基于人类ASC生物制造的生物标准化，适用于可复制的宏观组织构造

摘要

本研究展示了一种可重复的生物制造工作流程，利用脂肪来源的干细胞球体和3D打印的GelMA支架。它展示了空间控制、融合能力和质量控制指标，从而产生了具有再生医学潜在应用潜力的可移植宏观组织构造。

摘要

实验室间缺乏标准化协议，是实验结果可比性和生物制造技术高效转移的重大障碍。严格的生物标准化不仅提升了可重复性，还促进了与国家和国际监管框架的一致性，而这些框架对于组织工程策略的临床转化至关重要。本研究引入了标准化的生物制造工作流程，包括hADSC的单层培养、球状体形成、明胶甲基丙烯酰（GelMA）支架的3D打印以及球状生物组装。质量控制指标被整合以确保可重复性。3D打印的GelMA脚手架设计有两个中央孔，每个孔洞可容纳数百个球体。通过将脚手架尺寸与CAD模型进行比较，确认了印刷精度，存在轻微且不显著的偏差。hADSC 在琼脂糖微模中24小时内形成均匀球体。球体被播种到脚手架孔隙中，连续融合72小时，形成宏观构造，通过共聚焦成像确认。脚手架设计和印刷精度确保了结构支撑，而球形均匀性则使结构的形成变得可预测。球体在支架孔隙内融合，产生了适合移植的组织构造，无论有无支架，凸显了这种生物组装方法的多功能性。研究结果强调了生物标准化在推进可重复的活体组织构造方法学中的关键作用，并为未来再生医学的临床应用带来积极影响。

引言

生物组装和生物印刷是组织工程中的互补生物制造方法，专注于利用自动化技术在宏观尺度上构建复杂的组织和器官（1,2,3,4）。

球体被纳入生物制造中，主要作为生物组装方法的构建^模块。球体被认为是在体内复制细胞与周围组织微环境相互作用的微组织。在用于球状形成的细胞来源中，脂肪来源干细胞（ADSC）因其易于分离、长期培养维持和分^{化潜力6,7,8}而脱颖而出。

由于球体本身具有形成更大聚集体的能力，经过生物组装方法后，可以生成更复杂的组织构造。这种融合驱动的组织增强了干细胞球体的再生和分化潜力 ^9,10。

球形生物组装可以由^{生物材料支持}甚至引导，使该策略适合可扩展和自动化的生物制造^12,13。

现有的生物制造策略大致可分为无支架球状组装方法和水凝胶嵌入生物^{打印系统2,5,14}。无支架方法完全依赖自发细胞自组装和球体间融合，利用细胞间的内在相互作用。然而，由于这些方法没有外部建筑指导或几何约束，空间控制较弱，结构可预测性较低 ^5,15。相比之下，基于水凝胶的封装方法将细胞嵌入大块基质中，提供结构支持和预定义的结构^16,17，这可能在早期融合阶段部分限制细胞间直接接触，并影响细胞迁移动力学¹⁸。在此框架下，可打印的生物材料如明胶甲基丙烯酰（GelMA）呈现细胞粘附基序，并可能作为支架促进球状生物组装。假设一个3D打印的GelMA支架能够为球体提供几何约束和空间引导，从而通过融合形成更大、结构明确的构造来促进受控组织形成。该方法旨在通过结合支架引导组织与定义水凝胶结构内球状融合，提升球状生物组装过程中的空间控制和结构重复性。然而，当前的工作流程侧重于工艺标准化和结构生物制造参数，未涵盖长期组织成熟、功能分化或大规模自动化生产。

生物标准化不仅对确保可重复性和可扩展性至关重要，还对保护生物制造组织的功能完整性至关重要^19,20。因此，对工程、几何和结构参数的精确控制至关重要，因为这些因素直接影响生物表现，包括组织功能和成熟度^5,21。本书呈现了一个标准化且可重复的生物制造工作流程，包含以下关键步骤：（1）ASC单层培养;（2）ASC球状体形成;（3）GelMA支架的3D打印;以及（4）球形生物组装（见图1）。在这一工作流程中，建立了客观的质量控制指标，包括球形均匀性和球状度、印刷精度以及脚手架形状完整性。

