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方法文章

使用单抗体标记法对膜蛋白进行单分子定位显微成像

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DOI：

10.3791/69853

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2026年3月20日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Illinois Chicago, 2University of Illinois Cancer Center, 3Department of Biomedical Engineering, University of Illinois Chicago, 4Department of Biochemistry and Molecular Genetics, College of Medicine, University of Illinois Chicago

本文内容

摘要

本方案描述了单抗体标记法（SAL），用于解析质膜蛋白的纳米级空间分布。通过利用单分子水平上的抗体-表位累积相互作用，膜蛋白单抗体标记法（mSAL）可在原生细胞环境中同时绘制局部表位分布图并捕获抗体结合行为。

摘要

细胞质膜决定了细胞的形态，并作为调控细胞间通讯的界面。膜蛋白是一类重要的治疗靶点，因此通过其组成蛋白对细胞膜进行超分辨率成像，在推动细胞生物学和抗体药物研发方面具有重要意义。在此背景下，单分子定位显微镜（SMLM）能够实现生物结构上蛋白质分布的纳米级可视化。尽管如此，将SMLM应用于质膜蛋白仍面临独特挑战。本实验方案介绍了一种有效的时间分辨单抗体标记方法，称为膜单抗体标记法（mSAL）。我们提供了详细的分步操作指南，包括抗体浓度、激光功率密度、非照射时间间隔时长的优化，图像重建以及基于密度的聚类分析，以解析膜蛋白的纳米级分布特征和膜的形态结构。我们以四跨膜蛋白CD81作为模型膜蛋白，展示了mSAL在贴壁和悬浮培养的哺乳动物细胞中的应用能力。除了实现细胞膜及膜蛋白分布的超分辨率成像外，该技术还能够在天然膜环境中研究治疗性抗体与其膜靶点相互作用的药效动力学。

引言

细胞质膜含有多种多样的蛋白质，可调控细胞运动性、黏附、感知以及细胞间通讯。了解质膜蛋白在纳米尺度上的分布十分重要，因为蛋白质的功能不仅取决于其表达水平，还常受其在膜上空间组织方式的调控1,2。值得注意的是，许多治疗性抗体以膜蛋白为靶点3,4，因此在纳米尺度上开展研究对于理解抗体相互作用如何受到局部膜蛋白组织结构的影响至关重要。然而，精确绘制膜蛋白分布图谱、对其丰度进行单分子水平分析，以及实时监测其与结合伴侣的动态相互作用，仍然具有挑战性。

广泛使用的单分子定位显微技术，如直接随机光学重建显微术（dSTORM）5,6 和基于DNA的纳米级拓扑成像点累积技术（DNA-PAINT）7，通常采用免疫荧光（IF）染色对样品进行标记。这些技术可实现约10 nm的横向分辨率，已为多种治疗性膜靶点的纳米级组织结构提供了深入见解，包括人表皮生长因子受体2（HER2）8,9、CD2010、T细胞受体11,12,13、程序性死亡配体114、B细胞受体15,16,17 以及CD1917,18。例如，使用治疗性单克隆抗体曲妥珠单抗（Trastuzumab）直接检测乳腺癌关键受体HER2的dSTORM研究揭示了HER2阳性患者之间存在不同的聚簇状态8，而不同治疗性抗体也被证明可调节HER2的聚簇行为9。结合晶格光片显微技术的DNA-PAINT已阐明了B细胞中CD20在利妥昔单抗（rituximab）、奥法木单抗（ofatumumab）和奥滨尤妥珠单抗（obinutuzumab）等治疗性单克隆抗体作用下的寡聚状态及相互作用特征10。尽管传统SMLM为纳米级结构组织提供了宝贵信息，但其潜力受限于传统的IF染色方法。SMLM图像质量依赖于IF染色效果，而后者又取决于标记抗体的特异性和亲和力。传统SMLM使用高亲和力抗体，通常可获得更优的IF染色和图像质量。然而，大多数治疗性抗体与活细胞膜受体的相互作用具有中等亲和力，以尽量减少脱靶副作用19。例如，双特异性T细胞衔接分子（bispecific T cell engagers, TCEs）对CD3具有较低亲和力，从而防止TCR内化20,21,22。此类相互作用无法通过传统IF技术准确捕捉。

