利用数字显微镜可视化棉花叶片和苞片蜜腺，以提高评分准确性和数据保存

Summary

本文，我们将通过数字显微镜生成的图像，逐步展示棉花植物叶片和苞片蜜腺表型的过程。这是一种有效的方法，可以对棉花叶片和苞片的蜜腺进行评分，因为信息可以以数字图像的形式收集和保存。

Abstract

蜜腺是许多植物物种中独特的花蜜分泌腺体。蜜腺具有多样的结构和功能。在棉花中，传统的花蜜性状评分容易出错、不可靠且存在限制，因为该性状的表型通常肉眼难以察觉。花蜜性状表达由基因 Ne1 和/或 Ne2控制。 此外，性状表达还可能受到环境和生长阶段的影响，因此准确的评分方法尤为重要。特别是，通过数字图像进行表型评分，使蜜腺的评分方法更加准确。这种方法克服了传统评分的局限，能够生成高分辨率图像。此外，有助于识别和区分花蜜性状的细微差异，同时保存这些数字图像以备未来参考。这里描述的这种表型评分方法可以轻松调整，用于评分腺体、毛发和颜色等其他植物性状。这些评分方法可以针对其他植物物种进行定制。本文将详细介绍如何从田间或温室采集样本、通过数字显微镜解剖观察，以及保存这些图像以供未来评分分析的步骤。在此方法中，我们将利用棉花植物叶片和苞片样本的评分，区分蜜腺（完全发育、退化且退化）与蜜腺的缺失。

Introduction

植物有专门的腺体，称为花蜜腺，在大多数被子植物、某些蕨类和部分裸子植物中合成并产生花蜜（^1,2,3,4）。蜜腺根据产生花蜜⁵的细胞起源，分为三类：中叶型、三叶型和上皮型。棉花中的蜜腺是由称为乳头的腺毛体组成的改良气孔，被归类为^5,6型毛虫。大多数Gossypium属物种具有蜜腺;然而，该属中蜜腺的数量因物种而异，⁷。花蜜腺（FNs）在植物中比花外蜜腺（EFNs）更常见⁸.这些蜜腺可以出现在植物的任何地方，除了根部^1,2。例如，Gossypium hirsutum 同时具有花外蜜腺。国内棉花植株显示三株额外花朵和一种花朵花蜜¹⁰。三个额外的花蜜腺分别是叶面、苞片和环状花蜜¹¹。叶片蜜腺为营养性，通常存在于中脉下侧的叶片上，而苞片和环苞片的蜜腺为繁殖性，生长在苞片和背侧萼片表面的基部。花朵蜜腺与花朵相关，花朵生长在花萼的轴面（上面）。该花蜜性状由单一基因座¹²控制。两个独立研究团队的研究发现，蜜腺性状由一个基因控制，即A基因组的Ne1或D基因组的Ne2，分别映射到12号和26号染色体^12,13。该性状仅在双隐性条件下表现出，意味着只有纯合隐性状态才会表达无蜜腺性状。

除了这些基因外，环境条件和生长阶段也在控制表达程度上起作用。因此，需要有准确的方法来评分这一特质。本研究重点是棉花中叶片和苞片蜜腺的表型分析。具有明显产花蜜花蜜的植物被评为有花蜜，而缺乏该特征的植物则被评^为无花蜜1^、2、3、4。本文的主要目标是利用数字显微技术，准确地评分蜜腺性状。传统的直接目视评分在肉眼中难以发现花蜜性状表达变化的差异。这些花蜜性状表达的细微差异可以通过数字显微镜观察到。举例来说，棉叶花蜜的评分标准遵循1-4的标准等级，其中1表示无花蜜，2表示脉状突起，3表示未发育的垫或脊且无花蜜，4表示完全形成/完整的蜜腺，具有透明的花瓣和脊¹³。这种表型评分是利用叶片蜜腺的数字图像生成的（利用叶片中脉下侧的数字图像）。一般来说，蜜腺缺失被评分为0，但为了统计显著性，不能使用0值并被1替代。因此，表型评分范围从标准分类^0-4-13调整为1-4。花的评分标准遵循类似的评分模式：1-4，其中1代表无花蜜、无明显腺体且无叶片或脊纹，2为遮蔽腺体，其中花蜜仅有细微的斑纹且无花蜜，3为发育不良且有淡或无脊和/或花蜜的腺体，4为完全成型且有花蜜的腺体。该评分模式显示，花蜜表型（其中一个基因为纯合/杂合显性）为4，花蜜性状差异表达为3,2为杂合，无花蜜（两个基因均为纯合隐性）为1。

