本文利用数字显微镜生成的图像，逐步展示对棉花植株叶片和苞片蜜腺进行表型分析的过程。该方法可有效对棉花叶片和苞片的蜜腺进行评分，因为相关数据能够以数字图像的形式进行采集和保存。
本文内容
摘要
摘要
蜜腺是许多植物物种中存在的特化蜜汁分泌腺体。蜜腺 具有多样的结构和功能。在棉花中，传统的 蜜腺性状的评分容易出错、可靠性差，且存在局限性，因为该性状的表型通常肉眼不可见。蜜腺性状的表达由基因控制， Ne1 和/或 Ne2. 此外，性状表达可能受到环境和生长阶段的影响，因此需要准确的评分方法。特别是通过数字图像进行表型评分，可实现对蜜腺更精确的评分。该方法通过生成高分辨率图像，克服了传统评分方法的局限性，进一步促进了蜜腺的识别与区分。 在保留这些数字图像以供未来参考的同时，细致地区分蜜腺性状表达的细微差异。本文所述的表型评分方法可 可轻松调整用于评估其他植物性状，如腺体、毛状体和颜色。这些评分方法可根据不同植物物种进行相应调整。本文将逐步介绍如何从田间或温室中采集样本，进行解剖后利用数字显微镜观察，并保存图像以供后续评分分析。本方法以棉花植株的叶片和苞片样本为例，用于区分蜜腺的存在状态（完全发育、退化和遗迹状）以及蜜腺的缺失情况。
引言
在大多数被子植物、部分蕨类植物和部分裸子植物中，植物具有称为蜜腺的特化腺体，用于合成和分泌花蜜1,2,3,4。根据产生花蜜的细胞来源，蜜腺可分为三种类型：叶肉型、毛状体型和表皮型5。棉花的蜜腺是特化的气孔结构，由称为乳头状突起的腺毛组成，归类为毛状体型蜜腺5,6。大多数Gossypium物种都具有蜜腺，但该属内不同物种的蜜腺数量存在差异7。在植物中，花内蜜腺（FNs）比花外蜜腺（EFNs）更为常见8。这些蜜腺可出现在植物体除根部以外的任何部位1,2。例如，Gossypium hirsutum同时具有花内和花外蜜腺9。栽培棉花植株具有三个花外蜜腺和一个花内蜜腺10。这三个花外蜜腺分别为叶部蜜腺、苞片蜜腺和环苞蜜腺11。叶部蜜腺属于营养器官，通常位于叶片中脉下方；而苞片蜜腺和环苞蜜腺属于生殖器官，分别发育于苞片基部和花萼远轴面。花内蜜腺与花朵相关，发育于花萼近轴面（上表面）。该蜜腺性状由单个基因位点控制12。两个独立研究团队的研究表明，该性状由一个基因控制，即A基因组中的Ne1基因或D基因组中的Ne2基因，分别定位于第12号和第26号染色体12,13。该性状仅在双隐性条件下表达，即只有纯合隐性基因型才会表现出无蜜腺性状。
除了这些基因外，环境条件和生长阶段也在调控表达程度方面起着作用。因此，需要一种准确的方法来对该性状进行评分。本研究重点对棉花叶片和苞片蜜腺进行表型鉴定。具有可见泌蜜蜜腺的植株记为有蜜腺型，缺乏该性状的植株记为无蜜腺型。1,2,3,4本文的主要目标是利用数字显微技术展示对蜜腺性状进行精确评分的方法。传统的直接视觉观察评分法难以检测蜜腺性状表达变异的差异。 原位 肉眼难以观察到。这些蜜腺性状表达的细微差异可通过数字显微镜进行可视化。例如，在棉花叶片蜜腺中，评分标准采用1-4的等级体系：1表示无蜜腺，2表示叶脉上出现微隆起的表型，3表示未充分发育的垫状或脊状结构且无蜜汁，4表示具有明显垫状和脊状结构的完全形成/成熟蜜腺。13该表型评分基于叶片蜜腺的数字图像（使用叶片中脉背面（下表面）的数字图像）生成。通常，无蜜腺的表型记为0分，但为满足统计学分析要求，0值无法使用，因此以1代替。故表型评分范围由标准的0-4级调整为1-4级。13花的评分标准采用类似的1-4分制，其中1分表示无蜜腺，无明显腺体，无垫状或脊状结构；2分表示腺体模糊，蜜腺仅有轻微的垫状痕迹且无花蜜；3分表示腺体发育不良，脊或垫状结构微弱或缺失；4分表示蜜腺完全发育且有花蜜。该评分体系中，4分对应有蜜腺表型（单个基因的显性纯合或杂合状态），3分和2分对应蜜腺性状的差异表达（如杂合状态），1分对应无蜜腺表型（两个基因均为隐性纯合）。