方案

试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 琼脂糖微模制备及GelMA 3D打印支架的制造

1. 2%琼脂糖微模在0.9%氯化钠（NaCl）溶液中生产（见 图2A）
   注意：所有化学废弃物必须按照机构化学品安全法规和危险废物指南进行处理和处置。
   1. 在超纯水中制备0.9%氯化钠溶液，并在121°C高压灭菌30分钟。 使用前应保持无菌状态。
   2. 将1克无菌超纯琼脂糖稀释于50毫升0.9%氯化钠溶液中。在微波中以10秒间隔均匀并去聚合琼脂糖，持续3–5个周期，直到完全溶解。
   3. 在生物安全柜中，将一个商业化的硅胶模具放置，该模具有81个圆形凹槽，安装在无菌纱布上。
   4. 小心地将600微升琼脂糖沉积在硅胶模具中心，静置40分钟以确保完全聚合。
   5. 小心脱模完全聚合的琼脂糖微模，并将其转移到12孔微量滴定板的槽中。
   6. 调整琼脂糖微模的位置，并注入600微升琼脂糖将其固定在井底。
   7. 通过用Dulbecco改良Eagle中低葡萄糖（DMEM，2毫升/孔）培养15分钟进行微型预孵育。重复此过程两次，第三次潜伏时更换为三维（3D）培养基，培养基由DMEM补充抗坏血酸（50 μg/mL）、人类血清白蛋白（1.25 μg/mL）、青霉素-链霉素（PS，1×，100×液液）和ITS补充剂（1×，100×液液）组成。
      注意：三维培养基与单层扩增培养基不同，不使用胎儿牛血清（FBS），并包含促进细胞间相互作用和细胞外基质支持的特定补充剂，有利于球体的自组装和稳定。如果模具生产和细胞镀层分别在不同天进行，程序可在第二次DMEM孵育后暂停，模具应在37°C的加湿培养箱中无菌保存，保存时间最长可达5天。第三次用3D培养基孵育必须在装盘当天进行。在播种细胞前，先完全移除培养基，同时清除井和微型模具中的培养基。
2. 明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶的制备
   注意：整个过程应在黑暗中进行，因为试剂具有光敏感性。本研究使用了GelMA（凝胶强度300克Bloom，取代度60%）和光启动剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰膦酸盐（LAP）。制备10毫升含0.5% w/v LAP的10% w/v GelMA溶液：
   1. 将50 mg LAP粉末溶解于1 mL DMEM中，轻柔混合，直到得到透明均匀的溶液。
   2. 将LAP溶液转移到装有9毫升DMEM的离心管中，彻底混合。
   3. 在生物安全柜中，通过0.22微米过滤器过滤所得溶液进行灭菌。
   4. 向溶液中加入1克GelMA，并在50°C下用磁搅拌均匀，约3小时，直到得到透明均匀的溶液。将烧瓶举到光线下，确保溶液无可见颗粒和浊度。
   5. 将所得水凝胶装入10毫升注射器进行后续打印，若未立即使用，则保存在2–8°C，避免光照，直至使用。
      注：GelMA和LAP溶液在制备后约24小时使用。不建议长期储存此溶液。GelMA和LAP粉末均应根据制造商说明在2–8°C下储存。LAP光启动器根据ABNT NBR 14725和欧盟法规第1272/2008号被归类为非危险。然而，制造商建议使用个人防护装备以防止呼吸系统、皮肤和眼睛刺激。建议使用符合相关政府标准（如美国国家职业安全与健康研究所NIOSH）或欧盟EN 166的安全眼镜，以及厚度至少0.11毫米的丁腈橡胶手套。只有在产生尘埃时才需要呼吸防护。制造商关于使用过滤器进行呼吸保护的建议，基于DIN EN 143、DIN EN 14387以及其他与所用特定呼吸防护系统相关的补充标准。制造商建议使用P1型滤网。
3. 3D模型设计、切片与生成G代码文件
   注：该3D脚手架模型使用在线3D计算机辅助设计（CAD）软件Tinkercad设计。该方案生成了一个直径15毫米、底部厚度1毫米、两个直径5.50毫米、深度2毫米的圆柱形支架。
   1. 3D模型设计完成后，导出为*.stl文件（补充文件1）。
   2. 打开 Repetier-Host V2.3.2 软件，用于切割设计模型。
   3. 在“切片器”标签中，选择所需的切片器选项。本研究中使用了 CuraEngine 。