我们此前已开发出一种直接利用单分子抗体-表位相互作用的策略，称为单抗体标记（single-antibody labeling, SAL）。SAL能够在保持天然结合平衡的同时，实现抗体-表位相互作用的高密度作图23。尽管我们此前已报道过针对细胞内细胞骨架和线粒体蛋白的实验方案24，但尚未在膜蛋白上实现SAL。在本方案中，我们提供了一套将SAL应用于膜蛋白的逐步操作流程，并以四跨膜蛋白CD81（一种已被报道的潜在治疗靶点25,26,27,28）为示例，在悬浮细胞和贴壁细胞中均完成了标记。通过使用荧光标记的抗CD81抗体，直接探测CD81在U2OS细胞和Jurkat T细胞膜上的空间分布，我们展示了SAL在膜蛋白纳米尺度研究中的应用。我们将该策略命名为膜蛋白SAL（membrane SAL, mSAL）。最后，我们描述了一种基于聚类的策略，用于减少细胞外孤立的单分子检测信号。

本质上，SAL 利用延时单分子标记技术捕获单个抗体-表位相互作用，随后通过单发射体去卷积，基于 SMLM 获得超分辨率图像。通过调节抗体浓度并选择连续图像帧之间适当的非照明间隔（NII），SAL 将抗体的结合速率与单分子检测速率相匹配，从而实现单分子定位。由于抗体固有的结合动力学较慢，SAL 需要较长的 NII，导致图像采集时间延长（约 3–17 小时）。SAL 最适用于需要对表位进行精确纳米级定位以及评估单个抗体-表位相互作用动态特性的应用。尽管通量较低，SAL 能够在接近生理条件下提供关于表位组织结构和抗体结合行为的独特信息，因此在原位表征治疗性抗体方面具有重要价值。

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方案

本方案使用已建立的Jurkat E6.1和U2OS细胞系，不涉及原代人类材料或活体动物材料。

1. 细胞接种/贴附与固定

注意：样品制备遵循标准免疫荧光（IF） 染色 方案，已优化以在不同细胞类型中保持质膜蛋白的亚细胞结构。如果目标分子已有成熟的免疫染色方案，用户可沿用该方案至样品封闭步骤1.2.14。单抗体标记（SAL）依赖于荧光标记抗体与其抗原在单分子水平结合后产生的累积信号进行检测。将稀释于成像缓冲液中的荧光标记抗体加入显微镜载物台上的样品中，随着图像采集的进行，荧光标记动态发生。样品制备阶段不进行任何荧光标记。

