生菜抗旱性微生物群落的热力学评价

摘要

本研究表明，微生物接种剂（特别是由67个菌株组成的菌群）可通过作为生理缓冲剂来缓解Lactuca sativa的水分胁迫。通过红外热成像技术和作物水分胁迫指数（CWSI），我们量化了微生物介导的诱导系统耐受性（IST）如何在严重缺水条件下维持蒸腾冷却，并防止体内稳态崩溃。

摘要

水资源短缺加剧对全球生菜生产构成重大威胁，导致作物品质和产量下降。尽管生产者常通过过度施肥来缓解水分胁迫，但诸如微生物接种剂等生物替代方案提供了更具可持续性的解决途径。本研究在受控条件下，评估了一种由67种菌株组成的微生物群落以及一株Trichoderma harzianum分离物在提高罗马生菜（Lactuca sativa var. Paspartu）耐旱性方面的有效性。共设置九种处理方式，将微生物接种与三种灌溉水平（蒸散量的50%、75%和100%）相结合。通过红外热成像技术监测作物水分状况，利用冠层温度（Tc）的变化计算作物水分胁迫指数（CWSI）。对CWSI的统计分析（ANOVA）显示，各处理之间在全球范围内无显著差异（F = 0.67，p = 0.778）；然而，在热胁迫峰值期间观察到明显的数值变化趋势。在严重缺水条件下（50%灌溉），接种微生物群落的植株CWSI值较低（平均为0.38），而未接种对照组则达到最大胁迫阈值（CWSI = 1.0）。此外，接种微生物的处理在急性胁迫期后表现出更快的热恢复能力。这些结果表明，尽管总体变异较大，微生物群落可作为生理缓冲剂，提高蒸腾效率。红外热成像技术被证实为一种精确且非破坏性的早期水分胁迫检测工具。本研究突出了有益微生物在提升作物抗逆性方面的潜力，并为园艺学研究中的热成像评估提供了标准化操作流程。

引言

生菜（Lactuca sativa L.）是一种经济价值较高的园艺作物，具有浅根系和高含水量的特点，因此对水分亏缺极为敏感¹。在水分胁迫条件下，植物会启动即时的生理响应，主要是气孔关闭，以减少蒸腾作用导致的水分流失²。尽管该机制有助于维持植物体内的水分状态，但由于蒸发冷却作用减弱，会导致冠层温度（Tc）显著升高³。在温室栽培和可控环境生产中，有效调控此类热力与水分波动对于保持产量和品质至关重要⁴。

文献表明，在水分受限条件下，冠层温度（Tc）与作物生产力之间存在显著的负相关关系。这一关系进一步得到多个Tc数量性状位点（QTLs）的证实，这些位点对生物量积累和最终产量具有多效性影响⁴。在水分胁迫监测领域，红外热成像技术比归一化植被指数（NDVI）具有更高的敏感性，能够检测到传统光谱植被指数通常难以察觉的细微水分波动。在此背景下，基于冠层温度（Tc）的算法成为一种无创、快速且精确的组织水分状况诊断方法。其中，作物水分胁迫指数（CWSI）是最稳健且应用最广泛的参数，用于生理特性表征及灌溉制度优化。CWSI的适用性已在多种分类群中得到验证，包括橄榄、葡萄、甜菜、玉米、水稻、小麦和棉花等高价值木本与草本作物⁵。

相比之下，红外热成像技术（IRT）已成为一种可靠且非破坏性的工具，可用于实时监测作物水分状况。通过计算冠层温度（Tc）差异得出的作物水分胁迫指数（CWSI），研究人员能够在植株出现可见萎蔫症状之前量化其胁迫程度⁶。然而，尽管IRT具有高精度，仍需探索能够缓解传感器所检测到的热量积聚的生物学策略⁶。利用植物促生微生物（PGPM）是一种有前景的生物技术途径，可增强作物的抗旱能力⁷。包括木霉属（Trichoderma）真菌和多种有益细菌在内的微生物群落，可通过改变根系结构和调节抗氧化系统来提高作物对水分的吸收能力^8,9。微生物群落在缓解非生物胁迫方面作为生理缓冲剂或生物支持系统的作用已有充分文献记载。与单一接种剂不同，这些复杂的微生物群落可在逆境条件下提供多层面的防御机制，从而稳定植物体内的稳态^10,11。尽管单一微生物的独立效应已被广泛报道，但由多样化群落所提供的协同抗逆性（促进持续的养分流动和温度调节）仍是当前生物技术研究的关键领域^12,13。将多菌株群落与高分辨率热成像分析相结合，在罗马生菜中评估其作用效果的研究仍十分有限。