同样，按照本文逐步描述的方法收集并解剖花朵，以获取用于评估苞片蜜腺的数字图像。该表型可通过显微镜观察，实现准确评分，并以数字图像形式保存。在棉花中，蜜腺性状不仅吸引传粉者，也会吸引导致产量损失的害虫。14为解决这一问题，育种人员选择无蜜腺（nectariless）性状的植株，作为不使用化学农药而自然控制害虫的替代方法。9,15无蜜腺性状最初是从 Gossypium tomentosum 到 Gossypium hirsutum （栽培陆地棉）8该评分方法特别适用于鉴定由具蜜腺亲本与无蜜腺亲本杂交所产生的后代群体中无蜜腺性状的分离情况。由于这些不同亲本的杂交，F2 （子二代）表现出纯合有蜜腺、杂合有蜜腺和纯合无蜜腺的不同基因型。蜜腺性状的表达仅需一个显性基因，其分离比为15:1（9:3:3:1）。因此，在纯合隐性基因型条件下，每16株中有1株表现出无蜜腺性状 ne1ne1ne2ne2然而，育种项目的研究人员观察到无蜜腺植株系的数量超过了预期的1/16比例。这意味着当基因表达时，蜜腺性状即表现出来 Ne1Ne1Ne2Ne2、Ne1ne1Ne2ne2、ne1ne1Ne2Ne2、ne1ne1Ne2ne2、Ne1ne1ne2ne2 和 ne1ne1ne2Ne2. 纯合泌蜜植株群体中蜜腺性状表达的多样模式Ne1Ne1Ne2Ne2），半合子蜜腺（Ne1ne1Ne2ne2），以及纯合的无蜜腺突变体（ne1ne1ne2ne2植物可通过检测数字图像中呈现的变化进行准确评分12,13由于具有减少型蜜腺的杂合植株在表型上可能无法直观显示蜜腺特征，其外观可能与无蜜腺植株相似，因此通过肉眼表型鉴定难以可靠地选择该性状。这一问题在生长季后期尤为突出，因为某些棉花品种在此时期蜜腺本身即不发育。利用数字成像技术可轻松区分杂合植株与纯合无蜜腺植株，因为杂合植株可能表现出微小或退化的蜜腺，而纯合植株则完全缺失该性状。在表型分类上，具有蜜腺的植株归类为有蜜腺型（纯合或杂合，至少含有一个显性基因），具有微小或残余蜜腺的归类为杂合型，而完全缺失蜜腺的则归类为纯合无蜜腺型。采用数字图像评分可减少将杂合植株误判为无蜜腺植株的错误。同样，中期开花阶段因性状表达最为充分而被优先选用。因此，在此阶段采集叶片和花朵样本，以开展表型评分实验，实现对蜜腺性状的准确与可靠评估。此外，利用数字显微成像观察蜜腺性状可避免或减少对本无蜜腺性状群体的假阳性判断。该蜜腺性状的表型评分方法也正应用于遗传定位研究，以鉴定与无蜜腺性状相关的DNA标记，供育种者用于无蜜腺性状的分子标记辅助选择（MAS）。13该评分技术除可用于研究蜜腺、毛状体和颜色等其他性状外，还可推广至其他植物物种。总体而言，数字图像评分不仅通过提供高分辨率图像解决了蜜腺性状评分不准确的问题，而且能够识别细微的表达变化，并将数字图像保存以供后续使用。无蜜腺性状的棉花除可用于害虫生物防治外，还可用于回答该性状如何促进有益昆虫互作的相关科研问题。
方案
1. 叶片的温室/田间取样（图1）
- 准备好带有样本编号的自封袋。将样本袋在室温下保存，直至使用。
- 在样本采集前一天，将冷藏箱放入冰箱预冷。从冷冻柜中取出冰袋，放置在冷藏箱底部，并在冰袋上方放置一个塑料托盘。