  1. 按照先前发表的方案24准备贴壁细胞，例如 U2OS 细胞系。
  2. 细胞悬液
    1. 在 10 mL 完全 RPMI 培养基（RPMI 1640 加 10% (v/v) 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）中，于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中培养 Jurkat T 细胞，细胞密度维持在 1 × 105 至 1 × 106 个细胞/mL。
      ​注意：推荐的 10 mL 完全培养基适用于 T25 培养瓶；若使用其他培养容器，用户应相应调整体积。
    2. 向 8 孔腔室盖玻片中拟使用的孔中加入 200 µL 0.01% 多聚赖氨酸（PLL）溶液，以处理玻璃表面。4 °C 过夜或 37 °C 孵育 2 小时。
    3. 使用血细胞计数板对培养物中的细胞进行计数，然后将 3.5 × 104 个细胞转移至 1.5 mL 微离心管中。
      ​注意：可能需要调整细胞数量以获得良好的单细胞分布。接种 30,000–60,000 个 Jurkat T 细胞可达到理想密度，使单个细胞清晰分离且分布不过于稀疏。对于新的细胞类型，可能需要调整细胞数量。
    4. 以 300 × g 离心 3 分钟以获得细胞沉淀。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 200 µL 预热（37 °C）的 1× Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中。所得细胞沉淀在微离心管底部可见为一小块白色沉积物。
      ​注意：应根据机构指南及所有适用的地方、州和联邦法规处理生物危害性废物。
    5. 从已准备好的腔室盖玻片（步骤 1.2.2）中吸除 PLL 溶液。如果 PLL 孵育在 4 °C 过夜，则在吸除溶液前需将 8 孔腔室盖玻片预热至 37 °C。
    6. 将步骤 1.2.4 所得的细胞悬液加入 PLL 包被的腔室孔中。在含 5% CO2 的湿润培养箱中 37 °C 孵育 30 分钟，使细胞贴附于表面。接种前应充分混匀细胞悬液，并反复吹打以打散细胞团块，确保细胞在孔内均匀分布。
    7. 使用光学显微镜检查细胞在玻璃表面的贴附情况。在 10 倍物镜下，将显微镜聚焦于盖玻片底部。
      ​注意：在显微镜下观察时轻轻敲击腔室盖玻片，有助于判断细胞是否已贴附于表面或仍在漂浮。
    8. 准备 200 µL 固定液（含 4% 多聚甲醛和 0.1% 戊二醛的 DPBS），并在水浴中预热至 37 °C。
      ​注意：所提供的固定液针对 CD81 优化，通常适用于膜蛋白的保存。对于新的膜蛋白靶标，可能需要调整缓冲液组成以实现最佳保存效果。建议用户查阅文献，获取针对新靶标的特定固定条件。
      ​警告：多聚甲醛具有毒性且为致癌物。戊二醛具有毒性和腐蚀性。操作该试剂时应穿戴适当的个人防护装备（PPE）。若皮肤接触，应立即用肥皂和水彻底清洗受影响区域。应根据用户所在机构的指南及所有适用的地方、州和联邦法规处置该试剂。
    9. 使用移液器从每个样本孔（步骤 1.2.6）中吸除 DPBS。
      ​注意：所有溶液更换步骤必须缓慢进行，以避免细胞从盖玻片上脱落。应根据用户所在机构的指南及所有适用的地方、州和联邦法规处理生物危害性废物。
    10. 向孔的一角加入 200 µL 预热至 37 °C 的固定液，并在室温下孵育 15 分钟。
      ​警告：多聚甲醛具有毒性且为致癌物。戊二醛具有毒性和腐蚀性。操作这些试剂时应穿戴适当的 PPE 。若皮肤接触，应立即用肥皂和水彻底清洗受影响区域。应根据用户所在机构的指南及所有适用的地方、州和联邦法规处置该试剂。
    11. 用 500 µL DPBS 洗涤固定后的细胞 3 次。若直接进行步骤 1.2.12，则跳过此步骤。
    12. 可选：缓慢移除固定液，并加入 200 µL 新鲜配制的含 0.1% 硼氢化钠的 DPBS，室温孵育 7 分钟。若不使用硼氢化钠还原，则跳过此步骤并直接进行步骤 1.2.14。
      注意：硼氢化钠还原有助于淬灭戊二醛产生的自发荧光，并中和未反应的醛基。硼氢化钠与水溶液反应会释放氢气，表现为气泡释放。若未观察到氢气 释放，应使用新配制的硼氢化钠溶液。
      警告：硼氢化钠具有毒性和腐蚀性。操作该试剂时应穿戴适当的 PPE 。若皮肤接触，应立即用肥皂和水彻底清洗受影响区域。应根据用户所在机构的指南及所有适用的地方、州和联邦法规处置该试剂。
    13. 从各孔中吸除硼氢化钠溶液，然后用 500 µL DPBS 洗涤 3 次。
    14. 准备 200 µL 封闭缓冲液并加入孔中，室温孵育 30 分钟。不要使用透化试剂（如 TritonX-100、皂苷），因其可能去除膜蛋白。本文针对 CD81 提出的膜 SAL（mSAL）方案未包含封闭步骤。
      ​注意：对于新靶标的 mSAL，推荐使用含 5% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的 DPBS 作为封闭缓冲液。当使用二抗时，应使用相应来源的血清进行封闭。例如，使用山羊来源的二抗时，可用含 10% (v/v) 山羊血清的 DPBS。若已有针对该靶标的成熟封闭缓冲液配方和方案，用户可遵循该方案。封闭缓冲液可选择性添加同型对照抗体或血清来源抗体，以减少抗体的非靶标结合23,24。仅当抗体靶向膜蛋白的胞内表位时，才在封闭缓冲液中加入透化试剂。
    15. 对于使用荧光标记一抗的 mSAL，直接进行步骤 1.2.20。
    16. 准备 150 µL 一抗染色液（将一抗按所需浓度稀释于封闭缓冲液中）。对于使用荧光标记一抗的 mSAL，跳过此步骤。
      ​注意：进行一抗染色时，请参考供应商提供的说明书以获取推荐条件。若未提供浓度信息，可从 4 µg/mL（27 nM）开始尝试，适用于全长 IgG23,24。
    17. 用一抗溶液替换封闭缓冲液。室温孵育 2 小时，或 4 °C 在湿润盒中过夜。对于使用荧光标记一抗的 mSAL，跳过此步骤。
    18. 用 400 µL DPBS 洗涤样本 2 次。向孔中加入 200 µL 封闭缓冲液。
    19. 可选：用 200 µL 后固定缓冲液（4% 多聚甲醛）替换封闭缓冲液，室温孵育 10 分钟。
      ​注意：后固定有助于在 SAL 中保持样本的封闭效果23,24。然而，若后固定降低了表位可及性，则应省略此步骤。为评估后固定对抗体识别表位的影响，可进行标准免疫荧光染色，分别在有无后固定的条件下进行，并比较染色质量。
    20. 可选：用 DPBS 洗涤样本 2 次。
    21. 向每个孔中加入 200 µL DPBS，并用透明封膜覆盖腔室以防止蒸发。样本可在 4 °C 保存长达 1 个月。若在步骤 1.2.14 或未进行后固定的步骤 1.2.19 后立即进行 mSAL，则保持样本在封闭缓冲液中，并直接进行步骤 2.2。
      注意：在 DPBS 中添加 5 mM 叠氮化钠可防止储存期间细菌生长。
      警告：叠氮化钠具有急性毒性，摄入可致死。操作该试剂时应穿戴适当的 PPE 。若皮肤接触，应立即用肥皂和水彻底清洗受影响区域。应根据用户所在机构的指南及所有适用的地方、州和联邦法规处置该试剂。