本研究旨在评估一种复杂的微生物群落（67个菌株）与单一菌株Trichoderma harzianum接种在缓解水分胁迫方面的有效性。通过使用红外热成像技术和作物水分胁迫指数（CWSI）作为主要诊断工具，我们旨在确定在不同水平的水分亏缺（50%、75%和100%）下，微生物接种是否能够维持较低的冠层温度和较高的蒸腾速率。该研究问题聚焦于高度多样化的微生物群落是否能够比单一菌株处理提供更优的热调节和生理缓冲能力。我们假设，微生物群落将显著增强植物对水分胁迫的耐受性，特别是在严重亏缺（50%）条件下，通过维持较低的CWSI值并保护关键生长参数，特别是植株高度和生物量积累。本研究通过考察在受控环境条件下多样化微生物种群对生菜热调节和结构发育的协同作用，填补了相关研究领域的空白。

方案

评估微生物接种剂在提高罗马生菜（Lactuca sativa L. var. Paspartu）水分胁迫耐受性方面功效的实验流程如图1所示。本方案结合了对精确灌溉制度的连续监测以及对生理和热成像数据的定期采集。使用了两种不同的微生物产品：（I）微生物复合菌剂，由67个菌株组成的复杂菌群，包含植物根际促生菌（PGPR）、放线菌和有益真菌，旨在通过定植根部并分泌胞外多糖（EPS）发挥生理缓冲作用；（II）Trichoderma harzianum，一种单一菌株的哈茨木霉（Trichoderma harzianum）接种剂，旨在诱导系统抗性并改变根系结构。所用试剂、仪器和软件列于材料表中。

1. 微生物接种

对两种微生物处理均采用标准化的接种方案，共进行六次土壤浇灌处理，靶向根际区域，使用高精度微量移液器模拟田间剂量。第一阶段在播种后5天和15天（DAS）的幼苗期进行。在30 DAS时，将幼苗移栽至较大的穴盘中，并在移栽后1天（DAT）开始第二阶段接种，随后分别在7、15和20 DAT进行连续施用。

对于微生物群落，施用剂量根据植物物候期进行调整：前两次施用剂量为500 g/ha（3 mL/株），移栽时施用一次高浓度剂量2 kg/ha，最后施用三次维持剂量，每次300 g/ha。同样，T. harzianum 在前两个阶段施用剂量为1 L/ha，移栽时为3 L/ha，最后三个施用阶段均为1 L/ha。这种分阶段施用策略旨在确保根系得到充分定殖，并在关键生长期和胁迫诱导期持续发挥微生物群落作为生理缓冲剂的作用。

2. 作物准备

使用专业级泥炭藓基质，在311孔聚苯乙烯育苗盘（每孔11 mL）中，将认证的罗马生菜种子（Lactuca sativa L. var. Paspartu）播种于1 cm深度进行萌发。萌发过程在受控的生物气候培养箱中进行，温度维持在15 °C至22 °C之间，相对湿度为60%–70%。播种后约3–5天，当种子萌发率达到90%时，将幼苗移栽至根球容量为55 mL的较大育苗盘中，以促进根系自由发育（图2 和 图3）。试验采用完全随机设计（CRD），共设置9个实验单元（育苗盘），每盘20株幼苗。该设计用于实施3 × 3因子排列（3种微生物处理 × 3种灌溉制度）。基质的理化性质详情及生物气候培养箱的具体程序设置¹⁴见于图3、补充表1、补充表2和补充表3。

实验托盘在生物气候室中采用完全随机布局进行分布，以消除边缘效应并确保均匀暴露。生物气候室被设定为模拟动态的、类似田间的环境条件，利用高温模式来复制开放田间的热胁迫。在营养生长期，环境参数维持在相对湿度的可变范围内，并通过高强度LED照明提供9小时光周期（设定为最大容量的50%以上，以确保充足的光合有效辐射）¹⁵。在植株定植阶段完成后，环境程序被调整以反映水分亏缺处理逐渐增强的需求，如逐步的大气条件转变所示¹⁵（图4 和 图5）。温度、湿度和光强的具体昼夜设定值详见 补充表1 和 补充表2，以便简化主实验方案。

施肥策略旨在满足罗马生菜特定的物候需求，在整个营养生长期维持均衡的养分供应。在苗期（播种后12至24天），提供养分 通过 硝酸钾（KNO₃）的靶向应用₃），磷酸二氢钾（KH₂PO₄）₂PO₄)和硝酸钙（Ca(NO₃)₂）。为了促进早期定植，在前24天内添加了一种商用生物刺激剂¹⁶.

从26天龄期（DAS）至76天龄期最终评估期间，肥水管理方案转入维持阶段，不再施用生物刺激剂，以单独评估微生物接种剂的特定效应。所有施用操作均经过校准，以维持根际环境内最佳的电导率（EC）和pH值。完整的矿质浓度及具体施用体积的时间序列安排¹⁶在……中有详细说明 补充表3.

