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单细胞RNA测序用于分析赫希斯普伦病患者神经节和神经节结肠段

DOI：

10.3791/69825

⸱

2026年5月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Zunyi Medical University

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方案描述了一种单细胞RNA测序工作流程，用于分析赫希斯普伦病中神经节和无节结节间的免疫细胞浸润及细胞类型特异性转录差异。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

赫希斯普伦病（HSCR）是一种先天性肠道动力障碍，其特征是远端肠道神经元缺失。与大规模RNA测序相比，单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够在单细胞层面进行基因表达谱分析，解决群体平均分析中被掩盖的细胞异质性。建立了标准化的scRNA测序流程，用于表征HSCR患者神经节和神经节片段的转录景观。采集结肠组织，并进行了血液素和伊红染色以识别神经节和神经节区。组织通过酶和机械解离为单细胞悬浮液，随后进行过滤、存活性评估和构建单细胞转录组文库。通过质量控制的文库被测序，原始数据被处理以进行细胞定量和质量过滤，以去除低质量细胞和技术伪影。在归一化和降维后，细胞被聚类并基于已知标记基因进行注释。下游分析比较了神经节和神经节细胞组织的细胞类型组成，并在关键免疫细胞亚组中识别出表达差异的基因。结果显示HSCR中神经节段与神经节节段在免疫微环境中存在显著差异。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

赫希斯普伦病（HSCR）是最常见的先天性肠道动力障碍之一，全球约每5,000名活产儿中有1例发生率。该病因于肠道神经嵴细胞（ENCC）在胚胎第5至12周期间未能迁移至远端肠道，导致受影响节段缺乏肠神经节2。因此，神经节表现出持续痉挛性收缩和蠕动功能障碍，导致近端肠道扩张。临床上，这表现为功能性阻塞，导致便秘、腹部膨胀和呕吐，严重情况下可能危及生命。神经节的外科切除仍是HSCR的主要治疗方法;然而，相当一部分患者会出现术后并发症，包括便秘、肠炎和粪便濘，这些都会显著影响生活质量3。此外，大范围肠道切除后可能发生短肠综合征（SBS），导致营养吸收受损并增加临床管理挑战。因此，阐明HSCR的潜在机制和新治疗靶点的识别仍是临床上的关键需求。

近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）被广泛应用于研究疾病相关的分子机制。与传统的体型RNA测序不同，scRNA-seq支持单细胞分辨率的基因表达分析，从而识别出在体型分析中被掩盖的细胞异质性和稀有亚群。因此，scRNA-seq已成为剖析细胞异质性和细胞间通讯的有力工具，推动了生物学和医学研究的发展5。该方法揭示了复杂疾病中的新致病机制和治疗靶点，包括阿尔茨海默病6、类风湿关节炎7、肺癌8和2型糖尿病9。

本研究应用scRNA-seq来表征HSCR患者神经节和神经节结肠组织的免疫细胞转录景观及浸润模式。工作流程包括三个主要步骤：单细胞悬浮液的制备和质量评估、构建3′单细胞RNA测序文库，以及下游生物信息学分析。组织样本在切除后立即保存在专用单细胞保存液中，并在48小时内通过酶解解分离成单细胞悬浮液。细胞存活率超过80%，最终细胞浓度在文库制备前调整为700–1,500细胞/μL。比较了神经节段与片节间的免疫细胞浸润情况，并鉴定出表现出显著转录差异的免疫细胞亚群。这些分析界定了与结肠病变相关的HSCR免疫细胞变异。

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方案

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本研究获尊义医科大学附属医院机构伦理委员会批准（批准号：KYLL-2024-030）。该研究符合《赫尔辛基宣言》的要求。所有参与者及其监护人均获得了口头和书面的知情同意。 表1 展示了HSCR患者的信息。

采集在孙义医科大学附属医院儿科外科被诊断并接受手术的HSCR患者结肠组织，包括神经节和神经节段。包括两名男性HSCR患者的神经节和神经节段。详细临床信息见 表1。所有试剂、化学品、设备和软件均列于 材料表中。

