系统大约需要10分钟来预热。
4. 开机打开LCM软件，等待初始化过程完成。
5. 将无菌的0.2 mL PCR管（采集管）插入采集装置。
6. 在PCR管盖上加入10微升蛋白酶K消化缓冲液（见 材料表）。
   注意：蛋白质酶K消化缓冲液的总体积将在后续步骤（见步骤5.4.1）中提升至150微升，作为完整裂解过程的一部分。
7. 将采集装置装入显微镜的标本架。
8. 在 “变更收集器设备 ”窗口中，首先选择 “移动到参考点 ”按钮。接下来，调整相机焦点，确保参考点清晰可见。如有必要，使用窗口中的箭头将视场中的参考点置中。
9. 将组织切片装入标本架，确保组织切片面朝下，标签在右侧。
10. 选择10×物镜，识别并勾勒出表现出特定病理特征的兴趣区域，如微囊泡性脂肪变（其特征为具有众多小而透明的细胞质液泡和中心细胞核）。然后进入 激光 菜单，点击 校准 按钮。通过选择 “是” 确认屏幕上的提示，然后继续校准。
    注意：10×物镜并非仅用于显微解剖;其他放大镜头（例如20×）可以根据样品清晰度和所需分辨率选择。
11. 在激光控制面板中，将切割参数设置为：激光功率=50，光束口径=5，速度=9。
    注意：上述参数值作为该方案中组织样本UV-LCM系统的参考。其他UV-LCM系统的用户应将这些作为起点，可能需要实测调整设置。最佳设置可能因组织类型、切片厚度及其他LCM系统而异。
12. 用图形工具栏在目标区域周围画一个圆。选择 单一形状，点击 开始切割 按钮进行LCM，然后定位采集设备采集解剖组织。
    注意：成功脱落通过选定区域的分离来表示，通常伴有可见的缝隙或碎片移动。为了保持一致，每个样本从预定数量大小相似的区域中采集。如果目标区域不会自动分离，请点击 移动和切割 按钮，用鼠标手动切割标本。为了更精确估算单元数，LCM软件可以自动记录总切割面积。该数值可以除以目标单元的平均截面积，以近似捕获的单元总数。
    注意：在LCM过程中，不要直视激光束，以避免激光辐射暴露。
13. 可选地，通过在文件菜单中选择“另存为图片”命令，拍摄解剖部位的对比和术后图片。在对话框中，选择位置、文件名，并保存为首选格式（例如.tif）。
14. 收集到所需数量的细胞后，点击 卸载 按钮将收集器从关卡中移除。在封闭PCR管之前，确认盖内蛋白酶K消化缓冲液体积保持在10微升;如果在液质调节过程中发生蒸发，则补充缓冲液（见步骤4.6）。
    注意：添加10微升缓冲液可确保盖面完全湿润，便于步骤4.16离心过程中高效转移微解剖组织颗粒。
15. 彻底旋转收集管。
16. 短暂旋转采集管，并将样品管保存在-80°C，直到提取RNA。
    注意：下一个采样步骤重复步骤4.5到4.16。该方案可以暂停，直到RNA提取完成。