同样，花朵也被逐步骤采集和解剖，以收集用于评分苞片花蜜的数字图像。该表型可以用显微镜观察，以便准确评分，并以数字图像形式存储。在棉花中，花蜜特性不仅吸引传粉者，还会吸引导致产量损失的害虫¹⁴.为解决这一问题，育种者选择了无蜜腺（无蜜腺）的植物，作为自然控制害虫的替代方案，无需使用化学农药^9,15.无花蜜性状最初由 Gossypium tomentosum 到 Gossypium hirsutum （种植高地棉花）⁸.这种评分方法对于识别由有花蜜的亲本与无花蜜亲本杂交产生的种群中无蜜性状的分离尤为有用。由于这些多元父母的杂交，F₂ （第二代）显示出纯合花蜜、杂合花蜜和纯合无花蜜的不同基因型。花蜜性状表达只需一个显性基因，遵循15：1（9：3：3：1）的分离比。因此，16个中就有1个会在基因型纯合隐性条件下表达无蜜腺性状 ne1ne1ne2ne2.然而，育种项目中的研究人员观察到的无花蜜血系数量超过预期的1/16比例。这意味着当基因表达为 Ne1Ne1Ne2Ne2, Ne1ne1Ne2ne2, ne1ne1Ne2Ne2, ne1ne1Ne2ne2, Ne1ne1ne2ne2, and ne1ne1ne2Ne2.这些纯合蜜腺群体中蜜腺性状表达的多样性模式（Ne1Ne1Ne2Ne2），杂合蜜腺（Ne1ne1Ne2ne2），以及纯合无蜜腺（ne1ne1ne2ne2）植物可以通过检测数字图像中可见的变化来完美评分^12,13.由于花蜜减少的杂合子植物可能在视觉上不表现出花蜜特征，且可能类似于无花蜜的无花蜜性状，因此视觉表型在该性状的可靠选择上存在挑战。这些问题在晚生季节尤为明显，某些棉花品种缺乏蜜腺。杂合植物与纯合无花蜜植物之间的差异可以通过数字成像轻松检测，因为杂合植物可能表现出小或减少的蜜腺，而纯合植物完全没有这一特征。从表型上看，花蜜的存在被归类为花蜜型（纯合/杂合且至少有一个显性基因），小或退化的花蜜属杂合，缺乏花蜜则为纯合无花蜜植物。数字图像评分减少了杂合植物作为无蜜植物的不准确评分。同样，当性状表达最充分时，更偏好中期开花阶段。因此，在此阶段采集了叶片和花朵样本，以进行表型评分实验，以准确可靠地评分花蜜性状。此外，利用数字显微镜可视化花蜜性状可以预防/减少无花蜜性状群体的假阳性。这种花蜜性状的表型评分也被用于定位研究，以识别与无花蜜性状相关的DNA标记，育种者可利用这些标记辅助选择（MAS）对无花蜜性状进行¹³.这种评分技术除了研究腺体、毛发和颜色等其他性状外，还可以推广到其他植物物种。总体而言，数字图像评分不仅通过提供高分辨率图像解决了花蜜性状评分不准确的问题，还能识别细微的表情变化，并将数字图像保存以备将来使用。具有无蜜性状的棉花可用于害虫生物防治，同时也可用于解答该性状如何促进有益昆虫互动的研究问题。