2. 图像采集

注意：贴壁细胞和悬浮细胞的成像过程相似，均采用全内反射荧光（TIRF）显微镜进行。然而，每种细胞类型的成像条件应分别优化。

  1. 将储存的样品（4 °C）恢复至室温后再进行成像，以防止玻璃表面产生冷凝水。若样品制备后直接进行成像，则可跳过此步骤。
  2. 开启显微镜系统：包括显微镜、sCMOS相机、激光单元以及装有图像采集软件的计算机。开机后让系统稳定5–10分钟，使各组件达到工作温度，以最小化热漂移。
    注意：mSAL可使用任何TIRF显微镜系统及兼容软件完成。请根据仪器说明书开启系统。
  3. 在TIRF物镜（例如100倍/1.49数值孔径）上滴加浸油，并将带腔室的盖玻片安装到显微镜载物台上。
    注意：若物镜配有校正环，请将其调整至盖玻片在23 °C时的正确厚度。本研究所用盖玻片厚度为0.13–0.17 mm。
  4. 如设备配备完美聚焦系统（Perfect Focus System, PFS），请启用该功能，然后小心地升高物镜至接触盖玻片，并将样品调至焦点。
  5. 将金胶体作为定位标记物进行稀释（以超纯水1:2稀释）。稀释前对金胶体进行3分钟超声处理，以分散聚集体。
  6. 轻柔吸除样品孔中的储存缓冲液（DPBS或封闭缓冲液），加入200 µL金胶体溶液。孵育1分钟后移除溶液。
  7. 使用明场照明确认在吸除溶液前已有足够数量的金胶体沉积。理想的密度是在指定兴趣区域（ROI）内有5至10个金胶体。
    注意：也可选用荧光微球（见材料表），以DPBS 1:1,000稀释后使用。
  8. 用500 µL超纯水洗涤一次以去除多余的金胶体，然后加入200 µL DPBS。
  9. 在成像软件中为荧光染料（抗体探针所用）设置光学配置，包括合适的二向色镜、激光激发波长与功率密度、相机积分时间、发射滤光片以及相机像素合并（如适用）。建议像素尺寸为150–160 nm，以获得最佳分辨率。
  10. 设置光漂白步骤的光学配置。建议使用380 W/cm2或更高的激光功率，相机积分时间为1秒。
    注意：采集过程中的光漂白有助于减少单个荧光抗体结合事件之间的重叠。收集的光可通过波长不匹配的发射滤光片，以避免相机饱和。
  11. 调节激光入射角度以建立TIRF照明。使用明场照明选择一个用于mSAL的细胞。确保在兴趣区域（ROI）内至少可见5个金胶体，以便在图像重建过程中校正载物台漂移。确认在成像激光功率密度下金胶体无自发荧光。
  12. 在图像采集软件中设置成像参数：非照明间隔（NII）、帧数以及光漂白步骤的频率（如需要）。对于U2OS细胞和Jurkat T细胞上CD81蛋白的mSAL，最佳参数为NII 5秒、总共2,000帧，每第5帧执行一次光漂白。
    注意：这些参数需针对每种目标蛋白、所用抗体及细胞类型进行优化。详见步骤3中的优化说明。最佳帧数可能因抗体-靶标组合及细胞类型而异。对于新的靶标系统，建议初始采集2,000–3,000帧。NII会延长成像时间。例如，3,000帧mSAL采集，NII为20秒时，总采集时间约为17小时。
  13. 将CD81抗体用含5% BSA（w/v）的DPBS稀释至1 µg/mL，配制200 µL成像缓冲液。在CD81的mSAL实验中，Jurkat T细胞的终抗体浓度为0.5 nM，U2OS细胞为2 nM。
    注意：抗体浓度取决于局部底物丰度及抗体亲和力。必须针对每种目标蛋白、每种成像所用抗体及每种细胞类型优化抗体浓度。详见步骤3.1中的优化说明。
  14. 将配制好的成像缓冲液加入样品孔中，并开始图像采集。

3. 成像参数优化

注意：mSAL 成像参数受蛋白质表达水平、其局部组织结构以及所用成像抗体的选择影响。优化成像参数的目标是确定产生空间可分辨的单分子事件且保持足够高密度以最大化表位采样的抗体浓度和 NII。