注意：任何便携式冷藏箱均可用于此目的。在将冷藏箱运送至样本采集地点前，先在箱内放置冰袋，再放上塑料托盘（这种分隔方式可防止样本因直接接触冰块而发生冻结损伤）。 - 将冷藏箱和已标记的自封袋运送至温室或田间进行样本采集。为获得无虫害样本，田间植株需按常规喷洒杀虫剂。同样，温室植株也需按照常规喷洒和施肥计划管理，以确保植株健康。
- 从8至12周龄的温室或田间种植的棉花植株上采集幼嫩叶片组织，并放入已标记的样本袋中。
- 选择盛花中期进行样本采集，因为该发育阶段蜜腺性状表达最强。在此发育阶段，从所有植株上采集幼叶。蜜腺性状不仅受遗传和环境因素影响，还受发育阶段的影响。
- 为在F2群体不同基因型之间进行比较时保持发育阶段一致，应统一在同一个发育阶段采集叶片样本，以限定比较范围。以叶片长度5至7 cm作为参考标准，但应确保从所有样本中采集大小相近的幼叶。虽然老叶也可能表现出蜜腺性状，但在某些品系中，该性状在后期发育阶段可能不再表达。为避免此类变异并提高数据采集的一致性，采收样本时应遵循上述指导。
- 采集叶片组织并放入对应的样本袋中。每份植株样本至少采集2片叶子。
- 采集叶片组织时，选择植株顶端分枝上叶片宽度为5至7 cm的健康叶片。
注意：所有样本均优先选择顶端分枝上的幼叶。此类采样方式不仅可将采样限定于特定发育阶段，还可通过保持样本类型一致来减少表型鉴定中的误差。其他考虑因素包括易于获取和叶片健康状况。当从相同发育阶段采集多片植株叶片时，有助于在群体中准确识别基于基因型的表型差异。 - 将每份密封的样本袋连同叶片组织一起放入冷藏箱中，并将冷藏箱运送至实验室。
- 将各个样本转移至冰箱中，保持4 °C的低温条件，直至进行蜜腺的数字成像。样本可在冰箱中保存最多2天，但建议在采集当天或次日完成图像采集。
- 若需筛查大量叶片样本，应分批采集，确保在采收后1天内完成成像。每次采集10至20份样本为一批，或使用多个冷藏箱，以防止组织受损或折叠。为获得高质量的数字图像，样本采集过程中应格外小心。
2. 花朵的温室/田间采样（图1）
- 按照步骤 1.1 至 1.6 操作。从生长 8 至 12 周的温室或田间棉花植株上采集花朵。每份植株样品至少采集 2 朵花。
- 通常在植株处于盛花期时，从顶部枝条采集花朵。盛花期时，蜜腺性状的表达水平最高。
- 选取健康的花朵。将每个至少含有两朵花的密封样品袋放入冷藏箱中，并将冷藏箱运送至实验室。
- 将各个样品转移至冰箱中，以维持 4 °C 的低温条件。在进行苞片蜜腺的数字成像前，样品需存放于冰箱中。
- 应在采集当天或次日处理样品。采集花样品后，将其保存在 4 °C 环境中，并于当天完成苞片蜜腺的处理。对于在次日或本周稍晚时间产生的花朵，也应在采集当天进行苞片蜜腺的数字成像处理。
3. 数字显微镜初始设置（补充图1）
注意：也可使用其他类似的显微镜对图像进行数字采集和存储。
- 打开显微镜（VHX 600）并完成初始步骤。将一张对折的A4白色纸张放置在显微镜载物台上，使其大小与载物台匹配。
- 使用控制台控制器上的小型灯光旋钮，调节显微镜平台/载物台的光照。
- 将控制台上的灯光开关（小型旋钮）调至最大以获得最强光照，同时将亮度开关（大型旋钮）旋转至约四分之三位置，即中高亮度。
- 内置的VHX 600软件会在计算机屏幕上显示调节镜头的选项。在屏幕上选择10倍镜头选项，将镜头调节至10倍放大倍数。 打开计算机前面板上的显示器电源开关，主菜单将出现，显示镜头调节和图像记录选项。