Protocol

1. 温室/田间叶片采样（见图1）

1. 准备带有样品ID的样品密封袋。样品袋在室温下保存，直到使用。
2. 采样前一天把冷藏箱放进冰箱。在冷藏箱底部放一个冰袋。在冷藏箱的冰袋上放一个塑料托盘。
   注意：任何便携式散热器都可以用于此目的。将冰袋放入冷藏箱，再放置塑料托盘（此分离防止样品直接接触冰块导致的结冰损坏），然后将冷藏箱运往样本采集点。
3. 将冷藏箱和标有标签的密封袋运送到温室/田地采集样本。计划定期喷洒田间植物以采集无害虫样本。同样，温室植物健康时也遵循定期喷洒和施肥计划。
4. 从单个8至12周龄的温室或田间棉花植株中采集幼叶组织，放入标注的样本袋中。
   1. 选择中期开花阶段进行样本选择，因为该阶段花蜜性状表现最高。从所有发育阶段的植物中挑选幼叶。除了遗传和环境的影响外，花蜜特征还受到发育阶段的影响。
   2. 为了保持发育阶段恒定以便_F2 种群中不同基因型的比较，应在某一阶段均匀采集叶片样本，以限制与该阶段的比较。以5到7厘米的叶片大小作为标尺，但所有样本都可以采集到相同大小的嫩叶。老叶表现出花蜜性状，但某些品系在发育后期不表现出花蜜性状。为避免这种差异并提高数据收集的一致性，采样时请遵循以下指示。
5. 采集叶片样本组织并放入相应的样本袋中。每个植物样本至少采集2片叶子。
6. 叶片中，从植物顶枝选择叶片宽5至7厘米的健康叶片。
   注意：所有样本都优先选择顶部枝条上的幼叶。这种样本采集不仅限制了抽样到特定的发育阶段，还通过保持样本类型恒定，减少了表型的误差。其他条件包括易于取用和叶片健康。当采集同一发育阶段的多片植物叶片时，将进行一致的数据比较，以识别种群中基于基因型的表型差异。
7. 将每个密封的样品袋和叶片组织放入冷藏箱。把冷藏箱运到实验室。
8. 将单个样品转移到冰箱中，以保持4°C的冷却条件。 将样本存放在冰箱中，直到花蜜的数字成像。叶片可保存长达2天用于数字成像，但更倾向于当天或次日拍摄。
9. 为了筛选大量叶片样本，应分批采集样本，以便在采收后1天内完成成像。以10-20个为一组收集样本，或使用多个冷却器以防止组织损伤或组织折叠。在收集优质数字图像时应格外谨慎。

2. 温室/田间花卉采样（见图1）

1. 按照步骤1.1到1.6作。从8到12周龄的温室或田间种植的棉花植物中采集花朵。每个植物样本至少采集2朵花。
   1. 通常在植物处于开花中期时，从顶部枝条采集花朵。花蜜性状在花期中期表现最为显著。
2. 采摘健康的花朵。将每个密封的样品袋中放入至少两朵花。把冷藏箱运到实验室。
3. 将单个样品转移到冰箱中，以保持4°C的冷却条件。 样本保存在冰箱中，直到对苞片蜜腺进行数字成像。
   1. 采样当天或次日处理样品。采集花样，保存在4°C，并当天处理苞片蜜腺。采集次日晚些时候或本周晚些时候开花的花朵，并当天进行苞片蜜腺的数字成像。

3. 数字显微镜初始设置（补充图1）

注意：其他类似显微镜可用于数字捕捉和存储图像。

1. 打开显微镜（VHX 600），完成初步步骤。放置一张半折的A4白色纸，大小与显微镜舞台相匹配。
2. 通过控制台控制器上的小灯旋钮调节显微镜平台/舞台上的光线。
3. 把控制台上的灯开关（小旋钮）调到最大以获得最大光线，把控制台上的大旋钮调到中高，方法是把控制台上的旋钮调到中高。
4. 内置的VHX 600软件在电脑屏幕上显示了调整镜头的选项。通过在屏幕上选择10倍镜头选项，将镜头调整为10倍放大。打开电脑前屏的显示器电源开关，主菜单会出现，显示镜头和录制图像的选项。
5. 从冰箱取少量样本（3到5个）放入冷藏箱进行数字成像。把装有样本的冷藏箱放在显微镜旁边。
6. 把砧板和无菌刀片放在靠近显微镜的台面上。从冷藏箱中取出一个样本，取出样本组织进行数字成像（见图1）。