  1. 抗体浓度
    1. 将抗体稀释至Jurkat细胞为0.5 nM，U2OS细胞为2 nM，溶于200 µL含5% (w/v) BSA的DPBS中，并将抗体溶液加入孔中。为实现最佳单抗体标记，应使用等于或接近其平衡解离常数（Kd）的抗体浓度；若Kd未知，建议起始浓度为1 nM。
    2. 使用成像软件中为mSAL配置的实时预览功能，监测抗体结合过程。
    3. 调节TIRF角度和成像参数，使信噪比（SNR）达到≥3。
      ​注意：通过限制成像缓冲液中扩散抗体产生的离焦荧光，最佳TIRF角度可提高信噪比。起始时可采用100–200 W/cm2 的激光功率密度和50 ms的相机积分时间。若信噪比较低，可逐步增加激光功率和/或相机积分时间，并监测信噪比变化，直至达到最优值。
    4. 在图像采集软件中设置成像参数，以获得至少10帧的采集，NII为5 s（见步骤2.12）。
      ​注意：建议以5 s的NII作为起始点。应对新抗体-靶标系统进行NII扫描，以确定最佳NII（步骤3.2）。
    5. 开始采集，评估所记录视频中单分子定位的稀疏程度。
      ​注意：获取定位密度的详细步骤已在先前发表的研究中描述24。研究发现，mSAL的单分子定位密度在0.02至0.15 事件/µm2 之间为最佳。
    6. 若在加入成像缓冲液后立即观察到多个重叠的抗体结合事件，或在记录过程中随着时间推移单分子定位持续累积，则中止采集。将抗体浓度降低一倍，并在新样本上重复采集。重复此过程，每次将抗体浓度降低一倍，并重新评估单位面积上的事件数量，直至达到理想的单分子定位事件密度。
      ​注意：重叠事件表现为多个较大的点状信号，当新的抗体在第一个抗体的衍射极限内结合时，这些信号变得更亮或更大。
    7. 若事件密度稀疏，则将成像缓冲液中的抗体浓度提高一倍，并在新样本上重复采集。重复此过程，每次将抗体浓度提高一倍，并重新评估单位面积上的结合事件数量，直至达到理想的单分子定位事件密度。
      ​注意：建议每次浓度优化试验均使用新鲜样本，以避免先前结合的抗体对后续定位密度评估造成潜在干扰。
  2. NII优化
    1. 在图像采集软件中设置成像参数，以获得50帧的采集（见步骤2.12）。将NII设为0（无延迟）。
    2. 将成像缓冲液配制为步骤3.1中优化后的抗体浓度，并加入样本孔中。开始采集。
    3. 重复步骤3.2.1–3.2.2，将NII分别调整为1、3、5、10或20 s。每次采集均在新样本上进行。
    4. 评估所记录视频中单分子定位的密度和稀疏程度（见步骤3.1.5–3.1.7）。在保持最佳单分子事件密度的前提下，最低的NII即为最优NII。
      注意：可能需要进一步优化抗体浓度，以在相应NII下实现最佳单分子定位密度。请参考步骤3.1。已有研究表明，较长的NII（10–20 s）对高密度结合事件更具选择性，但将NII延长至20 s以上并未带来额外改善23,24。若在图像采集过程中出现空间上重叠的结合事件，应引入光漂白步骤，间隔时间足以清除已结合抗体的荧光信号。例如，若在第五帧时出现重叠事件，则每第五帧进行一次光漂白。空间重叠事件的特征见步骤3.1.6的注释。

4. 数据分析

注意：mSAL 图像重建使用美国国立卫生研究院（NIH）提供的免费软件 Fiji29，并配合 ThunderSTORM30 插件。本方案中使用的 Fiji 版本为 v1.54r，ThunderSTORM 版本为 1.3。详细的图像分析方法已在先前的方案中描述24。在本节中，我们概述了专用于 mSAL 的分析工作流程。本方案中所呈现的分析使用了 Prime95B sCMOS 相机（序列号 A18B203004），其 A/D 转换增益为 0.98 个光电子，相机基底水平为 100，成像像素尺寸设定为 147 nm。

