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单细胞RNA测序分析先天性巨结肠患者结肠神经节段与无神经节段的表达谱

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DOI：

10.3791/69825

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2026年5月22日

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1Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

本文内容

摘要

本方案描述了一种单细胞RNA测序工作流程，用于分析先天性巨结肠病中神经节段与无神经节段结肠之间免疫细胞浸润情况及细胞类型特异性的转录差异。

摘要

先天性巨结肠症（Hirschsprung disease, HSCR）是一种先天性肠道运动功能障碍疾病，其特征为远端肠段缺乏肠神经系统神经元。与传统的批量RNA测序相比，单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够在单细胞水平上进行基因表达谱分析，揭示在群体平均分析中被掩盖的细胞异质性。本研究建立了一套标准化的scRNA-seq工作流程，用于解析HSCR患者结肠组织中神经节段与无神经节段的转录图谱。收集结肠组织样本后，进行苏木精-伊红染色以鉴定神经节段和无神经节段区域。组织经酶解和机械解离处理获得单细胞悬液，随后进行过滤、细胞活性评估及单细胞转录组文库构建。通过质量控制的文库进行测序，原始数据经处理后进行细胞定量与质量过滤，以剔除低质量细胞及技术性干扰因素。在完成数据标准化与降维处理后，基于已知的标志基因对细胞进行聚类与注释。下游分析比较了神经节段与无神经节段组织间的细胞类型组成差异，并鉴定了关键免疫细胞亚群中差异表达的基因。结果表明，在HSCR患者中，神经节段与无神经节段之间的免疫微环境存在显著差异。

引言

先天性巨结肠症（Hirschsprung disease, HSCR）是最常见的先天性肠道动力障碍疾病之一，全球发病率约为每5,000例活产婴儿中1例1。该病是由于胚胎发育第5至12周期间，肠源性神经嵴细胞（enteric neural crest cells, ENCCs）未能迁移到远端肠段，导致受累肠段缺乏肠神经节2。无神经节肠段因此持续处于痉挛性收缩状态，蠕动功能受损，引起近端肠管扩张。临床上表现为功能性肠梗阻，导致便秘、腹胀和呕吐等症状，在严重情况下可能危及生命。目前HSCR的主要治疗方法是手术切除无神经节肠段；然而，大量患者术后会出现并发症，包括便秘、小肠结肠炎和大便失禁，显著影响生活质量3。此外，广泛肠段切除后可能发生短肠综合征（short bowel syndrome, SBS），导致营养吸收障碍，增加临床管理难度。因此，阐明HSCR的潜在发病机制并识别新的治疗靶点仍是迫切的临床需求。

近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）已广泛应用于研究疾病相关的分子机制。与传统的群体RNA测序不同，scRNA-seq能够在单细胞分辨率下进行基因表达分析，从而识别在群体分析中被掩盖的细胞异质性及稀有细胞亚群4。因此，scRNA-seq已成为解析细胞异质性和细胞间通讯的有力工具，推动了生物学和医学领域的研究进展5。该技术已在多种复杂疾病中揭示了新的致病机制和治疗靶点，包括阿尔茨海默病6、类风湿性关节炎7、肺癌8和2型糖尿病9。

本研究应用单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术，对先天性巨结肠症（HSCR）患者节段性结肠组织和无神经节结肠组织中的免疫细胞转录组特征及浸润模式进行表征。实验流程主要包括三个步骤：单细胞悬液的制备与质量评估、3′端单细胞RNA测序文库构建以及下游生物信息学分析。组织样本在切除后立即保存于专用的单细胞保存液中，并在48小时内通过酶解法解离为单细胞悬液。细胞活力超过80%，在文库构建前将最终细胞浓度调整至700–1,500个细胞/µL。比较了节段性与无神经节结肠组织间的免疫细胞浸润情况，并鉴定出呈现显著转录差异的免疫细胞亚群。这些分析揭示了与HSCR结肠病理相关的免疫细胞改变。

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方案

本研究经遵义医科大学附属医院机构伦理委员会批准（批准号：KYLL-2024-030）。研究遵循《赫尔辛基宣言》。已获得所有参与者及其监护人的知情同意（口头和书面）。表1列出了先天性巨结肠症（HSCR）患者的信息。

收集中国台湾遵义医科大学附属医院小儿外科诊断并接受手术治疗的先天性巨结肠（HSCR）患者的结肠组织，包括神经节细胞存在段和缺失段。纳入两名男性 HSCR 患者的神经节细胞存在段和缺失段组织。详细的临床信息见表1。所有试剂、化学品、设备和软件均列于材料表中。