4. 叶片花蜜的数字成像与评分（见图2）

1. 按照步骤1和3作。打开样品密封袋，把叶子样本放在砧板上。用无菌刀片切割叶柄。
   注意：为了安全使用刀片，请戴手套，刀刃锋利的边缘朝向手指，切口时组织夹在手指之间。
2. 将叶片组织转移到放置在舞台上的预先切割好的白色片上。将显微镜台中央的叶组织翻转，背面朝上。
3. 通过轻柔旋转显微镜旋钮的粗细调节，专注于叶片的中脉。继续调整，直到图像中没有模糊。
4. 由于蜜腺位于中脉下端，应将其置于中脉及后期脉分叉处的中心。保持叶子在舞台中央对焦。
   注意：家用棉花中仅观察到一个叶片蜜腺，而野生型则有三个蜜腺，分别位于脉脉中脉和脉脉两侧各一个（蜜腺总数 ：3）。
5. 调整显微镜的粗微和细微调节，以提升数字图像的清晰度。对所有图像进行调整，以捕捉并保存叶片的蜜腺图像。
   1. 为避免光线反射到数字图像上，请关闭所有灯光并将图像录制到电脑屏幕上。关闭房间所有灯光，使用台灯处理每个样品。完成所有步骤后，关闭灯，只开显微镜灯并记录图像。
6. 当程序提示显示多个保存选项的窗口时，保存图片。通过给每张图片做标签，并保存样本的ID号。根据花蜜的表型，将叶片花蜜的数字图像评分为1、2、3和4。更新每个样本ID的评分表。

5. 胸腺花蜜的数字成像与评分（图3）

1. 按照步骤2和3进行。转移少量花样（2-3枚）进行成像。把花样从密封袋里拿出来。
2. 用镊子或手动去除花朵上的苞片。把花放在干净的砧板上。用无菌刀片剪断花梗。用无菌刀片沿着切除的苞片边缘做一个直切口。
3. 将组织倒置（叶柄朝上）放在显微镜台上的预切白色片上。
4. 使用粗略和细微的调整来提升屏幕上显示图像的清晰度。完成所有图像调整，然后点击控制台手柄上的录制按钮捕捉叶子的图像。
   1. 通过将小旋钮/灯开关调到最大，把大旋钮/亮度开关调到中高（旋钮调到3/4^秒）来进行图像调整。然后，通过旋转显微镜的粗微和细微调节来提升图像分辨率。保持这些调整恒定，切换采样，直到录制完整采样集的图像。为避免光线反射到数字图像上，请关闭所有灯光并在电脑上录制图像。
5. 然后，程序会提示一个窗口，显示所有计算机位置以保存图片。将数字图像保存到电脑中，并保存样本的ID号。
6. 根据采集的数字图像中观察到的表型，将苞片蜜腺（补充图2）评分为1、2、3和4。更新评分表，包含样本编号和相应分数以便后续分析

Results

本研究选定了在田间种植8至12周的棉花植物。每种植物每种组织类型至少采集了两次技术重复。从叶片长5至7厘米的顶枝采集健康的幼叶样本。健康的花样通常取自当天开放的花朵或花苞。采集了来自不同植物品系的叶片和花朵样本，并在实验室使用显微镜生成了两种组织类型的数字图像（见图1）。从采样到影像检查，所有步骤均如上所述（如图2和图3所述）。叶片和苞片蜜腺的代表性结果通常显示无花蜜（1）、存在中间表型的花蜜（2、3），以及完全发育的花蜜产生花蜜（4）。图4中生成的数据是从两种不同的棉花植物（有花蜜和无花蜜）拍摄的数字图像。对叶片背面（中脉下侧）进行数字图像评分，显示有两种表型，评分为1（中脉无蜜腺）和4（完全发育的花蜜带花蜜;图4A，B）。同样，花样中对苞片花蜜的分析显示，显示两种表型：1（无花蜜）和4（完全成型的花蜜产生花蜜）;图4C，D）。理想情况下，同一株植物采集的叶子和花朵应遵循相同的模式，也就是说，无花蜜叶和花蜜花应属于同一株植物，而花蜜叶和花蜜花应属于同一株植物。图5通过收集花蜜植物叶片和苞片蜜腺的数字图像，分别以10倍、20倍和40倍分辨率绘制，清晰地可视化花蜜特征。此外，为了理解在_F2种群中花蜜与无花蜜棉亲本的分类方式，采集了其中一个群体的叶片组织，并为每个叶片花蜜样本制作了数字图像。对应标准格式评分1、2、3和4的选定叶片数字图像在图6¹³中高亮显示。常见且易于识别的模式是没有花蜜和有花蜜。缺乏蜜腺的评分最低，而完全发育的蜜腺则获得最高4分。1到4之间的评分范围为2、3，发育不全，且比普通花蜜小。这种模式可以在纯合无蜜腺（1个缺失）、杂合状态（如2和3个花蜜减少）以及4个（完全发育）蜜腺中观察到。此外，还可以与种群一起培育有花蜜和无花蜜的亲本，以比较和理解这些差异。

