利用单抗体标记进行膜蛋白单分子定位显微镜

Summary

该方案描述了单抗体标记（SAL）以解析质膜蛋白的纳米尺度空间组织。通过单分子层面的抗体-表位累积相互作用，膜SAL（mSAL）绘制局部表位分布图，同时捕捉本地细胞环境中的抗体结合行为。

Abstract

质膜定义了细胞的形状，并作为细胞间通信的界面。膜蛋白是主要的治疗靶点类别;因此，通过细胞膜的构成蛋白进行超分辨，在推动细胞生物学和抗体治疗的发展方面具有巨大潜力。在这方面，单分子定位显微镜（SMLM）使得蛋白质组织在生物结构上的纳米尺度可视化成为可能。尽管SMLM重要，但将SMLM应用于质膜蛋白仍面临独特挑战。在本方案中，我们提出了一种有效的方法，采用了称为膜SAL的单抗体标记（SAL）的有效方法。我们提供详细的逐步指导，包括优化抗体浓度、激光功率密度、非照明间隔持续时间、图像重建以及基于密度的聚类分析，以解析纳米尺度膜蛋白分布和膜形态。我们使用四斯宾素蛋白CD81作为模型膜蛋白，展示mSAL对粘附和悬浮哺乳动物细胞的能力。除了超分辨细胞膜和膜蛋白分布外，我们的技术还能够研究治疗性抗体在原生膜环境中与其膜靶点相互作用的药效学。

Introduction

质膜包含多种蛋白质，调节细胞的移动性、粘附性、感知和细胞间通讯。理解质膜蛋白的纳米尺度分布非常重要，因为蛋白质功能通常不仅受表达水平控制，还受其在膜上的空间组织^影响。值得注意的是，许多治疗性抗体靶向膜蛋白^3,4，使得纳米尺度研究对于理解抗体相互作用如何受局部膜蛋白组织影响至关重要。然而，膜蛋白分布的精确定位、单分子丰度分析以及实时监测其与结合伙伴的动态相互作用仍具挑战性。

广泛使用的单分子定位显微镜（SMLM）技术，如直接随机光学重建显微镜（dSTORM）^5,6和基于DNA点积的纳米尺度地形成像（DNA-PAINT^）7，采用免疫荧光（IF）染色进行样本标记。它们实现了侧向分辨率~10纳米，并对治疗膜靶点的纳米尺度组织提供了广泛见解，包括人类表皮生长因子受体2（HER2）8,9，CD20^10，T....

Protocol

该方案使用已建立的Jurkat E6.1和U2OS细胞系，不涉及主要的人类或活体动物材料。

1. 细胞播种/着陆与固定

注意：样品制备遵循标准免疫荧光（IF）染色方案，优化以保持不同细胞类型间质膜蛋白的亚细胞组织。如果目标有既定的免疫染色方案，用户可遵循该方案至样本阻断步骤1.2.14。单抗体标记（SAL）依赖于在单分子层面与抗原结合时，对荧光标记抗体的累积检测。在显微镜阶段，将稀释在成像缓冲液中的荧光标记抗体加入样品中，随着图像采集的推进，荧光标记会动态进行。样品制备阶段不进行荧光标记。

1. 制备粘附细胞，如U2OS细胞系，如先前发表的协议中描述的²⁴。
2. 电池悬浮液
   1. 在加湿培养箱中，10毫升完整RPMI培养基（RPMI 1640补充10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）中，保持Jurkat T细胞密度为1 x 10 x 10 x 10 x¹⁰ 6 cells/mL/mL/mL，环境为37°C，并补充5%_CO2。
      注意：推荐的10毫升完整培养基适用于T25瓶;用户在使用不同培养皿时应相应调整体积。
   2. 通过向用于8孔室覆盖玻璃的孔中....

Results

本协议中描述的mSAL技术能够可视化单抗体与其对应的质膜蛋白靶点结合事件，生成膜蛋白分布的超分辨率图谱。这里以CD81为代表例，尽管该方法也易于适应其他膜蛋白。

在细胞间保持足够间距的固定Jurkat T细胞，确保抗体和玻璃表面能接触膜表位，从而使基晶沉降（见图1A）。此外，移液技术还能直接影响脆弱膜结构的保存。因此，建议在溶液交换步骤中轻柔移液。将溶液滴入井角并保持样品腔室角度，有助于防止溶液流动使细胞脱落并破坏脆弱的膜结构（见图1B）。

金胶体作为基点标记添加，以校正图像重建过程中的任何侧向漂移。显微镜系统上的完美对焦系统（PFS）通过利用近红外光自动校正焦距漂移，并持续调整物镜高度，在长期成像过程中保持样品的焦点。如果使用与近红外激发荧光团结合的抗体，应关闭PFS功能。成像前必须确认视场内有足够的金胶体。

Discussion

质膜蛋白的组织在调控细胞功能中起着关键作用。传统荧光显微技术受限于光的衍射极限，掩盖了其纳米尺度的组织结构。SMLM 克服了这一限制，实现了 10-20 nm⁴⁷ 的空间分辨率，使得其纳米级组装体^10、48、49 的表征成为可能。SMLM中的聚集伪影源于重复检测到相同的荧光团⁵⁰，这可能导致蛋白质簇的外观。单分子检测依赖于荧光团的光交换特性，因此无法完全反映局部表位浓度^{51、52、53、54、}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
抗CD81 Alexa Fluor 488抗体	赛莫飞世尔科学	MA5-44132	成像抗体
台式离心机	埃彭多夫	5424
牛血清白蛋白	米利波尔西格玛	A7906-100G
带腔盖玻璃，8孔	塞尔维斯	C8-1-N
DMEM媒体	赛莫飞世尔科学	11960069
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水	赛莫飞世尔科学	14190-144
胎儿牛血清	米利波尔西格玛	F0926-500ML
戊二醛，10%	电子显微镜科学	16120
金胶体，100纳米	特德·佩拉	15711及减;20	信托标记
浸油	嘉吉实验室	16245
倒立显微镜及nbsp;配备TIRF模块	尼康仪器	日蚀Ti2-E	显微镜
Jurkat E6.1细胞系	米利波尔西格玛	88042803-1VL	悬浮电池
激光发射，6线	奥克修斯	L6CC-CS8-1511	激发激光器
脂氧胺 2000	赛莫飞世尔科学	11668019	转染试剂
微型离心管，1.5毫升，nbsp;	VWR	89000-028
显微镜成像软件	尼康仪器	NIS-Elements高级研究	图像采集软件
目标，100倍/1.49 CFI APO TIRF	尼康仪器	MRD01991	显微镜物镜
对甲醛，16%	电子显微镜科学	15710
青霉素-链霉素	赛莫飞世尔科学	15140-122	抗生素
聚L-赖氨酸溶液，0.01%	米利波尔西格玛	P4707-50ML
Prime 95B sCMOS 相机	Teledyne视觉解决方案	01-PRIME-95B-R-M-16-C	相机
RPMI 1640 媒体	赛莫飞世尔科学	11875-093	悬浮电池介质
叠氮化钠	赛莫飞世尔科学	19038-1000
硼氢化钠	米利波尔西格玛	213462-25G
T25培养瓶	赛莫飞世尔科学	169900
TetraSpeck 微球			信托标记
组织培养皿，100毫米和nbsp;	科宁	353003
U2OS细胞系	空军交通管制委员会	HTB-96	粘附细胞