5. 微切割样品的总RNA提取

1. 用RNase去污剂擦拭实验台表面。
2. 将LCM样品从-80°C冷冻室转移到冰浴中。如有需要，可将不同批次的相同样本合并。
3. 将微切割的样品管倒置在42°C下孵育30分钟。
   注意：此倒置确保短暂离心（步骤4.16）后剩余粘附于盖子的组织被释放到消化缓冲液中。这确保了在第5.4.1步进行体积调整和高速离心前，样品能最大限度地转移到缓冲液中。
4. 使用针对固定组织优化的标准RNA提取套件（见 材料表），从LCM样本中分离总RNA。
   1. 使用蛋白酶K消化缓冲液将每个样品管的体积调整至最终150微升（见 材料表）。在11,000 × g （1分钟）下旋转试管，然后将样品转移到无菌的1.5 mL管中。
   2. 每管加入10微升蛋白酶K（20 mg/mL），然后通过反复移液轻柔混合样品。最终体积为160微升，每个样品消化反应中的最终蛋白酶K浓度约为1.25 mg/mL。
   3. 进行两步样本培养：首先在56°C下孵育15分钟，然后在80°C下孵育15分钟。 每次孵化期间，每5分钟短暂地使管子旋转一次。
      注意：为了获得最佳工作流程，使用两个预热水浴。如果使用单浴，56°C孵育后暂停：将样品保持在RT状态，浴加热至80°C，然后继续。
   4. 将样品放入冰块3分钟，然后以20,000× 克 离心（15分钟）。
   5. 将澄清后的上清液抽吸到新的1.5毫升管上，注意避免进入颗粒。
   6. 每个样品中加入16微升DNase培养缓冲液和10微升DNase I酶（2.73单位/μL，详见 材料表）。然后，轻轻倒置管子，彻底混合内容物。最终体积为186微升，消化反应中每个样品的DNase I浓度约为0.15单位/μL。
   7. 快速旋转以收集管壁上的残留液体。
   8. 在RT上孵育样品管15分钟。
   9. 将320微升高盐洗涤液（见 材料表）转移到每个样品，并彻底混合样品。最终每个样品体积为506微升。
   10. 将720微升绝对乙醇转移到每根管子，通过移液（无离心）混合样品，立即开始。最终每个样品体积为1,226微升。
       注意：绝对乙醇极易燃烧。将废弃乙醇收集到指定的非卤素有机溶剂废弃物容器中，以便妥善处置。
   11. 将700微升样品混合物转移到纯化柱（置于2毫升收集管中，详见 材料表）。轻轻盖上盖子，离心机压力为8,000× 克 （15秒）。
   12. 丢弃收集管的流动。保留净化柱。
   13. 重复步骤5.4.11到5.4.12。
   14. 向每个样品管加入500微升乙醇基洗涤缓冲液（见 材料表）。轻轻盖上盖子，离心机加热到8,000× 克 （15秒）。然后，丢弃收集管的流动管。
   15. 完整重复步骤5.4.14，唯一修改是在8000× g下将离心时间增加至2分钟。
   16. 将每个纯化柱转移到新的2.0 mL管中。在14,000克×离心机时打开盖子 ，然后丢弃管子和残留液体。
   17. 将每个纯化柱转移到新的1.5毫升管上。将16微升无RNase水移液器移入膜上，盖盖，并在14,000 × g （5分钟）离心，以促进总RNA的洗脱。
       注意：步骤5.5和5.6期间，所有洗脱后的RNA样本应冰藏保存，以防止降解。
5. 定量RNA样本，并通过分光光度法检测纯度（A₂₆₀/A₂₈₀ 比）。
   注意：本步中浓度和纯度的测量（A为₂₆₀/_A为280 的比值），以及第5.6步的完整性评估，是RNA恢复成功的关键定量检查点。预期会有透明的RNA洗脱液。
6. 使用1%凝胶浓度进行琼脂糖凝胶电泳，并利用生物分析仪系统确定RNA完整性数（RIN），以评估RNA质量。
7. 将RNA样本保存在-80°C，直到进行qRT-PCR或RNA-Seq检测。

6. RNA分析

注意：qRT-PCR在第6.1和6.2步描述，RNA-Seq在第6.3步描述。

1. 制备逆转录反应混合物，并在冰上每次反应加入50 ng的总RNA。按照提供的说明，使用热循环仪进行逆转录反应（见 材料表）。
2. 冰上则根据制造商说明准备定量PCR主混合液用于 β肌动蛋白 （引子序列详见 材料表 ）。使用制造商推荐的循环协议，在定量PCR系统上进行实时PCR扩增，每次反应需10 ng的cDNA。
3. 使用低输入的绞线试剂盒（见 材料表），从50 ng的总RNA构建RNA-Seq文库。使用生物分析仪系统确定文库的大小和浓度（见 材料表），然后在高通量平台上进行成对端测序（见 材料表）。

结果

实验工作流程包括PFA固定、30%蔗糖脱水、OCT嵌入与冷冻切割、血液素染色、通过LCM识别和精确采集目标区域（~1000个细胞）、细胞裂解、RNA分离、RNA质量控制指标以及两项关键分析应用，详见 图1。PEN载玻片上被血肉素染色的肝脏切片在显微镜下展示，在（图2A）和（图2B）激光捕捉微尺度肝组织之前。表现出微囊泡脂肪变的关注区域被精确收集到PCR管的盖子中，保持了完整的细胞形态（图2C）。

每次复制共提取约1,000和2,000个LCM捕获细胞的RNA，分别获得110.7±11.8 ng和213.3 ±26.2 ng（见图3A）。所有样品纯度较高，A₂₆₀/_{A 280}比值...