图1：从采样到数字显微镜的叶片和苞片蜜腺可视化步骤概述。 （A） 选择中期开花期棉花植物进行叶片和花朵样本采集。（B）采集叶片样本以观察叶片上的花蜜特征。（C）将叶片翻转，使叶片的背面朝上，观察高亮黑匣子区域的花蜜特征。（D）将叶片放置在显微镜台上，并将焦点保持在高亮的黑匣子区域，以便记录叶片蜜腺的数字图像。（E）在田间（A）采集中期开花期的花卉。（F）将花放在砧板上切开，并在白色方形区域沿箭头方向沿直线刻开，分开花根。（G）将切开切片放置在显微台上，用于对苞腺蜜腺进行数字成像。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：棉花叶片蜜腺的数字成像和评分步骤。 1. 从田间采集带有标签的样品袋中的叶片材料，放入冷藏箱中 2.把带样品的冷却器运到实验室3。从冷藏箱里取出单个样品。打开个人样品袋，取出第5片叶子。可以手动切割叶柄，或者用刀片锯。6. 将叶片放置在预设显微镜台上，背面朝上。在电脑屏幕VHX 600程序中将变焦调至10倍。调整显微镜的粗微和细微调校，以获得图像的最佳分辨率。8. 查看电脑屏幕，查看屏幕上观察到的图像的任何调整（通过旋转大小旋钮调节光线和亮度，使用显微镜上的细小和粗糙按钮以获得最佳图像分辨率，关闭其他灯光以消除反射等），如叶片花蜜9。把数字图像保存下来用于评分。在叶片中花蜜周围画划圈，突出显示第8和第9张图片中的花蜜区域。用显微镜观察叶片蜜腺，放大倍数为10倍（100微米）。家养棉花中仅观察到一片叶片蜜腺（如图所示）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：棉花苞片蜜腺的分步骤成像和评分程序。 1. 采集田间花样，放入标有标注的样品袋中，放入冷藏箱中保存 2.从冷藏箱取出一个样品3.去一朵花 4。手动切除苞片，将苞片剪离花朵5。使用无菌刀片沿苞片边缘沿直线切割（图 1 中白色方框，随后进行苞片灌蜜的数字成像）6.翻转刻画的第7节。将切开的叶柄面朝上放置显微镜8级台。使用连接显微镜的控制台上的光线和亮度开关进行光线调整。在显微镜上使用粗微和细微的微调，以收集高分辨率的图像。所有图像均在显微镜下以10倍（100微米）放大率观察。收集数字图像以给苞片蜜腺评分。在腕腺蜜腺的数字图像中，圆圈突出显示了花蜜的存在，家用棉花中有3个苞片蜜腺。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：棉叶花蜜和苞片花蜜的数字图像。 （A）带花蜜的叶片;（B）叶片无花蜜;（C）花朵有3个苞片蜜腺，（D）花朵无苞片蜜腺。用显微镜观察叶片和花朵蜜腺，放大倍率为10倍（100微米）。破折圈显示叶片蜜腺和苞片蜜腺中的有无。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：叶片和苞片蜜腺被放大至10倍、20倍和40倍，以便清晰识别数字图像中的蜜腺。 （A）采集叶片样本以观察中脉上的蜜腺特征。（B）在显微镜下以10倍放大观察叶片中脉上的蜜腺。（C）在显微镜下以20倍放大观察叶片中脉上的花蜜。（D）用显微镜观察叶片中脉上的蜜腺，放大40倍。（E）切开苞片花蜜。（F） 用显微镜观察10倍放大镜下的囊腺。（G）用显微镜观察20倍放大镜下的苞片蜜腺。（H） 用显微镜观察40倍放大的苞片蜜腺。每张图片上的比例条代表拍摄叶片蜜腺或苞片花蜜图像的放大倍率（此处显示为10倍、20倍和40倍）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：叶片花蜜的标准评分模式，遵循1、2、3和4的模式。 （A）无花蜜的叶片样本，如虚线圈所示（无花蜜得分1）。（B）观察到的小叶片花蜜显示出杂合子状态的模式（虚线花蜜图，评分为2）。（C）带有3分的叶片蜜腺，另一种杂合子的花样。（D） 完全成型的蜜腺，得分4。10倍比例表示拍摄图像的放大倍率。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：未使用显微镜拍摄的叶片蜜腺和苞片蜜腺。 图示描绘了花蜜与传统刻痕的外观。这个数字是从¹³个版本改编而来的。 请点击此处查看该图的放大版本。