   4. 配置合适的参数配置文件。在这项工作中，速度为10毫米/秒;层高0.2毫米;填充模式：网格;喷嘴直径为0.41毫米。
   5. 加载要打印的3D模型的*.stl文件。
   6. 在“切片器”标签中，选择之前创建的配置。
   7. 点击“用CuraEngine切片”。切片后的3D模型将在软件界面中进行可视化。
   8. 点击“保存到文件”，将G代码文件保存到指定位置。
4. 明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶支架的3D打印，用于球体生物组装
   注意：3D打印必须在无菌条件下进行。因此，在开始打印过程前，请检查打印机所在的生物安全柜是否已开启，且气流正常。确认橱柜保护玻璃的高度与设备传感器标记高度一致。
   1. 取下生物打印机的安全锁。
   2. 通过松开金属夹子，将玻璃版从打印床上取下。
   3. 通过金属夹固定形状合适的丙烯导轨，支持培养板固定在打印平台上。
   4. 把打印机连接到电源上。请注意，该设备支持双电压（110/220 V）。
   5. 把打印机的USB线连接到电脑上。
   6. 按下 开关 按钮即可开机。
   7. 打开 Repetier-Host V2.3.2软件，用于查看3D模型并打印。
   8. 点击软件界面中的“连接”选项。
   9. 使用软件手动控制，选择挤出机（1或2），并将打印头送至归位位置（X = 0，Y = 0，Z = 0）。
   10. 使用Repetier手动控制中的相应工具调整所选挤出机以正确安装注射器。
   11. 小心地将注射器插入已装满水凝胶并连接挤出喷嘴的挤出机（本研究中使用的内径0.41毫米的锥形聚丙烯喷嘴）。
   12. 把培养版装进连接打印床的丙烯导轨里。
   13. 使用位于生物打印机左侧的Z端止螺丝调整Z定位（Z=0）。也就是说，设定挤出喷嘴与打印表面之间的期望距离。理想情况下，喷嘴应轻轻接触基底，本研究中基底即培养板。
   14. 将打印头恢复到主位置。
   15. 加载之前生成的G代码文件。
   16. 使用软件中相应的手动控制工具，将部分水凝胶从注射器中挤出，确保材料通过喷嘴。
   17. 开始打印流程。
   18. 打印完成后，使用配备两个395-400纳米LED的3D生物打印机紫外光系统对支架进行光交联。将脚手架暴露在紫外线下5分钟（光强为20 mW/cm^²）。
   19. 使用与微模制造相同的去聚合、2%琼脂糖溶液，将3D打印支架连接到12孔培养板的孔上。将支架固定在井底是必要的，以提供更高的稳定性，并防止球形播种过程中及整个培养过程中的位移。
       注意：执行步骤4.16时，检查水凝胶在挤出过程中是否形成连续的丝状。通常，明胶溶液在液态（约37°C）时装入注射器。在室温（22–25°C）下几分钟内，这种生物材料开始转变为凝胶状质地。材料在挤出过程中不应滴落，否则会影响打印质量。挤出过程中连续形成丝状表示水凝胶已达到打印的最佳稠度。在DMEM中稀释的GelMA和LAP溶液呈现出略带橙色的颜色。紫外线诱导的光交联后，常见颜色变化，材料变白或半透明，如图3D，E所示。操作紫外线系统时，必须佩戴安全眼镜，以确保对紫外线的充分保护。
5. 印刷精度分析
   注：GelMA脚手架的3D打印保真度分析考虑了脚手架直径、孔径和脚手架厚度等参数。测量使用了ImageJ 1.54版软件。
   1. 首先，拍摄立体显微镜观察的脚手架图像。用尺子或卡尺作为参考。
   2. 在分析图像之前，先校准并在ImageJ中设置刻度以进行测量。
   3. 使用直线工具进行测量。
   4. 由于脚手架和孔径形状都是圆形的，统计分析时使用脚手架和孔径的算术均值。
   5. 对于打印精度分析，可以比较ImageJ从打印支架获得的测量值与Tinkercad生成的3D模型中定义的数值。
      注：测量的打印脚手架厚度与Tinkercad中孔深和底部厚度的总和进行了比较。
   6. 对获得的数据进行统计分析。在这种情况下，为了比较测量的支架值与预期值，可以使用Mann-Whitney U检验（非参数）。Shapiro-Wilk检验用于评估正常性。当p<0.05时，差异被视为统计学上显著。