讨论

LCM的优势在于其精准的原位捕捉选定的细胞或组织区域，便于研究异质组织中特定区域。但其样品产率低、工艺耗时、成本高以及对专业设备的依赖限制了该技术在实验室²³的广泛应用。本研究建立了LCM-RNA协议，以克服关键的历史局限性。该方案实现了快速的血液染色步骤（约10秒），并通过采用PFA/OCT嵌入代替FFPE，消除了许多固定组织方案中耗时的二甲苯脱烷烃步骤。单管采集策略避免中间转移，减少样品损失和移液步骤。用安装介质密封膜周边可以防止常见的水化问题，提高首次尝试的成功率和切割效率²²。通过使用PFA适应RNA提取试剂盒，确保了交联RNA的高效回收。配合超灵敏的文库制备试剂盒，该方法成功从皮克克级RNA中提取RNA。此外，组织切片厚度被设定在5-15微米范围内。正如先前方法学研究^10,19所示，5微米以下的切片可能无法提供完整的细胞剖面以实现可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>材料<强>
0.2毫升薄壁管	阿克西根	PCR-02-C	LCM采集管
1.5毫升离心管	阿克西根	339653
4% 对甲醛	利阿金	东风0135
50毫升离心管	热飞世科学	339653
DEPC（二乙基焦碳酸酯）	西格玛	D-5758
DNase I 消化集	奇根	73504	RNeasy FFPE套件的组成部分，包括DNase I库存溶液和DNase增强缓冲液
乙醇（100%）	赛莫飞世尔科学	BP2818	分子生物学纯化
乙醇基洗涤缓冲剂	奇根	73504	缓冲 RPE（RNeasy FFPE 套件的组成部分）
高盐洗冲缓冲液	奇根	73504	缓冲红细胞（RNeasy FFPE套件的组成部分）
低矮切片机刀片	徕卡生物系统	819
迈耶S型血液素	利阿金	DH0001
OCT复合体	樱花	4583
PEN膜涂层载玻片	徕卡	11505188
磷酸盐缓冲盐水	利阿金	CC0010	无DNase/RNase
聚L-赖氨酸	麦克林	P875131S
蛋白酶K消化缓冲液	奇根	73504	缓冲液PKD（RNeasy FFPE套件的组成部分）
净化柱	奇根	73504	RNeasy MinElute 旋转柱（RNeasy FFPE套件的组成部分）
定量PCR主混合	宝简介	RR820A	TB Green 预混 Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）
逆转录套件	奇根	205411	QuantiNova 反向转录套件
RNA提取套件	奇根	73504	RNeasy FFPE套件
RNA测序套件（低输入，链条）	宝简介	634412	SMARTer链全RNA测序套件——pico输入哺乳动物v2
RNase去污剂	太阳生物	SR0040	清洁
蔗糖	麦克林	S818049
<强壮的>动物和饮食<强壮的强壮者>
鼠标：C57BL/6J	广东省实验动物中心	03
<强健>特殊饮食与喝水
高脂肪、缺乏胆碱的饮食（基础饮食）	TROPHIC动物饲料高科技有限公司	TP36310M	三大营养素：蛋白质，14千卡%;碳水化合物，26千卡%;脂肪，60千卡）
含糖饮用水	麦克林	不适用（内部准备）	在高压灭菌饮用水中加入了D-葡萄糖（Macklin，编号#F87500）和D-果糖（Macklin，编号#S818049），最终浓度为42克/升，葡萄糖与果糖的比例为55：45（水对水）
<强力>鼠底漆
β-actin（前发：AGAGGGAAATCGTGGGTGAC ）	华大测序	定制版	高效液相色谱纯化
β-actin（反向：CAATAGTGATGACCTGGCCGT）	华大测序	定制版	高效液相色谱纯化
<强壮>装备
低温切片机	徕卡生物系统	CM3050 S
生物分析仪系统	安捷伦	G2939BA
高通量测序平台	光辉;公司	NovaSeq 6000 系统
激光捕捉显微解剖系统	徕卡微系统	徕卡LMD6500
定量PCR系统	应用生物系统	QuantStudio 5 实时PCR系统
分光光度计	热飞世科学	NP80	纳米滴落
热循环器	BioRad	T100
<强>软件
Adobe Illustrator CC 2019（版本 23.0.2）	土坯屋	https://www.adobe.com/products/illustrator.html
GraphPad 棱镜（版本 8.3.0）	GraphPad 软件	https://www.graphpad.com