- 从冰箱中取出少量样品（3至5个）放入冷藏盒中，用于数字成像。将装有样品的冷藏盒放置在显微镜旁边。
- 将切板和无菌刀片放置在靠近显微镜的实验台面上。从冷藏盒中取出一个样品，并取出样品组织，准备进行数字成像（图1）。
4. 叶片蜜腺的数字成像与评分（图2）
- 按照步骤1和3操作。打开样品自封袋，将叶片样品放置在切板上，使用无菌刀片切割叶片的叶柄。
注意：为安全使用刀片，请佩戴手套，并确保刀片的锋利边缘远离手指，在进行切口时将组织置于手指之间 。 - 将叶片组织转移至载物台上已预先裁剪好的白色纸片上。将叶片组织翻转至显微镜载物台中央，使叶片的远轴面朝上。
- 通过轻轻旋转显微镜调焦旋钮的粗调和微调装置，对准叶片中脉进行聚焦。持续调节直至图像无模糊。
- 由于蜜腺位于中脉的下端，应将其保持在视野中央，即中脉与分叉侧脉的交汇处。确保叶片在载物台上居中且聚焦清晰。
注意：栽培棉花中仅观察到一个叶蜜腺，而野生类型则表现出三个蜜腺，分别位于中脉一个，以及中脉两侧各一个侧脉上（蜜腺总数：3）。 - 调节显微镜的粗调和微调装置，以提高数字图像的清晰度。进行所有图像调整，以捕获并保存叶片蜜腺图像。
- 为避免数字图像出现光线反射，请关闭所有光源，并在计算机屏幕上记录图像。关闭室内所有灯光，使用台灯处理每个样品。完成所有操作步骤后，关闭台灯，仅保留显微镜光源，然后记录图像。
- 当程序弹出包含多个保存选项的窗口时，保存图像。根据样品编号为每张图像标注标签后保存。根据蜜腺表型特征，将叶蜜腺数字图像评分分为1、2、3和4级。为每个样品编号更新相应的评分记录表。
5. 苞片蜜腺的数字成像与评分（图3）
- 按照步骤 2 和 3 操作。转移少量花样品（2-3 个）进行成像。将花样品从自封袋中取出。
- 使用镊子或手动去除花的苞片。将花放置在干净的切板上。使用无菌刀片切割花的花梗。使用无菌刀片沿去除苞片后的边缘做直线切口。
- 将组织倒置（叶柄朝上）放置在显微镜载物台上的预裁白纸上。
- 使用粗调和微调旋钮改善屏幕上显示图像的清晰度。完成所有图像调节后，点击控制台控制器上的记录按钮以捕获叶片图像。
- 通过将小旋钮/光源开关调至最大，大旋钮/亮度开关调至中高（将旋钮旋转至 ¾th 位置）来进行图像调节。然后通过旋转显微镜的粗调和微调旋钮进一步提高图像分辨率。保持这些调节设置不变，并在记录完整组样品的图像前连续更换样品。为避免数字图像中出现光线反射，请关闭所有光源，并在计算机上记录图像。
- 随后，程序将弹出窗口显示计算机上所有可选的存储位置。将数字图像以样品编号为文件名保存在计算机中。
- 根据所获得的数字图像中观察到的表型，对苞片蜜腺（补充图 2）按 1、2、3 和 4 进行评分。在评分表中更新样品编号及对应评分，以供后续分析使用。
结果
选择在田间生长8至12周的棉花植株用于本研究。每株植物的每种组织类型至少采集两个技术重复样本。健康的幼嫩叶片样本取自顶部枝条，叶片长度为5至7 cm。健康的花样本取自开放的花朵或当天即将开放的花蕾。叶片和花样本从不同品系的棉花植株中采集，随后在实验室中使用显微镜对两种组织类型生成数字图像（图1）。从样本采集到成像的所有步骤均按照上述方法进行（如图2和图3所示）。叶片和苞片蜜腺的代表性结果通常表现为：无蜜腺（1）、具有中间表型的蜜腺（2, 3），以及发育完全并分泌花蜜的蜜腺（4）。图4中的数据来自两株不同的棉花植株（有蜜腺和无蜜腺）所获得的数字图像。对叶片远轴面（中脉下方）进行数字图像评分的结果显示两种表型：评分为1（中脉上无蜜腺）和评分为4（中脉上具有发育完全且分泌花蜜的蜜腺；图4A,B）。