3. 微生物处理

为评估生物干预措施对水分胁迫的缓解效果，设置了三种不同的处理方式：（I）微生物复合菌群，包含67种有益菌株的高多样性微生物复合菌群，涵盖植物根际促生细菌（PGPR）、放线菌和真菌；（II）T. harzianum，一种特化的单菌株制剂，菌种为Trichoderma harzianum；（III）未接种的对照组。这些处理方式的选择依据在于其诱导系统耐受性（IST）的潜力，主要通过根系结构改良、ACC脱氨酶产生以及胞外多糖（EPS）分泌等机制实现。

接种遵循分阶段的战略方法。首次施用（每株植物3 mL）已完成 通过 在第二片真叶期，使用高精度微量移液器将菌剂直接注入根际，以确保根系早期定殖。后续施用剂量按田间尺度等效校准（模拟75,000株/ha的种植密度）。对于 T. harzianum，施用浓度为2 L/ha，微生物菌群以1 kg/ha的剂量施用。将这些制剂溶解于灌溉水中，每15天施用一次，以在整个营养生长期维持稳定的微生物种群，发挥生理缓冲作用¹⁷.

4. 不同的灌溉处理

为评估L. sativa在不同水分条件下的生理与农艺可塑性，根据作物蒸散量（ETc）的替代比例设置了三种灌溉处理。通过将基质的体积含水量校准至其田间持水量（FC），以确保精确诱导胁迫。具体处理如下：（I）对照/充分供水（CC-100% ETc），即完全补充蒸散损失的水量；（II）中度水分亏缺（75% ETc），旨在诱导中等程度的水分限制；（III）重度水分亏缺（50% ETc），以产生严重的水分胁迫。每日在获取热成像图像后，使用刻度移液管进行灌溉，以准确补充蒸散所损失的水量¹⁸。

5. 数据与图像记录

为评估植物的热分布和水分状况，实验期间每周一至周五每天采集一次红外热成像图像。所有摄影记录均在中午12:00至下午2:00之间进行，以在蒸腾作用和太阳辐射强度最大的时段内标准化测量条件。必须在每日灌溉处理前立即拍摄这些图像，以记录植物在过去24小时周期内累积的水分胁迫状况。图像采集时，将红外热成像仪连接至移动设备，并保持与生菜植株背面垂直的方向，距离恒定在60–70 cm。软件设置为多色热图调色板，温度梯度从低到高依次显示：从紫色（最冷）开始，过渡至宝蓝色、青色、绿色（中点）、黄色、橙色，最终为红色（最热）。在软件界面中，手动选择包含植株冠层的特定托盘区域，以获取相应的热数据。该颜色标尺作为生理指标：水分充足的植物因蒸腾作用活跃而表现出较低的冠层温度（紫色/蓝色），而缺水植物由于气孔关闭和蒸发冷却减少，冠层温度较高（橙色/红色）。随后，利用高分辨率图像中感兴趣区域（ROI）的三点测量功能，提取精确的冠层温度（T_c）值，用于计算作物水分胁迫指数（CWSI）。

如果 CWSI 为：

0，则作物未受水分胁迫

1，则作物处于严重水分胁迫状态

其中：

Tc 是通过红外成像测量的冠层温度。Tw 是在无水分胁迫条件下的冠层温度。Td 是在最大水分胁迫条件下的冠层温度¹⁹。

通过红外热成像技术评估的植物生长、发育和生理状况指标，如株高、叶片数量和叶面温度，连同实验中使用的研究变量以及概念性和操作性定义，详见补充表4。这些变量的综合应用使得能够全面评估实验处理对每株植物生理表现和发育的影响。

6. 数据分析

采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）对每种灌溉制度下的生理和形态数据进行分析，以确定不同微生物处理的影响。所有统计分析均使用统计软件完成。在进行推论分析之前，验证了参数统计的基本前提条件，以确保结果的可靠性。通过Anderson-Darling检验（p > 0.100）确认残差符合正态分布。此外，使用Levene检验验证了方差齐性（p = 0.989），表明各组间具有高度的方差齐性（homoscedasticity）。由于两项假设均满足，因此采用Tukey HSD（Honestly Significant Difference）事后检验来识别处理均值之间的显著差异（p < 0.05）。所有统计评估均以单株植物作为实验单位。

结果

三种水分条件下处理的抗逆性

在三个灌溉水平（50%、75% 和 100%）下，评估了生菜（Lactuca sativa L. var. Paspartu）对水分胁迫的生理和形态响应。采用单因素方差分析（ANOVA），以确定微生物处理（处理（T）：TI：微生物复合菌剂，TII：Trichoderma harzianum，TC：对照）、播种后天数（DAS）及其交互作用（T - DAS）对以下性能参数的影响：叶片数（LN）、叶长（LL）、叶宽（LW）、茎直径（SD）和植株高度（PH）。在初始 establishment 阶段，基线测量结果显示，在实施差异灌溉之前，所有组别的幼苗发育状况一致，表明所获得的结果归因于所分析的因素（图6）。在此物候阶段，三种处理的平均植株高度为 35.58 mm，组间无统计学显著差异。同样，真叶数量、叶长、叶宽和茎直径也未显示显著差异（表1）。