  1. 在“运行分析”窗口中设置重建参数。CD81 mSAL 图像重建所用参数如下所述。在运行完整分析之前，应使用“预览”功能评估所选帧中检测到的单分子结合事件。
    图像滤波：
    滤波器：小波滤波（B样条）
    B样条阶数：2
    B样条尺度：4
    分子近似定位：
    方法：局部最大值
    峰值强度阈值：std(Wave.F1)
    连通性：8-邻域
    亚像素分子定位：
    方法：点扩散函数（PSF）：积分高斯函数
    拟合半径 [px]：2
    拟合方法：最大似然法
    初始 sigma [px]：0.75
    多发射子拟合分析：未选中
    结果可视化：
    方法：归一化高斯函数
    放大倍数：7.3
    更新频率 [帧]：50
    横向不确定性：20
    注意：预滤波参数用于增强单发射子相对于背景的检测能力。这些参数可作为起始点，但应针对每组数据进行优化。近似定位与检测方法参数用于识别单分子结合事件。采用局部强度最大值结合8-邻域连通性已被证明具有可靠的性能31。积分高斯函数结合最大似然拟合方法被选为标准方法，因其在单分子成像应用中被广泛使用，并能对点扩散函数（PSF）提供可靠近似32,33,34,35。本方案中使用的可视化方法为归一化高斯函数。用户可根据自身数据选择最合适的可视化方法。放大倍数设置为生成20 nm的重建像素尺寸，该尺寸适用于基于抗体标记所能达到的预期定位精度，其中连接误差约为~10 nm。放大倍数7.3通过将衍射极限下的像素尺寸除以期望的重建像素尺寸计算得出（147 nm / 20 nm = 7.3）。更新频率决定处理过程中重建图像刷新的频率，但不影响最终结果。横向不确定性设为20（非强制），以便重建过程纳入计算得到的定位不确定性。有关可用选项的更多细节，请参阅ThunderSTORM用户指南30，或点击输入字段旁的问号。
  2. 以初始sigma为1.6像素、拟合半径为3开始ThunderSTORM分析。根据需要进一步优化参数。未使用多发射子拟合，因为在衍射极限图像中事件密度保持非重叠状态。
  3. 点击 确定 开始运行重建。完成后，结果窗口将自动打开。
  4. 使用 绘制直方图 功能查找峰值sigma值。将该值（nm）除以原始数据的像素尺寸转换为像素单位，然后使用新的初始sigma值以及拟合半径（设为接近3倍初始sigma的整数）重新运行ThunderSTORM分析30。
  5. 利用选定的基准标记物确定漂移校正24。
  6. 对整个视场进行图像重建，并应用计算得到的漂移校正。
  7. 对于图像的后处理，点击结果窗口中的 滤波 选项卡。应用滤波器去除定位质量差的事件。在CD81的显示结果中，去除了sigma大于200 nm且不确定性大于20 nm的事件。使用“绘制直方图”功能检查sigma分布，以确定合适的截断阈值。
    注意：sigma值较大的单分子定位通常来源于光子计数较低的弱荧光团或重叠发射子。同时去除了不确定性大于20 nm的定位事件，因为不确定性超过最终像素尺寸表明定位精度较差。有关滤波参数的更多指导，请参阅ThunderSTORM用户指南30。
  8. 通过选择 导出 保存包含单分子定位数据的结果表格，用于后续分析。导出文件为.csv格式，在本方案中称为mSAL.csv。同时保存生成的归一化高斯图像。

5. 聚类分析

注意：在表位检测过程中，抗体不仅会与其预定靶标发生相互作用（特异性相互作用），还会与非靶分子发生相互作用（非特异性相互作用）。由于mSAL依赖于单个抗体-抗原结合事件的累积检测，一些非特异性相互作用不可避免地会贡献于重建的图像。抗体-表位相互作用具有独特的动力学特征，原则上可通过这些特征区分特异性与非特异性结合，其中特异性与非特异性事件的区分依据是其局部相互作用密度，而非单分子停留时间36。本文描述了一种基于密度的空间聚类应用（DBSCAN）37分析方法，用于去除低密度事件，保留更可能反映抗体特异性结合的高密度事件。此外，基于密度的聚类分析还可提供有关蛋白质纳米级空间组织的定量信息，尤其适用于已知天然形成簇状结构的蛋白质，例如CD81在富含四跨膜蛋白的微区中的分布38,39,40,41,42。本研究所用的DBSCAN分析通过MATLAB 2025a完成。对于无法使用MATLAB的用户，建议使用Python或R等开源替代工具进行类似的DBSCAN分析43,44,45。本实验方案所用代码可从以下地址获取： https://github.com/nrams12/DBSCAN_SAL_Clusterer/tree/main。