类似地，当分析花样本的苞片蜜腺时，也观察到两种表型：评分为1（无蜜腺）和评分为4（形态完整并分泌花蜜的蜜腺；图4C,D）。理想情况下，来自同一植株的叶片和花应呈现一致的表型模式，即无蜜腺的叶片与无蜜腺的花应来自同一植株，而有蜜腺的叶片与有蜜腺的花也应属于同一植株。图5是通过对有蜜腺植株的叶片和苞片蜜腺在10x、20x和40x放大倍数下采集数字图像而生成的，以便清晰观察蜜腺性状。为进一步理解在有蜜腺与无蜜腺棉花亲本杂交产生的F2分离群体中该评分方法的应用，从其中一个群体中采集叶片组织，并为每个叶片蜜腺样本生成数字图像。对应于标准评分格式1、2、3和4的代表性叶片数字图像在图613中进行了展示。最常见的易于识别的模式是蜜腺的有无。蜜腺缺失被赋予最低评分1，而发育完全的蜜腺被赋予最高评分4。介于1和4之间的评分2和3代表发育不全且体积小于正常蜜腺的结构。该模式可在纯合无蜜腺（评分为1，蜜腺缺失）、杂合状态（评分为2和3，蜜腺减少）以及评分为4（发育完全）的植株中观察到。此外，可将有蜜腺和无蜜腺的亲本品系与分离群体一同种植，以比较并理解这些差异。
图1：从取样到数码显微镜观察叶片和苞片蜜腺的可视化步骤概览。（A）选取处于盛花期的棉花植株，用于采集叶片和花样本。（B）从田间采集叶片样本，以观察叶片上的蜜腺性状。（C）将叶片翻转，使叶片的远轴面朝上，并在高亮的黑色框区域内观察蜜腺性状。（D）将叶片放置在显微镜载物台上，将焦点保持在高亮的黑色框区域，以记录叶片蜜腺的数码图像。（E）从田间采集盛花期的花朵（A）。（F）将花朵置于切板上，在白色框区域沿箭头方向作直线切口，分离花基部。（G）将切开的部分放置在显微镜载物台上，用于苞片蜜腺的数码成像。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：棉花叶片蜜腺数字化成像与评分的逐步操作流程。 1. 使用标记好的样品袋从田间采集叶片材料，并将其放入冷藏箱中；2. 将装有样品的冷藏箱运送至实验室；3. 从冷藏箱中取出单个样品；4. 打开单个样品袋，取出叶片；5. 手动或使用刀片切除叶片的叶柄；6. 将叶片放置于预设好的显微镜载物台上，确保叶片远轴面（下表面）朝上；7. 在计算机屏幕上的VHX 600程序中将放大倍数调整为10×，并通过粗调和微调旋钮调节显微镜，以获得最佳图像分辨率；8. 观察计算机屏幕上的图像，根据需要进行调整（通过旋转大小旋钮调节光照和亮度，使用显微镜上的粗调和微调按钮优化图像分辨率，并关闭其他光源以消除反光等），特别关注叶片蜜腺区域；9. 保存用于评分的数字图像。图像8和9中蜜腺周围的虚线圆圈标示了叶片蜜腺所在区域。在10×（100 µm）放大倍数下通过显微镜观察叶片蜜腺。在栽培棉花中仅可见一个叶片蜜腺（如本图像所示）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：棉花苞片蜜腺数字化成像与评分的逐步操作流程。 1. 从田间采集花样品，放入已标记的样品袋中，并置于冷藏箱内保存；2. 从冷藏箱中取出一个样品；3. 取出一朵花；4. 通过手工切割方式将苞片从花体上分离去除；5. 使用无菌刀片沿苞片边缘直线切开（如图 1中白色框所示），在进行苞片蜜腺数字化成像前完成此步骤；6. 将切开的部分翻转；7. 将切开部分的叶柄面朝上放置于显微镜载物台上；8. 调节显微镜控制台上的光源和亮度开关进行光照调整，并使用显微镜的粗调和微调装置，以获取高分辨率图像。所有图像均在显微镜10x（100 µm）放大倍数下观察。采集用于苞片蜜腺评分的数字图像。数字图像中苞片蜜腺的圆形结构标示蜜腺的存在，在栽培棉花中通常有3个苞片蜜腺。请点击此处查看该图的放大版本。
