植物化学成分分析、气相色谱-质谱联用分析及Terminalia mantaly在大鼠体内的in vivo活性研究

摘要

本文介绍了一种整合植物化学分析、气相色谱-质谱联用表征以及经过验证的体内实验的方案，用于评价Terminalia mantaly的抗炎、镇痛和解热活性，为药用植物的药理学评估提供可重复的研究框架。

摘要

用于炎症、疼痛和发热的合成药物虽然有效，但常引起不良反应，因此人们对植物来源的治疗替代品日益关注。Terminalia mantaly H. Perrier 在非洲传统医学中被长期使用，但其科学验证仍较有限。本研究提出了一种整合性实验方案，结合植物化学筛选、酚类和黄酮类化合物的定量分析、气相色谱-质谱联用（GC-MS）成分表征以及体内药理学测试，以评估 T. mantaly 甲醇提取物的治疗潜力。植物化学筛选证实了多种生物活性成分的存在，GC-MS 分析鉴定了20种化学成分，包括脂肪酸、植物甾醇、生育酚及其他具有已知抗炎和抗氧化特性的生物活性化合物。在大鼠体内的药理学评价显示，在卡拉胶诱导的足趾肿胀模型中，该提取物具有剂量依赖性的抗炎活性；在尾浸试验中显著延长了疼痛回缩潜伏期；并减轻了酵母诱导的发热。在较高剂量下，其效果与双氯芬酸和对乙酰氨基酚等标准药物相当。急性毒性和细胞毒性评估表明，在测试剂量范围内具有良好的安全性。综上，这些结果验证了 T. mantaly 的传统药用价值，并展示了一个可重复的实验框架，用于关联植物化学成分与药理活性。该方案为研究药用植物的研究人员提供了实用的方法学参考，并有助于推动植物来源药物在炎症和发热相关疾病管理中的开发。

引言

炎症、疼痛和发热是多种急性和慢性疾病共有的相互关联的病理过程。尽管非甾体抗炎药、糖皮质激素和对乙酰氨基酚等合成药物仍是治疗的主要手段，但长期使用常伴随胃肠道刺激、肾脏并发症、肝毒性及其他不良反应¹。这些局限性促使人们日益关注药用植物作为更安全、更可持续的替代方案，用于管理炎症和发热相关疾病。天然产物因其富含结构多样的生物活性分子而广受认可，其中许多化合物已成为现代药物研发的先导分子。在此背景下，使君子科植物T. mantaly因其在非洲传统医学中用于治疗感染、胃肠道疾病及炎症性疾病的经验用途而受到关注^2,3。尽管该植物具有传统应用价值，但系统性药理学研究仍较匮乏，尚不足以充分验证其治疗潜力。特别是目前尚缺乏将植物化学筛选、体内生物学评价与气相色谱-质谱联用（GC–MS）等先进化学分析方法相结合的综合性研究。填补这一空白对于科学验证其民间用药价值，并发现潜在的药物先导化合物至关重要⁴。在本研究中，对T. mantaly的甲醇提取物进行了系统的植物化学和药理学评价。初步分析证实其含有酚类、黄酮类、单宁、皂苷和萜类等关键代谢物，这些成分已知具有抗炎、镇痛和抗氧化作用⁵。定量分析进一步显示，该提取物中酚类和黄酮类化合物含量较高，其数值与参比标准相当，提示其具有较强的抗氧化潜力。

使用动物模型是因为所评估的药理反应涉及无法在体外重现的整合性炎症、神经和体温调节通路。体内实验为生物活性提供了明确的药理学证据。在大鼠中测试了其抗炎（卡拉胶诱导的足趾水肿）、镇痛（尾部浸入法）和解热（酵母诱导的发热）特性，结果显示在较高剂量下具有与双氯芬酸钠相似的剂量依赖性抗炎活性。同样，该提取物延长了大鼠尾部浸入实验的潜伏期，证实其具有镇痛功效；而在酵母诱导的发热模型中则表现出显著的解热作用，效果与对乙酰氨基酚相当⁶。通过气相色谱-质谱（GC–MS）分析进行的化学成分表征进一步揭示了其生物活性成分的组成。共鉴定出20种化合物，包括3,5-二羟基-6-甲基-2,3-二氢-4H-吡喃-4-酮、亚油酸、γ-谷甾醇、角鲨烯和维生素E。这些化合物已被广泛报道具有抗氧化、抗炎和心脏保护作用，支持本研究中观察到的药理结果^7,8。重要的是，毒性评估显示其细胞毒作用可忽略不计，表明在测试剂量下具有良好的安全性。综上所述，本研究通过提供植物化学和药理学证据，填补了关键的研究空白，证实了T. mantaly的药用价值。研究结果不仅验证了其传统用途，还突显了其作为开发抗炎及相关疾病新型疗法先导化合物的天然来源潜力。本研究中使用的实验模型主要反映急性炎症和伤害性反应，因此所提供的药理学证据属于初步性质，尚不能直接推断其对慢性疾病的治疗效果。