  1. 运行代码
    1. 从上方的 GitHub 链接下载 MATLAB 文件。
    2. 启动 MATLAB 并打开代码。在第 37 和 38 行设置聚类参数的最小点数（minPTS）和 epsilon 值。以下参数已被使用：
      Jurkat T 细胞：
      minPTS：7
      Epsilon：60
      U2OS 细胞：
      minPTS：7
      Epsilon：80
      注意：有关优化这些参数的更多细节，请参见步骤 5.2。
    3. 将 MATLAB 软件中的文件路径设置为包含重建后的 mSAL.csv 文件的文件夹。
    4. 通过点击 运行 执行代码。代码将提示用户选择一个文件。选择 mSAL.csv 文件后点击 打开。
    5. 聚类后的数据将自动保存到代码中指定路径下的名为“MATLAB Data”的文件夹中。通过点击 插件 > ThunderSTORM > 导入/导出 > 导入结果 在 ThunderSTORM 中打开此文件。
    6. 保存生成的单分子定位显微镜图像。
  2. 聚类输入参数的优化
    注意：DBSCAN 算法的两个输入参数是 minPTS 和 epsilon。Epsilon 定义了围绕某一点建立其邻域的半径，而 minPTS 指定了形成一个密集区域所需的该邻域内最小点数。满足此密度要求的点被归类为核心点，其邻域中的点将被递归地添加到同一簇中。不满足密度要求但位于核心点邻域内的点被标记为边界点，其余所有点则被视为噪声点。
    1. 以步骤 5.1.2 中描述的输入参数作为起点运行分析。选择一个高于细胞外噪声定位数量但低于细胞上定位总数的 minPTS 值。选定 minPTS 后，调整 epsilon，使得在细胞上有代表性的区域中，该数量的定位能够被包含在邻域半径内。
      注意：minPTS 和 epsilon 可以独立调整。选择这些参数的一种实用方法是首先检查细胞外噪声点的散点图，并将其与细胞内类似大小区域中观察到的定位数量进行比较。
    2. 评估标有 图 2 的窗口中显示的聚类数据。如果数据在细胞上保留了预期表型的簇，同时细胞外的定位数量最小化，则说明聚类输入参数是合适的。
      注意：聚类后的数据应保留使用 mSAL 获取数据的结构特征。如果簇显得过小，仅局限于原始数据中密度极高的区域，并且排除了大量与预期表型相关的结合事件，则聚类参数可能过于严格。如果细胞外的非特异性结合未被充分抑制且出现大量簇，则聚类参数可能过于宽松。
    3. 如果聚类参数过于严格，应降低 minPTS 并增大 epsilon，以将更多点纳入聚类数据中；如果聚类参数过于宽松，则应提高 minPTS 并减小 epsilon。
    4. 调整 minPTS 和 epsilon 后，重新运行代码。重复步骤 5.2.2 至 5.2.3，直至达到最优聚类效果。

6. 验证抗体与其靶标的结合

注意：对于无明确形态的膜蛋白，验证解析结构的准确性可能具有挑战性。为验证抗体的特异性，用户可表达目标蛋白的荧光蛋白（FP）融合体。作为初步检测，可在表达FP融合蛋白的细胞上进行常规免疫荧光染色。在评估新抗体时，如需更精确的验证，可在表达FP的细胞上进行mSAL，以确认定位结合事件与荧光标记的目标蛋白一致。此处以在U2OS细胞中转染CD81-mStayGold为例，说明实验方案，从而确认CD81 mSAL的定位信号与细胞表面FP标记的CD81相对应。用户可选用任何合适的荧光蛋白，前提是其发射光谱不与待验证抗体的荧光通道重叠。

  1. 将U2OS细胞接种于8孔腔室载玻片中，培养至约70%融合度。使用200 µL完全培养基（DMEM添加10% (v/v) 胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素）维持细胞生长。
  2. 将编码目标蛋白并带有荧光报告分子的100 ng DNA质粒与5 µL Lipofectamine 2000混合。涡旋振荡30秒，室温孵育30分钟。
    注意：本研究使用了与mStayGold融合的CD81。DNA质粒构建采用标准分子克隆技术，但这些步骤未在本方案中详述。所提供的DNA与Lipofectamine比例已针对8孔腔室载玻片中的细胞进行优化，若用于其他样品格式，可能需根据制造商说明进行调整。
  3. 向细胞中加入5 µL DNA/Lipofectamine混合液。将腔室载玻片置于37 °C、含5% CO2的湿润环境中孵育4小时。
  4. 更换为预热的完全培养基，在37 °C、含5% CO2的湿润环境中继续孵育> 8小时，以达到可检测的蛋白表达水平。
  5. 使用荧光显微镜或成像仪检测细胞中的荧光表达水平。建议转染效率达到≥30%。若荧光表达水平不理想，应根据制造商指南优化DNA与Lipofectamine的比例。
    注意：用于抗体验证的瞬时表达细胞应在转染后24–48小时内使用。
  6. 如需固定细胞，请参照步骤1.2.8–1.2.13进行操作。
  7. 将固定后的样品保存在含有5 mM叠氮化钠的200 µL DPBS中，直至准备成像。样品可在4 °C保存长达1个月。
    警告：叠氮化钠具有急性毒性，若摄入可能致死。操作该试剂时应穿戴适当的个人防护装备 。如发生皮肤接触，应立即用肥皂和水彻底清洗受影响区域。废弃处理应遵循所在机构的指导方针以及所有适用的地方、州和联邦法规。
  8. 按照步骤2.1–2.12设置显微镜并安装样品。利用荧光信号识别表达目标蛋白的细胞。
  9. 作为参考，采集该细胞的全内反射荧光（TIRF）图像。若使用的荧光蛋白与mSAL抗体在同一成像通道，则需对该荧光蛋白进行光漂白。进行光漂白时，使用最大激光功率照射> 10分钟，直至无信号可见。
  10. 向孔中加入预先配制的成像缓冲液，并开始成像。分析应按照前述方法（步骤4）完成。
  11. 打开在mSAL成像前获取的重构图像和荧光蛋白的TIRF图像。通过比较表达蛋白在衍射受限TIRF图像中的形态与定位，与mSAL图像进行对照，评估mSAL抗体的结合位置。