2. hADSCS的制备与球状体形成

注意： 商业化的人类脂肪来源间充质干细胞（hADSC）在细胞特异性培养基中培养，并按照制造商建议以80%–90%的融合度传代。该方案使用细胞直到第7代。所有生物废弃物必须在处置前进行适当去污或消毒，并按照机构生物安全指南进行处理。在后续共聚焦可视化中，单分子层应在球状形成前用荧光染料标记并按照制造商建议进行培养。标记后30分钟即可开始球状形成。

1. ASC单层的胰蛋白酶化
   1. 在生物安全柜中，打开培养瓶，将其内容物转移到废物容器中。
   2. 用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤单层两遍，然后丢弃溶液。
   3. 加入0.125%的胰蛋白酶/EDTA溶液，足以覆盖单分子层。盖上瓶盖，放入加湿培养箱，温度为37°C，孵育时间最长5分钟。
   4. 通过加入等量的DMEM，并补充10%胎儿牛血清（FBS），使胰蛋白酶/EDTA失活。
   5. 使用血清学移液器收集细胞悬浮液，或转移到离心管中。在室温（20–25°C）下，离心机温度为400 x g ，持续5分钟。
   6. 小心地丢弃上清液。
   7. 将细胞沉淀重新悬浮在DMEM中并均质化。做细胞计数和存活能力评估的分价。
2. 球状体培养（见 图2B）
   1. 将每个模具所需电镀的适当数量细胞分离到15毫升离心管中。对于hADSC，每个含有81个凹槽的琼脂糖模具应配备1×10个⁶ 个细胞——每个微孔中形成一个球状体，每个微模可产出81个球状体。
   2. 加入1×PBS，在室温下以500 x g 离心5分钟。丢弃上清液，加入1×PBS。重复这一步两次。
   3. 第三次离心后，小心地丢弃上清液，并用无菌纱布擦干管口，然后将其恢复至垂直位置。
   4. 将细胞沉淀重新悬浮于120微升的3D培养基中进行球状培养并均质化。如有需要，将悬浮液量调整至200微升，并加装额外的3D培养基。
      注：每个有81次切割的模具容量为200微升。
   5. 吸入200微升，并小心地在模具中心镀层，避免气泡形成。
      注意：这一步骤可以通过机器人移液系统实现自动化，如前述²²。
   6. 将平板放在生物安全柜中5分钟，让细胞在切除部位沉淀。
   7. 将盘子放入加湿孵化器中40分钟。
   8. 此阶段结束后，小心地向每个凹槽加入2毫升3D培养基。将盘子放回加湿培养箱，温度为37°C。
3. 球体测量与统计分析
   1. 使用配备数码相机和10×物镜的倒置光学显微镜，捕捉琼脂糖微模两条对角线排列的球体形成“X”图案的图像。在测量直径之前，使用100微米比例条校准图像比例。
   2. 为了确定球体的主要和次要直径，使用软件的“线”工具，对每个被拍摄的球体进行两次垂直测量，且它们之间大约有90°角。
   3. 计算每个球体的平均直径，即之前测量的两个垂直直径的算术平均值。将球面度计算为每个球体最大与最小直径的比值，越接近1表示更均匀且球形更接近。
   4. 利用获得的直径和球面度数值进行统计分析。

3. 在GelMA支架上播种球体以实现球状融合和生物组装

1. 球状形成24小时后，使用宽口径移液器从琼脂糖微模中采集，转移到2毫升微管中。
2. 当球体沉积在微管底部时，丢弃上清液。
3. 将球体重新吊浮在50微升的三维介质中。
4. 使用带宽口径的移液器收集球体，并轻柔地嵌入GelMA支架孔隙中。
   注意：在直径约5.50毫米、深度约2毫米的GelMA支撑孔中，在50微升中播种约480至640个球体（对应6至8个琼脂糖微模，每个模型产生81个直径200至400微米的球体）。该估计基于孔隙体积和球体平均直径，量化通过转移的完整微型数量而非单个球体计数，确保了孔隙内球体密度的实用且可重复的估计。
5. 将球体沉积到GelMA支撑孔隙后，等待20至40分钟让球体沉降。每个孔中加入1毫升三维培养基。
6. 24小时后，向每个孔中加入1毫升3D培养基。
7. 通过相差显微镜和立体显微镜监测GelMA支架孔隙中球体的融合情况。从第0天（播种后立即）到第3天（72小时）每24小时采集一次图像。
8. 在72小时后，将生物结构定型于4%对甲醛中，通过共聚焦显微镜进行可视化。由于防腐甲醛有毒和刺激性质，应使用认证的化学排气罩处理，使用适当的个人防护装备（实验服、手套和护目镜），并按照机构化学品安全指南处理废弃物。为了共軛观察，细胞应在单层中用荧光染料预先标记，然后形成球状体。
   注意：如果需要从GelMA孔隙中取出构造物进行 分析或体内 应用，请用精密镊子或合适尺寸的活检冲头仔细取出。

