从小鼠角膜获取单细胞悬液的实验方案

摘要

本文介绍一种通过胶原酶A和胰蛋白酶序贯消化从小鼠完整角膜获取高质量单细胞悬液的实验方案。该方法获得的单细胞具有较高的RNA完整性和活性，适用于单细胞RNA测序和流式细胞术等下游应用。y.

摘要

角膜作为眼球的最外层，在维持眼表稳态和视觉功能中起着关键作用。近年来，单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的进步使得对角膜细胞异质性进行高分辨率分析成为可能，然而由于角膜组织结构致密且复杂，制备高质量的单细胞悬液仍然具有挑战性。本研究建立了一种从完整小鼠角膜制备单细胞悬液的可靠方案。该方法包括将角膜切成细小组织碎片，随后使用胶原酶A和胰蛋白酶进行连续的酶消化处理。通过多种指标对所得细胞悬液的质量进行评估：采用台盼蓝染色检测细胞活力并进行细胞计数；通过泛角蛋白（Pancytokeratin）和角膜蛋白多糖（Keratocan）的免疫荧光染色实现主要角膜细胞类型的鉴定与定量；并利用生物分析仪验证RNA的完整性。该方案能够稳定地获得大量细胞，细胞活力优异（≥94.6%），单细胞比例高（96.3%），完全满足包括单细胞RNA测序在内的高要求下游应用的需求。

引言

角膜位于眼球最外层，因其高度有序的五层结构——上皮层、前弹力层、基质层、后弹力膜和内皮层，而具有重要的屏障功能和屈光功能¹。角膜上皮为非角化的复层鳞状结构，可提供抵御外界病原体的物理屏障，并具有强大的抗菌能力和再生能力。基质层由精确排列的胶原纤维组成，维持角膜的透明性及均匀的折射率²。内皮层为单层细胞结构，调控基质层与房水之间的液体转运，从而维持角膜的水分平衡和营养供应³。然而，这种复杂的结构与细胞组成在历史上长期对研究角膜的生物学功能及其潜在机制构成重大挑战⁴。

为了研究细胞间相互作用并鉴定特定细胞类型的标志物，常采用流式细胞术分选⁵和单细胞RNA测序（scRNA-seq）⁶等技术。然而，这两种方法共同面临的主要技术难题是高质量单细胞悬液的制备。总细胞得率、单细胞比例以及细胞活力等参数对于后续分析角膜细胞功能和表面标志物表达的可靠性至关重要⁷。尽管该步骤极为重要，目前仍缺乏从完整小鼠角膜制备单细胞悬液的标准化且高效的实验方案。

已有多种方法用于从角膜组织中获得单细胞悬液。通过胶原酶A、胰蛋白酶或TrypLE进行连续的酶消化已被用于分离人和小鼠角膜的单个细胞⁸。重复的胰蛋白酶消化也已被用于角膜组织解离⁷。此外，商业化的多组织解离试剂盒（如Miltenyi Biotec的产品）已成功应用于制备角膜单细胞悬液⁹。在我们之前对不同角膜消化方法的比较研究中，我们证明了胶原酶与胰蛋白酶的序贯处理是最优方案。该方法能够稳定地获得高数量的细胞、优异的细胞活力（≥94.6%）、高比例的单细胞（96.3%）以及良好保存的RNA完整性¹⁰。

在本实验方案中，我们基于已有的经验与前期研究结果，提供了一种利用优化的酶消化方法从完整小鼠角膜制备高质量单细胞悬液的详细、逐步操作流程。

方案

雌性C57BL/6（B6）小鼠，6至8周龄，由贵州医科大学实验动物中心提供。动物饲养环境保持12小时光照/12小时黑暗循环， 随意摄取 可自由获取食物和水。所有实验程序均经贵州医科大学实验动物伦理委员会批准（批准号：2305185），并遵循ARVO关于眼科与视觉研究中动物使用声明的规定执行。