讨论

本研究得出的实证证据表明，多菌株微生物群落的策略性应用可作为抵御Lactuca sativa水分亏缺有害影响的高效生物技术缓冲手段。尽管全局推论分析（ANOVA）未显示出统计学上的显著差异（F = 0.67，p = 0.778），但对时间尺度上热动态的高分辨率分析揭示出一个关键的数值缓解趋势。在最严格的灌溉制度（50% ETc）下，接种微生物群落的植株持续保持较低的作物水分胁迫指数（CWSI），避免了非接种对照组中所观察到的达到稳态崩溃阈值（CWSI = 1.0）的情况²⁰。

这种代谢缓冲能力与诱导系统耐受性（Induced Systemic Tolerance, IST）的范式完全一致²¹根据他们的研究结果，根际相关细菌促进了一种生化反应 "引物延伸" 优化了植物内部的信号通路。在本研究中，这种诱导系统抗性可能使接种微生物群落的植株比对照组更高效地调节气孔开度，从而在土壤水势较低的情况下仍能维持蒸腾降温。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
拟南芥培养室	Percival Scientific Inc	AR-95L3	用于提供均匀生长条件（温度、湿度、光照）的可控环境培养室。
Arduino Uno R3	Arduino	A000066	基于 ATmega328P 的微控制器板，用于传感器数据处理。
硝酸钙	Nouryon Chemicals SA de CV	https://adob.com.pl/en/product/adob-calcium-nitrate/	可溶性无机肥料。成分：15.2% 氮和 27.5% 钙。
红外热成像相机	HIKMICRO	https://webassets.hikmicrotech.com /global/asset/d802895de0b44f46 8a49913953e590ff.pdf	高分辨率热成像相机（256 x 192 像素），用于冠层温度测量。
生菜种子	Enza Zaden	Paspartu	结球莴苣（Lactuca sativa L. var. longifolia）认证种子。
微生物复合菌剂（BPG plus）	Alibio Science SAPI DE CV	https://alibio.ag/productos/bgp-plus	由67种菌株（真菌、细菌、放线菌）组成的复合菌群，含量为4×10⁸ CFU/g。
磷酸二氢钾	SQM	https://www.sqmnutrition.com/ec/marca/ultrasol/ultrasol-mkp-4-2	可溶性无机磷酸二氢钾肥料。成分：52% 磷和34% 钾（质量分数）。
泥炭藓基质	Sun Gro Horticulture	https://www.sungro.com/professional-product/sun-gro-perlite-free-mix-x-coarse-resilience/	加拿大泥炭藓，专业级，不含蛭石。
珍珠岩	INVERFARMS MEXICO	https://inverfarms.com/product/ perlita-hortiperl-saco-125-l/?srsltid =AfmBOorwncGHkTcSpgDb9OS bN2-7Mi3ZwQR-uObQte8QQotaD Li-JgLy	高品质惰性基质，用于优化土壤通气性，并提高水分和养分的持留能力。
植物生长调节剂（RADIX 3000）	Intercontinental SA DE CV	https://www.interie.net/productos	促进根系形成。有效成分为0.3%（v/v）的吲哚-3-丁酸。
硝酸钾	SQM	https://sqm.com/producto/ultrasol-k-plus/	可溶性无机肥料。成分：13.7% 氮和46.3% 钾。
R Studio	免费版本	https://www.r-project.org/	R 是一种免费开源的编程语言和软件环境，广泛应用于科学和数据科学领域，用于统计计算、数据分析和可视化，以其强大的建模工具、丰富的包生态系统以及对可重复研究的支持而著称。
土壤湿度传感器	多种（通用型）	FC-28 / HW-080	带有 LM393 比较器的电阻式土壤湿度传感器，可输出模拟/数字信号。
热成像分析软件	HIKMICRO	Analyzer	用于热图像分析和温度提取的专用软件。D6
哈茨木霉（PROTRI）	Aguilares SPR de RL	N/A 内部编号	从瓜纳华托州萨拉曼卡的农业土壤中分离得到的本地菌株，由 Aguilares SPR de RL 进行培养并标准化，供实验使用。
蛭石	INVERFARMS MEXICO	https://inverfarms.com/product/vermiculita-verlite-saco-114-litros/?srsltid=AfmBOoo61hIX-Eg4N-LXUWTY9NLlc5QC5I-iVe85UZRFrNHWQNQ3FwCZ	膨胀蛭石，用于育苗盘覆盖。密度：60–120 kg/m³。