结果

人类脂肪来源干细胞（hASCs）在单层中培养（见图2C），在播种后24小时内成功诱导形成球状体（见图2D）。由此形成的球体呈现出紧凑且明确的形态特征。形态测量分析显示，24小时时平均直径为239.8微米±87.0微米（图2E），球面度值接近1（0.947±0.123）（图2F），表明球体均匀且对称。

3D打印脚手架的CAD模型设计有两个孔，约占脚手架总直径的三分之一（见图3A、B）。模型被切片，生成相应的G代码。生成 G 码文件后，可以加载到打印软件 Repetier Host 中，并可将切片后的 3D 模型可视化（见图 3C）。GelMA水凝胶支架成功打印（图3D、E<...

讨论

本研究结果凸显了将质量控制指标成功整合进标准化生物制造工作流程，确保可重复性。基于预设设计的3D打印脚手架为球形生物组装提供结构支撑^19,23。作为概念验证，设计了一个坚固的支架，中间有两个多孔区域，尺寸设计以支持高密度球体载荷和导向生物组装。

作为首个质量控制检查点，球状体测量在播种到基于GelMA的3D打印支架前进行了评估。利用琼脂糖微模压水凝胶，24小时后生成均匀球体（见图2D）。形态测量分析显示直径一致且球面度较高（图2E，F）。这些参数在生物制造中对估算最终构造尺寸至关重要，用于计算3D打印支架每个孔所需的球体^数量5。

印刷参数最初基于...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Prepared in the laboratory		-
593iCAN 3D Bioprinter, Model 593 iCan2X Printhead	593iCAN	-	-
Agarose	Sigma-Aldrich	16500-500	-
Ascorbic Acid	Sigma-Aldrich	A4544-100MG	-
Carl Zeiss Microscopy GmbH Primovert	Zeiss	-	415510-1101-000
Celldiscover	Zeiss	-	LSM 900 with Airyscan 2
Celltracker	Invitrogen	C7025	-
Centrifuge	Eppendorf	-	5702
Class II Biological Safety Cabinet	Streamline	-	Model SC2-4E3
CO2 incubator for cell culture	Thermo Fisher Scientific	-	Series 8000 WJ
Conical polypropylene nozzle 0.41 mm	593iCAN	-	-
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Low Glucose	Sigma-Aldrich	D2902-10L	-
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	-
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	12657-029	-
Gelatin methacryloyl gel strength 300 g Bloom, degree of substitution 60%	Sigma-Aldrich	900622	Lot/Batch number: MKCS2673. Documentation for each batch, including the Safety Data Sheet (SDS) and the Certificate of Analysis (CoA), can be obtained from the manufacturer’s website.
GraphPad Prism 6.0 software	GraphPad Inc	-	-
Hot plate magnetic stirrer	IKA	Z671797	Model C-MAG HS7
Human serum albumin 100 mg/ml	FUJIFILM Irvine Scientific	9988	-
ITS (Insulin-transferrin-sodium selenite) supplement 100x	Sigma-Aldrich	I3146-5ML	-
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP)	Sigma-Aldrich	900889
Luxoeo 4Z Stereozoom Microscope	Labomed	-	-
MicroTissues® 3D Petri Dish® micro-mold spheroids	Sigma-Aldrich	Z764019	-
Penicillin-streptomycin 100x	Sigma-Aldrich	15140122	-
Poietics™ human adipose derived stem cells (ADSC)	Lonza	PT-5006
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	71382-500G	-
Trypsin/EDTA	Gibco	27250018	-