1. 准备

1. 手术器械的准备：使用双蒸水（DDW）冲洗两对眼科剪、两对眼科镊、一对组织镊以及一个2 mL离心管，各冲洗两次。使用蒸汽高压灭菌器对器械和离心管进行灭菌处理。随后在65 °C的常规烘箱中过夜干燥所有物品。
2. 溶液配制
   1. 补充激素的上皮细胞培养基（SHEM）：通过向DMEM/F12培养基中添加以下成分来配制SHEM：5%（v/v）胎牛血清（FBS）、0.5%（v/v）二甲基亚砜（DMSO）、10 ng/mL小鼠表皮生长因子、5.5 µg/mL转铁蛋白、0.5 µg/mL氢化可的松、1%（v/v）青霉素-链霉素溶液（含100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）。
      ​注意：SHEM用于处理过程中维持细胞活性。可替换为其他培养基，例如基础DMEM或含至少10%（v/v）FBS的磷酸盐缓冲液（PBS）。
   2. 磷酸盐缓冲液（PBS）
      1. 将22.4 g PBS粉末溶于2 L双蒸水（DDW）中，使用磁力搅拌器持续搅拌，得到1× PBS溶液。
      2. 提前一天对PBS溶液进行高压灭菌，并使其冷却至室温。
      3. 在无菌条件下，将47.5 mL无菌1× PBS转移至50 mL离心管中，加入2.5 mL 1%（v/v）青霉素-链霉素溶液。
         注意：1× PBS配方（2 L）包含137 mM NaCl、8 mM Na₂HPO₄、2 mM NaH₂PO₄，pH值为7.2。
   3. 胶原酶A溶液
      1. 储备液：将1 g胶原酶A粉末溶于40 mL双蒸水中，经0.2 µm滤膜过滤除菌后，于-20 °C保存。
      2. 工作液：取1 mL胶原酶A储备液，加入4 mL无菌双蒸水稀释，终浓度为5 mg/mL。
   4. 胰蛋白酶溶液：使用前将市售的0.25%（w/v）胰蛋白酶/EDTA溶液（含0.91 mM EDTA）置于冰上解冻。
   5. 台盼蓝溶液（0.4%）：将0.4 g台盼蓝溶于100 mL双蒸水中，用滤纸过滤后于4 °C保存。
      注意：0.4%台盼蓝溶液用于评估总细胞数、单细胞比例及细胞活力。也可使用商业化的活/死细胞染色试剂盒或自动细胞计数系统替代。

2. 小鼠角膜的制备

1. 使用75%乙醇擦拭解剖显微镜和操作区域进行消毒，然后在生物安全柜内用紫外灯照射30分钟。
2. 在无菌条件下准备以下物品：一个60 mm培养皿，内含5 mL SHEM培养基；三个60 mm培养皿，每个含5 mL添加5%青霉素-链霉素（P-S）的1× PBS；三个60 mm培养皿，每个含5 mL普通1× PBS；以及一个无菌的2 mL离心管。
3. 采用CO₂窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。
4. 将小鼠头部及闭合的眼睑浸入含5% P-S的PBS中，反复冲洗三次，然后进行眼球摘除。
5. 使用眼科剪在每只眼球的后极部做切口，小心将分离的眼球放入含有冰上预冷SHEM培养基的培养皿中（图1A）。
   注意：为最大限度保持细胞活性，所有溶液应预先冷却至4 °C，所有解剖步骤均需在冰上进行。
6. 立即将装有眼球的培养皿转移至生物安全柜中，用含5% P-S的1× PBS清洗眼球三次，每次孵育5分钟。
7. 在解剖显微镜下小心分离角膜组织：使用眼科剪和镊子，从眼球后极向角膜缘做切口，沿角膜缘边界轻轻将角膜从巩膜和结膜上剥离。使用两把镊子彻底移除晶状体和虹膜（图1B）。
8. 使用眼科镊将角膜组织转移至含有1× PBS的培养皿中，清洗三次（每次5分钟），以去除任何残留的非角膜组织和抗生素。
   注意：虹膜常紧密附着于角膜，应使用镊子轻柔且彻底地去除，避免污染，仅保留透明的角膜组织。
9. 使用眼科镊将清洗后的角膜组织转移至2 mL离心管中，并加入1 mL胶原酶A工作液（5 mg/mL）。
10. 使用眼科剪在离心管内将角膜组织剪切成约0.5 mm × 0.5 mm的碎片。
11. 将含有角膜碎片和胶原酶A溶液的离心管置于细胞培养箱中，在37 °C孵育1小时（图2A-C）。
12. 在胶原酶A消化过程中，每10分钟观察一次组织状态。当无大块组织残留时，立即终止消化并进行离心。在室温下以300 x g离心5分钟，小心吸弃上清液。
13. 用200 µL 0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液重悬沉淀。
14. 将离心管置于细胞培养箱中，在37 °C孵育10分钟，以消化残留的组织碎片。