图4：棉花叶片蜜腺和苞片蜜腺的数字图像。（A）具蜜腺的叶片；（B）无蜜腺的叶片；（C）显示3个苞片蜜腺的花；（D）无苞片蜜腺的花。在显微镜下以10倍（100 µm）放大倍数观察叶片和花的蜜腺。虚线圆圈标示了叶片蜜腺和苞片蜜腺的有无。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5：对叶片和苞片蜜腺在10x、20x和40x放大倍数下进行观察，以便在数字图像中清晰识别蜜腺结构。（A）采集叶片样本，观察中脉上的蜜腺性状。（B）在显微镜下以10x放大倍数观察中脉处的叶片蜜腺。（C）在显微镜下以20x放大倍数观察中脉处的叶片蜜腺。（D）在显微镜下以40x放大倍数观察中脉处的叶片蜜腺。（E）切开花朵部分以观察苞片蜜腺。（F）在显微镜下以10x放大倍数观察苞片蜜腺。（G）在显微镜下以20x放大倍数观察苞片蜜腺。（H）在显微镜下以40x放大倍数观察苞片蜜腺。每幅图像中的比例尺表示拍摄叶片蜜腺或苞片蜜腺图像时所使用的放大倍数（如图所示为10x、20x和40x）。请点击此处查看该图的高清版本。
图6：叶蜜腺的标准评分模式，对应1、2、3和4分的形态特征。（A）无蜜腺的叶片样本，虚线圆圈内区域为高亮显示（蜜腺缺失，评分为1分）。（B）观察到的小型叶蜜腺，表现为杂合状态的一种形态（虚线圆圈内蜜腺图像评分为2分）。（C）评分为3分的叶蜜腺，为另一种杂合子表现型。（D）完全发育的蜜腺，评分为4分。比例尺10x表示图像拍摄时的放大倍数。请点击此处查看该图的高清版本。
图7：无需显微镜观察的叶片蜜腺和苞片蜜腺。本图展示了传统评分方法下蜜腺的外观表现。本图改编自13。请点击此处查看此图的放大版本。
图8：群体可能的基因型 该图展示了由具蜜腺和无蜜腺的不同亲本杂交后产生的F2群体的基因型。本表格改编自13。请点击此处查看此图的放大版本。
补充图1：数码显微镜装置。 请点击此处下载该文件。
补充图2：观察到的不同数量的苞片蜜腺。 请点击此处下载该文件
讨论
蜜腺是植物中产生花蜜的特化腺毛，有助于成功实现异花授粉。植物中既存在营养性蜜腺，也存在生殖性蜜腺。 Gossypium 棉属（cotton）拥有50多个物种，其中大多数物种具有叶蜜腺16然而，棉花的这一性状也会吸引害虫，导致进一步的产量损失17育种者首先选择了自然存在的无蜜腺性状（蜜腺缺失），该性状最初发现于 G. tomentosum 为了解决这一问题，他们将这种无蜜腺性状渗入到栽培的陆地棉中17最终，通过选择具蜜腺和无蜜腺品系作为亲本，培育出多个群体。由于纯合无蜜腺与杂合无蜜腺群体在肉眼观察下无明显差异，因此需要一种特殊工具来区分这些植株。因此，本研究采用数字显微镜评分法，而非传统评分法（如图所示） 图7），不仅可直观显示退化的蜜腺，还能避免不准确的结果 将杂合无蜜腺植株误判为纯合无蜜腺植株。
利用数字图像进行表型评分依赖于多个关键因素，例如样品采集的具体时间点、样品的选择、叶和苞片蜜腺的标准评分尺度、可能的基因型，以及评分数据在后续应用中的解读方式。首先，应在生长季节蜜腺分泌最旺盛的时期采集叶片和花朵，通常是在7月的盛花中期。其次，选择适当大小和发育阶段的叶片或花朵对表型评分至关重要。对于叶片蜜腺的评分，优先选择顶端枝条上叶片长度为5至7 cm的叶片。类似地，在进行苞片蜜腺评分时，选择来自顶端枝条的健康花朵。在特定发育阶段进行样品选择有助于排除因发育阶段不同而导致的性状表达差异，即使是在同一群体内比较所有植株时也是如此（如图8所示）。为了验证评分的可重复性，每株植物的每种组织至少采集两个样品生成数字图像。对同一植株采集多个重复样本有助于获得一致的数据。