1. 苏木精和伊松染色

  1. 组织采集与固定
    1. 将肠道组织样本固定在4%对甲醛固定液中，至少浸泡24小时。
      注意： 对甲醛有毒，会释放甲醛蒸气。所有操作均在化学熏蒸柜内完成，并使用适当的个人防护装备。
    2. 用手术刀修剪组织约5×5×2毫米3。将纸巾放入嵌入盒中，在自来水下冲洗24小时。
      注意： 去除组织边缘，准备至少一面平整的块状物。如果不均匀，冲洗后在滤纸纸之间夹上纸巾。
  2. 分级乙醇脱水
    1. 组织按顺序浸泡在乙醇溶液中：70%乙醇过夜，80%乙醇3小时，90%乙醇2小时，95%乙醇I2小时，95%乙醇II浸泡1小时，100%乙醇I浸泡1小时，100%乙醇II浸泡30分钟。
      注意： 将乙醇（≥99.7%）与超纯水稀释至指示浓度。
      注意： 在化学排气柜中进行乙醇处理。
    2. 取出脱水篮，步骤间彻底沥干。
  3. 清理
    1. 将组织转移到二甲苯上30秒以实现透明。
  4. 石蜡渗透与嵌入
    1. 提前一天以60°C融化石蜡。将新蜡进行三次冻融循环以去除气泡。第三次过滤后用滤纸过滤融化的石蜡。
    2. 将组织浸入纯石蜡（石蜡I）中1小时。
    3. 将组织浸润在石蜡混合物（石蜡II;纯石蜡：蜂蜡=8：1）中，浸泡2小时。
      注意： 使用前完全融化蜂蜡并过滤。
    4. 将石蜡二号倒入嵌入模具中。将组织块竖立平放，插入标签，让其凝固。
  5. 剖面
    1. 修剪石蜡块以获得光滑表面，避免切割组织。
    2. 把块装到切片机上。调整方向并去除多余的石蜡。切割4微米厚度的连续切片。将部分浮在50°C的水浴中，然后转移到玻璃载玻片上。
    3. 在60°C的烤箱中干滑片以去除残留水分。
      注意： 干燥区段12至48小时。
  6. 脱石蜡
    1. 进行顺序培养：二甲苯I（15分钟）、二甲苯II（15分钟）、100%乙醇I（5分钟）、100%乙醇II（5分钟）、90%乙醇（5分钟）、80%乙醇（5分钟）、70%乙醇（5分钟）和蒸馏水（5分钟）。
  7. 血液素染色
    1. 用血液素染色切片50秒。
    2. 用自来水冲洗10分钟。
  8. 嗜碱染色
    1. 用伊欧素染色40秒。
  9. 脱水
    1. 将切片依次浸泡在95%乙醇I（30秒）、95%乙醇II（30秒）、100%乙醇I（30秒）和100%乙醇II（30秒）中。
  10. 清理
    1. 将切片转移到二甲苯I中10分钟，再用二甲苯II10分钟。
  11. 装配与观察
    1. 加入安装介质。用玻璃罩套覆盖并清除气泡。
    2. 让装裱介质凝固。用光学显微镜检查切片。