1. 苏木精-伊红染色

  1. 组织采集与固定
    1. 将肠道组织样本置于4%多聚甲醛固定液中固定至少24小时。
      注意：多聚甲醛具有毒性，并释放甲醛蒸气。所有操作均应在化学通风橱中进行，并使用适当的个人防护装备。
    2. 使用手术刀将组织修整至约5 × 5 × 2 mm3大小。将组织放入包埋盒中，并用流动自来水冲洗24小时。
      备注：去除组织边缘，制备至少具有一面平整的组织块。若表面不平整，可在冲洗后将组织夹于滤纸之间压平。
  2. 梯度乙醇脱水
    1. 将组织依次浸入乙醇溶液：70%乙醇过夜，80%乙醇3小时，90%乙醇2小时，95%乙醇I 2小时，95%乙醇II 1小时，100%乙醇I 1小时，100%乙醇II 30分钟。
      备注：使用超纯水将乙醇（≥99.7%）稀释至指定浓度。
      注意：乙醇操作应在化学通风橱中进行。
    2. 在各步骤之间取出脱水篮，充分沥干。
  3. 透明处理
    1. 将组织转移至二甲苯中30秒，以实现透明。
  4. 石蜡浸润与包埋
    1. 提前一天在60 °C下熔化石蜡。将新鲜石蜡进行三次冻融循环以去除气泡。第三次循环后，用滤纸过滤熔化的石蜡。
    2. 将组织在纯石蜡（石蜡I）中浸润1小时。
    3. 将组织在石蜡混合物（石蜡II；纯石蜡:蜂蜡 = 8:1）中浸润2小时。
      备注：蜂蜡需完全熔化并在使用前过滤。
    4. 将石蜡II倒入包埋模具中。将组织块垂直且平整放置，插入标签，静置使其凝固。
  5. 切片
    1. 修整石蜡块，获得光滑表面，避免切到组织。
    2. 将石蜡块安装至切片机上。调整方向并去除多余石蜡，以4 µm厚度连续切片。将切片漂浮于50 °C水浴中，然后转移至载玻片上。
    3. 将载玻片置于60 °C烘箱中干燥，以去除残留水分。
      备注：干燥时间为12–48小时。
  6. 脱蜡
    1. 依次进行孵育处理：二甲苯I（15分钟），二甲苯II（15分钟），100%乙醇I（5分钟），100%乙醇II（5分钟），90%乙醇（5分钟），80%乙醇（5分钟），70%乙醇（5分钟），蒸馏水（5分钟）。
  7. 苏木精染色
    1. 用苏木精对切片染色50秒。
    2. 用流动自来水冲洗10分钟。
  8. 伊红染色
    1. 用伊红对切片染色40秒。
  9. 脱水
    1. 将切片依次浸入95%乙醇I（30秒）、95%乙醇II（30秒）、100%乙醇I（30秒）和100%乙醇II（30秒）。
  10. 透明处理
    1. 将切片转移至二甲苯I中10分钟，再转移至二甲苯II中10分钟。
  11. 封片与观察
    1. 滴加封片介质，盖上盖玻片，并去除气泡。
    2. 待封片介质凝固后，在光学显微镜下观察切片。