该方法可能存在的局限性在于，在采样前维持植株无虫害状态。虫害区域可通过组织斑块、产在组织内的卵，或蜜腺区域受损且出现黑色区域来识别，后者因蚜虫或其他昆虫取食导致蜜腺无法被肉眼观察到。在对数百个样品进行筛选时观察到了此类现象。在此情况下，需重新采集健康的叶片和花朵，并对这些样品进行分析以获得一致的数据。通过定期实施病虫害防控措施，并补充肥料以促进植株健康生长，可解决此问题。严格遵循文中所述各项关键步骤，将有助于表型评分过程中的问题排查。
该技术具有多种应用，例如通过作图定位来鉴定DNA标记，帮助育种人员识别用于标记辅助选择的基因型。由于环境因素和发育阶段的影响，以及控制该性状的基因本身，该表型评分需要通过DNA标记进行验证。因此，利用数字显微镜对这一性状进行表型分析，将是缩小样本范围的起点，可将来自多个群体的大量植株筛选为少量疑似无蜜腺的品系。随后通过DNA标记进一步验证这些品系，以用于育种项目，培育具有无蜜腺性状介导的抗病性的新品种。该方法还可帮助研究人员理解蜜腺性状在植物与有益昆虫互作中的作用。
披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
美国农业部（USDA）是一个提供平等机会的供应商、雇主和贷款机构。本研究工作得到了美国农业部农业研究局（USDA-ARS）项目6066-21000-053-00D的支持。我们感谢Kayla Gines-Haggard和Wille Norals提供的关键性技术支持。本出版物中提及的贸易名称或商业产品仅用于提供具体信息，并不意味着美国农业部的推荐或认可。本文作者的观点和结论仅代表作者本身，不应被解释为代表任何美国农业部或美国政府的官方决定或政策。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 数码显微镜 | Keyence VHX | VHX 600 | 其他显微镜也可使用 |
| Farberware 砧板 | Farberware | 型号 78892-10 | 14英寸长 × 11英寸宽 × 0.5英寸厚，可使用任何品牌，此款可在amazon.com购买 |
| Igloos Laguna 小型 9 夸脱冷藏箱 | 冰屋 | 货号 00043567 | 可根据项目需求使用任意品牌/任意规格 |
| 塑料袋（400 个），3 英寸 × 4 英寸 | Aubeco 品牌 | NA | 4英寸长 × 3英寸宽 × 0.01英寸高，任何品牌均可使用，推荐使用透明彩色塑料材质 |
| 单个 边缘剃须刀片，100片装 | Weupe | NA | 任何品牌均可使用，此品牌可在 amazon.com 购买 |
参考文献
- Elias, T. S., Gelband, H. Morphology, anatomy, and relationship of extrafloral nectaries and hydathodes in two species of Impatiens (Balsaminaceae). Botan Gazette. 138 (2), 206-212 (1977).