2. 单细胞RNA测序

  1. 单电池悬浮液的制备
    1. 用剪刀将肠道组织切碎成~1毫米3 块。
    2. 在37°C的摇晃平台上，轻轻搅拌，将含有1 mg/mL胶原酶II和0.1 mg/mL DNase I的Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）组织碎片孵育30分钟。
    3. 通过添加等量含10%胎牛血清（FBS）的冷DMEM终止消化。
    4. 将悬浮液过滤过70微米的电池过滤。离心机在300 ×克 ，4°C下5分钟。
    5. 丢弃上清液，保留细胞颗粒。用含0.04%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）冲洗一次。
    6. 通过温和移液法解离细胞团块，获得单细胞悬浮液。
    7. 通过40微米的细胞滤网过滤悬浮液。
    8. 在300 ×克 离心机，4°C下离心5分钟。 丢弃上清液，收集沉淀液。
    9. 将细胞重新悬浮于含有10%FBS和1%青霉素-链霉素（P/S）的DMEM中。
    10. 利用锥蓝排除法确定细胞存活率和密度。使用存活率>80%的样品，并将浓度调整至700–1,500细胞/μL。
      注意： 将细胞悬浮液与特洛潘蓝（1：1）混合，并使用血细胞计计数有活力的细胞。
  2. 图书馆准备
    1. 每次运行约加载15,000个细胞以进行库准备。
      注意： 在凝胶乳液珠（GEM）微滴中，mRNA与凝胶珠上的多（dT）寡核苷酸杂交。
    2. 进行逆转录并利用PCR扩增cDNA（95°C10分钟;40个95°C循环15秒，60°C35秒，72°C25秒;最终扩展72°C25秒）。使用扩增的cDNA构建3′ scRNA-seq文库。
      注意： 在cDNA合成过程中加入CCC悬垂，并与模板切换寡核苷酸（TSO）序列配对。
    3. 破坏乳剂，从GEM中回收cDNA。
  3. 文库质控与测序
    1. 定量基因表达并评估片段大小分布。
    2. 使用荧光qPCR仪器进行准确定量。
      注意： 确保图书馆浓度≥10 nM。
    3. 使用测序仪器的序列库。
      注意： 读结构：读1（26基点）、读2（91个基点）、i7指数（8个基点）;目标深度 ~每单元50,000次读数。
  4. 数据质量控制
    1. 将原始读数与参考数据库对齐。进行UMI计数并生成按基因分类的细胞基质。
    2. 导入 AnnData（注释数据）格式的结果以便下游分析。
    3. 基于UMI、基因计数和线粒体读段进行QC过滤。
      注意： 脱下双层上衣（Scrublet）;排除含有<200或>5,000个基因、total_counts >40,000个或mt_ratio >20%基因的细胞。
  5. 降维与注释
    1. 归一化唯一分子标识符（UMI）计数为每个细胞10,000个。
    2. 识别高度变异的基因。
    3. 进行主成分分析（PCA）。
    4. 构造一个k-最近邻图。
    5. 执行UMAP嵌入。
    6. 在 Scanpy（v1.9.3）中使用 Leiden 算法进行聚类单元。
      注意： 使用 sc.pp.neighbors 和 sc.tl.leiden（分辨率 = 0.5）。
    7. 使用专为单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据中自动高精度标注细胞类型的工具，对细胞类型进行注释。
  6. 微分分析
    1. 使用Seurat（v4.3.0）在R（v4.2.2）中进行差异基因表达分析。
      注意： 使用FindMarkers函数配合Wilcoxon秩和检验。
    2. 使用clusterProfiler（v4.8.1）配合enrichGO进行Go富集分析。
      注意： 包括CC、MF和BP类别。
    3. 使用clusterProfiler（v4.8.1）与enrichKEGG10进行KEGG通路富集分析。

3. 废物处理

  1. 分别收集含对甲醛和二甲苯的废物。
  2. 适当时中和酸性溶液，或作为有害废弃物处理。
  3. 遵守机构环境健康与安全（EHS）法规。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

血液素和伊红（HE）染色（见图1）揭示了神经节段和神经节段间明显的组织学差异。与神经节节相比，神经节段表现出黏膜剥蚀增加，杯状细胞和黏膜下神经元显著减少，黏膜层与肌肉层的界限模糊。部分切片中组织保存不佳，部分上皮脱落和组织结构破坏，限制了这些区域的组织学评估。

经过质量控制（QC）过滤后，每组保留了超过6000个细胞供后续分析（表2; 图2）。采用统一流形近似与投影（UMAP）技术进行降维和聚类。基于典型标记基因表达，细胞被分类为24个转录上不同的簇（见图3）。

图4A和4B显示了神经节段与神经节节段间相对细胞丰度的差异。基...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

单细胞RNA测序应用于剖析赫希斯普伦病患者手术切除结肠组织（神经节和神经节段）的转录特征 4,5。特别关注组织解离策略，因为解离参数影响细胞恢复、细胞类型表现和RNA完整性。酶促消化条件经过优化，以平衡足够的组织解离与细胞存活率和转录组质量的保留。鉴于肠道组织的致密细胞外基质和复杂的结构，采用适度的酶效强度和可控的培养时间，以最大限度减少细胞损伤、应激诱导的转录伪影和RNA降解。

解离效率因细胞类型而异，某些群体，尤其是免疫细胞，在酶消化和机械解离过程中可能更容易丧失。因此，scRNA-seq数据中观察到的细胞类型丰度差异，包括神经节中免疫细胞代表性减少，可能既反映了生物学差异，也反映了程序相关偏差。消化时间延长或过度机械干扰可能优先影响脆弱细胞群体，而消化不足则可能导致不完全解离和嵌入细胞代表性不足。所选参数优先考虑可重复性和数据质量，同时承认原级组织scRNA-seq实验中固有偏差

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本工作得到了贵州科技项目（贵州科技合作基金会 - ZK - [2024] General 344）（归杨旭雄）和尊义科技项目合同（科技合作）（遵义科技合作HZ，2023）号（致Y. Qu）。

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材料

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