图8：种群可能的基因型 图示了_F2 种群由多样亲本杂交产生的基因型，包括有花蜜和无花蜜。本表改编自¹³。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：数字显微镜装置。请点击这里下载此文件。

补充图2：观察到不同数量的苞片蜜腺。请点击此处下载此文件。

Discussion

蜜腺是专门的腺体毛体，能在植物中产生花蜜，促进成功的异花授粉。植物中既有营养腺，也有生殖蜜腺。棉花属（Gossypium genus）拥有50多个物种，其中大多数含有叶片蜜腺。然而，这一性状在棉花中也吸引了害虫，导致额外的产量损失¹⁷。育种者选择了最初在G. tomentosum发现的无蜜腺性状（无蜜腺）来解决这一问题。因此，他们将这种无花蜜特性引入了栽培的高地棉花¹⁷。最终，通过选择有花蜜和无花蜜的品系作为亲本，形成了若干种群。由于纯合无花蜜和杂合无花蜜种群肉眼观察时没有差异，因此需要专门的工具来区分这些植物。因此，这种数字显微镜评分方法，与传统评分（如图7所示）不同，不仅能显示减少的蜜腺，还能防止将杂合无蜜腺植物误判为纯合无蜜腺植物。

使用数字图像进行表型评分取决于多个关键因素，如样本采集的具体时间点、样本选择、叶片和苞片蜜腺的标准评分标准、可能的基因型，以及评分数据在后续应用中的解读。首先，重要的是在生长季节采集叶片和花朵，此时蜜腺分泌物最高，通常在七月花期中期。其次，选择大小和阶段合适的叶子或花朵在表型评分中起关键作用。叶片顶部带有5至7厘米长叶片的枝条被优先用于叶片的刻痕。同样，在划分苞片花蜜时，选择了顶部枝条的健康花朵。即使在排除发育阶段依赖性状表达（如 图8所示）比较同一种群中所有植物时，选择特定发育阶段的样本也会有所帮助。为了验证评分是否可重复，每株每株至少为每组织生成两个样本的数字图像。收集同一株植物的多次复制有助于数据收集的一致性。

该方法可能的限制是必须保持无害植物直到采样。害虫侵扰区域可以通过组织中产下的组织斑块或卵斑，或因蚜虫或其他昆虫食用而导致的花蜜区域出现黑色区域，但没有明显的花蜜。在筛选数百个样本时观察到了这一点。在这种情况下，会重新采集健康的叶片和花朵，并分析样本中的数据一致性。通过定期进行害虫防治计划和补充肥料，可以实现植物健康。遵循所有关键步骤有助于表型评分的排查。

该技术有多种应用，例如定位以识别DNA标记，帮助育种者识别基因型以辅助标记选择。由于环境和发育阶段的影响，以及控制该性状的基因，这种表型评分需要DNA标记来确认。因此，利用数字显微镜对该性状进行表型分析，将是从多个群体中缩小大量植物至少数疑似无蜜菌系的起点。利用DNA标记，这些系系进一步验证可用于育种项目，以开发新培育品种中无蜜性状介导的抗病能力。这种方法还能帮助研究人员理解花蜜性状在植物中的作用以及与昆虫的有益相互作用。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
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