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结果

本方案中描述的mSAL技术能够可视化单个抗体与其相应质膜蛋白靶标的结合事件，从而生成膜蛋白分布的超分辨率图谱。此处以CD81作为代表性示例，但该方法可轻松适用于其他膜蛋白。

将Jurkat T细胞固定并保持细胞间足够的间距，可确保抗体能够接触到细胞膜表位，同时便于玻璃表面的定位标记物沉降（图1A）。此外，移液操作技术会直接影响脆弱膜结构的保存。因此，在溶液更换步骤中应轻柔移液。将溶液加入孔板的角落，同时将样品腔室倾斜持握，有助于防止液流冲走细胞并破坏脆弱的膜结构（图1B）。

添加金胶体作为基准标记，以校正图像重建过程中可能发生的任何横向载物台漂移。显微镜系统的完美聚焦系统（PFS）通过使用近红外光追踪盖玻片表面并持续调节物镜高度，自动校正焦平面漂移，从而在长时间成像过程中保持样本始终聚焦。如果使用与近红外激发荧光染料偶联的抗体，则应关闭PFS功能。成像前必须确认视野中存在足够数量的金胶体。

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讨论

质膜蛋白的排列在调控细胞功能中起着至关重要的作用。传统的荧光显微镜技术受限于光的衍射极限，无法揭示其纳米尺度上的组织结构。单分子定位显微镜（SMLM）通过实现10–20 nm的空间分辨率47，能够表征这些蛋白的纳米级组装结构10,48,49。然而，SMLM中的聚类伪影源于对同一荧光分子的重复检测50，可能导致出现虚假的蛋白聚集现象。单分子检测依赖于荧光分子的光开关特性，因此并不能完全反映局部表位的实际浓度51,52,53,54,55。基...

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披露

所有作者声明不存在任何需要披露的利益冲突。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所根据资助编号R35GM146786以及伊利诺伊大学芝加哥分校文理学院资助。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗CD81 Alexa Fluor 488 抗体Thermo Fisher ScientificMA5-44132成像抗体
台式离心机Eppendorf5424
牛血清白蛋白MilliporeSigmaA7906-100G
8孔腔室盖玻片CellvisC8-1-N
DMEM培养基Thermo Fisher Scientific11960069
杜氏磷酸盐缓冲液Thermo Fisher Scientific14190-144
胎牛血清MilliporeSigmaF0926-500ML
戊二醛，10%Electron Microscopy Sciences16120
金胶体，100 nmTed Pella15711−20定位标记物
浸油 Cargille Laboratories16245
配备TIRF模块的倒置显微镜 Nikon InstrumentsEclipse Ti2-E显微镜
Jurkat E6.1细胞系MilliporeSigma88042803-1VL悬浮细胞
六线激光发射器OxxiusL6CC-CS8-1511激发激光器
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019转染试剂
微量离心管，1.5 mL VWR89000-028
显微成像软件Nikon InstrumentsNIS-Elements Advanced Research图像采集软件
物镜，100x/1.49 CFI APO TIRF Nikon InstrumentsMRD01991显微镜物镜
多聚甲醛，16%Electron Microscopy Sciences15710
青霉素-链霉素Thermo Fisher Scientific15140-122抗生素
聚-L-赖氨酸溶液，0.01% MilliporeSigmaP4707-50ML
Prime 95B sCMOS相机Teledyne Vision Solutions01-PRIME-95B-R-M-16-C相机
RPMI 1640培养基Thermo Fisher Scientific11875-093悬浮细胞培养基
叠氮化钠Thermo Fisher Scientific19038-1000
硼氢化钠MilliporeSigma213462-25G
T25培养瓶Thermo Fisher Scientific169900
TetraSpeck微球定位标记物
组织培养皿，100 mm Corning353003
U2OS细胞系ATCCHTB-96贴壁细胞

参考文献

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细胞膜超分辨率显微镜CD81蛋白基于密度的聚类抗体结合漂移校正治疗性抗体
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