2. 单细胞RNA测序

  1. 单细胞悬液的制备
    1. 使用剪刀将肠道组织剪碎成约 1 mm3 大小的组织片段。
    2. 将组织片段置于含有 1 mg/mL 胶原酶 II 和 0.1 mg/mL DNase I 的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）中，在 37 °C 条件下于摇床平台（60 rpm）上轻柔振荡孵育 30 分钟。
    3. 加入等体积含 10% 胎牛血清（FBS）的冷 DMEM 终止消化反应。
    4. 将悬液通过 70 µm 细胞筛过滤，于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟。
    5. 弃去上清液，保留细胞沉淀。用含 0.04% 牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。
    6. 通过轻柔吹打分散细胞团块，获得单细胞悬液。
    7. 将悬液通过 40 µm 细胞筛过滤。
    8. 于 4 °C 以 300 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，收集细胞沉淀。
    9. 将细胞重悬于含 10% FBS 和 1% 青霉素-链霉素（P/S）的 DMEM 中。
    10. 使用台盼蓝染色排除法测定细胞活力和密度。选择细胞活力 >80% 的样本，并将细胞浓度调整至 700–1,500 个细胞/µL。
      注意：将细胞悬液与台盼蓝按 1:1 混合，使用血细胞计数板计数活细胞。
  2. 文库制备
    1. 每轮文库制备加载约 15,000 个细胞。
      注意：在凝胶珠-乳液（GEM）微滴中，mRNA 与凝胶珠上的 poly(dT) 寡核苷酸杂交。
    2. 进行逆转录并使用 PCR 扩增 cDNA（95 °C 预变性 10 分钟；95 °C 15 秒、60 °C 35 秒、72 °C 25 秒，共 40 个循环；72 °C 延伸 25 秒）。使用扩增后的 cDNA 构建 3′ 单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）文库。
      注意：cDNA 合成过程中会添加 CCC 悬垂端，该结构可与模板转换寡核苷酸（TSO）序列配对。
    3. 破乳并从 GEM 中回收 cDNA。
  3. 文库质控与测序
    1. 定量基因表达水平，并评估片段大小分布。
    2. 使用荧光定量 qPCR 仪器进行精确浓度测定。
      注意：确保文库浓度 ≥10 nM。
    3. 使用测序仪进行文库测序。
      注意：测序读段结构：Read 1（26 bp）、Read 2（91 bp）、i7 index（8 bp）；目标测序深度约为每细胞 50,000 条 reads。
  4. 数据质控
    1. 将原始测序 reads 比对至参考数据库，进行 UMI 计数并生成细胞-基因表达矩阵。
    2. 将结果以 AnnData（带注释的数据）格式导入，用于后续分析。
    3. 基于 UMI 数、基因数和线粒体来源 reads 进行质控过滤。
      注意：去除双细胞（使用 Scrublet）；排除基因数 <200 或 >5,000、总 reads 数 >40,000 或线粒体比例（mt_ratio）>20% 的细胞。
  5. 降维与注释
    1. 将每个细胞的 Unique Molecular Identifier（UMI）计数归一化至 10,000。
    2. 识别高变基因。
    3. 进行主成分分析（PCA）。
    4. 构建 k-最近邻图（k-nearest neighbor graph）。
    5. 进行 UMAP 降维嵌入。
    6. 在 Scanpy（v1.9.3）中使用 Leiden 算法进行细胞聚类。
      注意：使用 sc.pp.neighbors 和 sc.tl.leiden（resolution = 0.5）。
    7. 使用专为单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据设计的自动化高精度细胞类型注释工具进行细胞类型注释。
  6. 差异分析
    1. 在 R（v4.2.2）中使用 Seurat（v4.3.0）进行差异基因表达分析。
      注意：使用 FindMarkers 函数并采用 Wilcoxon 秩和检验。
    2. 使用 clusterProfiler（v4.8.1）中的 enrichGO 进行 GO 富集分析。
      注意：包括细胞组分（CC）、分子功能（MF）和生物过程（BP）三类。
    3. 使用 clusterProfiler（v4.8.1）中的 enrichKEGG10 进行 KEGG 通路富集分析。

3. 废物处理

  1. 分别收集含有甲醛和二甲苯的废液。
  2. 适当情况下中和酸性溶液，或作为危险废物处理。
  3. 遵守机构的环境健康与安全（EHS）规定。

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结果

苏木精-伊红（HE）染色（图1）显示节段性肠段与无神经节肠段之间存在明显的组织学差异。与有神经节肠段相比，无神经节肠段表现出黏膜脱落增加、杯状细胞和黏膜下神经元显著减少，以及黏膜层与肌层之间的界限模糊。在部分切片中，组织保存质量欠佳，出现上皮部分脱离及组织结构破坏，限制了这些区域的组织学评估。

经过质量控制（QC）过滤后，每个组保留了超过 6,000 个细胞用于下游分析（表 2；图 2）。采用均匀流形近似与投影（UMAP）进行降维和聚类。根据经典标记基因的表达情况，细胞被划分为 24 个转录组上明显不同的簇（图 3）。

图4A 和 4B 显示了节段性肠管与无节段性肠管之间相对细胞丰度的差异。...

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讨论

对患有先天性巨结肠病患者的手术切除结肠组织（节段性有神经节和无神经节区域）应用单细胞RNA测序技术，以分析其转录组特征4,5。特别关注组织解离策略，因为解离参数会影响细胞回收率、细胞类型代表性以及RNA完整性。通过优化酶消化条件，以在充分解离组织的同时，保持细胞活力和转录组质量之间达到平衡。鉴于肠道组织具有致密的细胞外基质和复杂的结构，采用中等强度的酶解作用和可控的孵育时间，以最大限度减少细胞损伤、应激诱导的转录假象以及RNA降解。

不同细胞类型的解离效率存在差异，某些细胞群体（尤其是免疫细胞）在酶消化和机械解离过程中可能更容易丢失。因此，在单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据中观察到的细胞类型丰度差异，包括无神经节段中免疫细胞比例降低，可能既反映了生物学差异，也受到实验操作相关偏差的影响。长时间消化或过度机械处理可能优先影响脆弱的细胞群体，而消化不足则可能导致组织解离不完全，使嵌入较深的细胞被低估。所选用的实验参数在承认原代组织单细胞RNA测序实验固有偏差的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由贵州省科技项目（贵州科技合作－基础－ZK－［2024］一般344号）（资助X.F. Yang）和遵义市科技项目合同（科技合作）（遵科合HZ（2023）号）（资助Y. Qu）提供支持。

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材料

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CellTypistN/ANAhttp://celltypist.org/tutorials/onlineguide
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胶原酶II赛默飞世尔科技17101015 https://www.thermofisher.cn/order/catalog/product/17101015?SID=srch-srp-17101015
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