3. 角膜单细胞的分离

1. 使用带宽口吸头的 P1000 移液器反复轻柔吹打混合物（组织和胰蛋白酶/EDTA 溶液），以将组织解离成单细胞悬液。
2. 将细胞悬液在 300 x g 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。用含有 0.04% 牛血清白蛋白（BSA）的 1 mL PBS 重悬细胞沉淀，获得单细胞悬液。
   注意：对于拟用于测序或流式细胞术的细胞，应使用无血清的 PBS 重悬。对于将用于培养的细胞，应使用添加了 0.04% BSA 的 1x PBS。
3. 将细胞悬液通过预先润湿的 40 µm 细胞滤网过滤至新的 50 mL 离心管中，以去除细胞团块和碎片。
   注意：使用 PBS 预先润湿细胞滤网以尽量减少细胞损失。如有需要，可将过滤后的细胞再次离心，并重悬于所需体积中以调整浓度。

4. 细胞计数

1. 将9 µL细胞悬液与1 µL 0.4%台盼蓝溶液混合，轻轻混匀。
2. 缓慢将混合液加入血细胞计数板的计数室中 通过 指定的上样通道。采用四象限法对细胞进行计数，以确定总细胞数、活率及单细胞比例。至少进行两次技术重复。

结果

单细胞悬液的质量根据总细胞得率、单细胞比例和细胞活力进行评估。使用台盼蓝对悬液染色，并通过相差显微镜在多个视野下进行分析（图3）。从四只小鼠眼球（八只角膜）中共获得1.05 × 10⁵个细胞，平均细胞活力为94.6%，单细胞比例超过96.3%。这些结果表明，所制备的细胞悬液适用于流式细胞分选和单细胞RNA测序等后续应用。

为了确定悬浮液中上皮细胞、基质细胞和内皮细胞的比例组成，使用上皮细胞标志物广谱细胞角蛋白（Pan-CK）和基质细胞标志物角蛋白聚糖（keratocan）⁸ 进行免疫荧光染色。Pan-CK阳性细胞被归类为上皮细胞，keratocan阳性细胞为基质细胞，而两种标志物均为阴性的细胞则被认定为内皮细胞或其他细胞类型⁸。通过该方法分析，所得细胞群体包含83.5%的Pan-CK⁺上皮细胞、13.5%的keratocan⁺基质细胞，以及约3%的Pan-CK⁻/keratocan^-细...

讨论

单细胞RNA测序技术的引入显著提升了基因组学、转录组学、表观遗传学和蛋白质组学技术在眼科研究中的应用^9,10,11,12。因此，制备高质量的单细胞悬液变得愈发关键，因为它能够检测单个细胞之间的信号差异，并更深入地揭示细胞异质性，而这些优势是传统的整体基因表达谱分析所无法提供的^13,14。以往的研究通常依赖胰蛋白酶/EDTA来解离纯化的上皮细胞和内皮细胞^15,16。然而，由于角膜基质具有致密的胶原结构，需使用胶原酶进行温和消化，才能有效释放单个细胞。因此，精确控制酶消化时间对于获得具有活性且具代表性的单细胞悬液至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alexa Fluor 594 驴抗兔	Abcam	ab150064
抗角蛋白	Abcam	ab230175
抗全角蛋白	赛默飞世尔科技	AE1/AE3，Alexa Fluor™ 488
高压灭菌器	An Shen	LDZH-100KBS
牛血清白蛋白 V	Solarbio	A8020
细胞滤器	NEST	258369	40 μm
离心机	Eppendorf AG	22331 汉堡
胶原酶A	罗氏	10103578001
共聚焦显微镜	奥伯科亨	Zeiss LSM 880
计数板	MARIENFELD	M407859
离心管	NEST	620611	2 mL，50 mL
盖玻片	MARIENFELD	M407859
DAPI	Solarbio	C0065
解剖显微镜	卡尔·蔡司	VISU150
DMEM/F12  培养基	Gibco	11320033
DMSO	Solarbio	D8371
胎儿  牛  血清	Gibco	16140071
氢化可的松	Solarbio	IH0100
ITS	Gibco	23337619
小鼠表皮生长因子	Invitrogen	PMG8041
眼科手术  镊子	Dumot	0208-5-PO
眼科手术剪	FST	15021-15
烘箱	AISITE	DH6000 II
青霉素 &链霉素	Gibco	15070063	100 mL
培养皿	NEST	705201	60 mm
磷酸盐缓冲液	Solarbio	P1010
恒温培养箱	赛默飞世尔科技	3111
Triton-X 100	Solarbio	T8200
台盼蓝	Solarbio	T8070
胰蛋白酶/EDTA	Gibco	R001100
超净工作台	You Qi	VS-840-2
4% 多聚甲醛	Solarbio	P1110