- Vogel, S. Remarkable nectaries: structure, ecology, organophyletic perspectives IV. Miscellaneous cases. Flora. 193 (3), 225-248 (1998).
- Koptur, S., Smith, A. R., Baker, I. Nectaries in some neotropical species of Polypodium (Polypodiaceae): preliminary observations and analyses. Biotropica. 1982, 108-113 (1982).
- Pacini, E., Nepi, M., Vesprini, J. L. Nectar biodiversity: a short review. Plant Syst Evol. 238 (1), 7-21 (2003).
- Liao, I. T., Gong, Y., Kramer, E. M., Nikolov, L. A. The developmental basis of floral nectary diversity and evolution. New Phytol. 246 (6), 2462-2477 (2025).
- Espolador, L. Anatomy of the floral, bract, and foliar nectaries of Triumfetta semitriloba (Tiliaceae). Canadian J Botany. 83 (3), 279-286 (2005).
- Balendres, M. A., Nichols, D. S., Tegg, R. S., Wison, C. R. Metabolomes of potato root exudates: compounds that stimulate resting spore germination of the soil-borne pathogen Spongospora subterranea. J Agri Food Chem. 64 (40), 7466-7474 (2016).
- Roy, R., Schmitt, A. J., Thomas, J. B., Carter, C. J. Review: Nectar biology: From molecules to ecosystems. Plant Sci. 262, 148-164 (2017).
- Lukefahr, M. J., Rhyne, C. Effects of nectariless cottons on populations of three lepidopterous insects. J Econ Entomol. 53 (2), 242-244 (1960).
- Chatt, E. Nectar biosynthesis is conserved among floral and extrafloral nectaries. Plant Physiol. 185 (4), 1595-1616 (2021).
- Chatt, E. Systems analyses of key metabolic modules of floral and extrafloral nectaries of cotton. bioRxiv. , 857771(2019).
- Hu, W. Genetic and evolution analysis of extrafloral nectary in cotton. Plant Biotechnol J. 18 (10), 2081-2095 (2020).
- Park, S. H., Scheffler, J. A., Ray, J. D., Scheffler, B. E. Identification of simple sequence repeat (SSR) and single nucleotide polymorphism (SNP) that are associated with the nectariless trait of Gossypium hirsutum. Euphytica. 217 (4), 78(2021).
- Oscar Stapel, J., Cortesero, M. A., De Moraes, C. M., Tumlinson, J. H., Joe Lewis, W. Extrafloral nectar, honeydew, and sucrose effects on searching behavior and efficiency of Microplitis croceipes (Hymenoptera: Braconidae) in cotton. Environ Entomol. 26 (3), 617-623 (1997).
- Holder, D. G., Jenkins, J. N., Maxwell, F. G. Duplicate Linkage of Glandless and Nectariless Genes in Upland Cotton, Gossypium hirsutum L. Crop Sci. 8 (5), 577-580 (1968).
- Adams, K. L., Wendel, J. F. Polyploidy and genome evolution in plants. Curr Opin Plant Biol. 8 (2), 135-141 (2005).
- Meyer, V. G., Meredith, J. W. R. New germplasm from crossing upland cotton (Gossypium hirsutum) with G. tomentosum. J Heredity. 69 (3), 183-187 (1978).
重印与许可