方案

所有动物实验均按照国际实验动物护理和使用指南进行，并符合经合组织（OECD）的建议。本研究方案已获得穆尔坦巴豪丁·扎卡里亚大学动物护理与使用委员会（IACUC）的批准（批准号：3 /UREC/2025）。所有努力均致力于最大限度减少动物痛苦并降低使用动物的数量。

1. 准备T. mantaly全甲醇提取物（TMWM）

1. 采集 T. mantaly 的新鲜茎、根和叶，对植物材料进行鉴定，并将凭证标本存入公认的植物标本馆。
   注：本研究使用的植物材料于2023年11月12日采自巴基斯坦木尔坦市马蒂塔尔路旁遮普苗圃。采集地点的地理坐标为北纬30.2236°，东经71.4755°。该植物由木尔坦巴哈丁·扎卡里亚大学植物学教授、分类学家Zafar Ullah Zafar博士进行分类学鉴定，并将凭证标本（www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2434420）保存于该校植物标本馆。植物材料采自其自然生境，在适宜的环境条件下采集，并以照片记录采集地点。
2. 先用自来水清洗植物材料，再用蒸馏水冲洗以去除污染物，然后在25–30 °C下避光干燥7–10天，直至达到恒重。
3. 将干燥后的材料研磨成粗粉，使用分析天平称取500 g。将粉末转移至洁净的玻璃容器中，加入2.5 L甲醇。
4. 在室温下浸泡提取混合物72小时，每隔6–8小时间歇性振摇一次，然后通过Whatman No.1滤纸过滤。
5. 使用旋转蒸发仪在39 °C下减压浓缩滤液，随后将干燥的提取物储存于密闭容器中，室温保存备用。
   注意：甲醇具有毒性和易燃性。操作时应在通风橱内进行，并佩戴手套和护目镜。废液应按照机构化学品安全指南进行处置。
   ​注：干燥提取物可在密闭容器中室温保存数周后再进行后续分析。

2. 总酚含量的测定（福林-乔卡泰欧法）

1. 通过将10 mg没食子酸溶解于100 mL甲醇中，配制没食子酸储备液（100 µg/mL），并配制1–10 µg/mL的系列稀释液。
2. 将10 mg提取物溶解于10 mL甲醇中，得到1 mg/mL的溶液。分别取0.5 mL标准品或样品溶液加入试管中。
3. 加入2.5 mL用蒸馏水1:1稀释的福林-酚试剂，再加入2.0 mL 7.5%碳酸钠溶液。混匀后于25 ± 2 °C条件下避光反应30 min。
4. 以试剂空白为对照，在765 nm处测定吸光度，并以每克提取物中含有的没食子酸当量毫克数（mg gallic acid equivalents/g extract）计算总酚含量。

3. 总黄酮含量测定（氯化铝法）

1. 将芦丁溶于甲醇中，配制浓度为1000 µg/mL的芦丁储备液，然后配制10–80 µg/mL范围内的系列稀释液。
2. 取0.5 mL标准品溶液或提取物溶液加入试管中，再加入1.5 mL甲醇、0.1 mL 10%氯化铝（AlCl₃）溶液、0.1 mL 1 M醋酸钾溶液和2.8 mL蒸馏水。
3. 室温下避光孵育30分钟，于415 nm处测定吸光度。结果以每克提取物中含芦丁当量的毫克数（mg rutin equivalents per g extract）表示⁹。

4. 气相色谱-质谱联用（GC–MS）分析

1. 将10 mg提取物溶解于1 mL HPLC级甲醇中，并通过0.22 µm针头滤器过滤至GC小瓶中。
2. 使用配备HP-5MS毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 µm）的Agilent 7890B气相色谱仪与5977A质谱仪联用进行分析。载气为氦气，流速1.0 mL/min，进样口温度设为250 °C。
3. 离子源温度保持在230 °C，四极杆温度设为150 °C。程序升温设置如下：起始温度60 °C（保持2 min），以10 °C/min升至180 °C，再以5 °C/min升至280 °C，最后保持10 min。
4. 以分流模式（分流比10:1）进样1 µL过滤后的提取物，记录m/z范围为40–600的色谱图。在样品进样前运行溶剂空白对照。
5. 通过将质谱图与NIST质谱数据库比对来鉴定化合物，并利用保留时间及峰面积归一化方法确认其身份。

5. 抗炎活性（卡拉胶诱导的足跖水肿）

1. 选用体重为180–220 g的健康Albino Wistar大鼠，适应性饲养7天。实验前夜禁食，但可自由饮水。
2. 将动物随机分为五组（每组n = 5）。对照组给予生理盐水；给药组分别口服给予100、200和300 mg/kg剂量；标准组皮下注射双氯芬酸钠（40 mg/kg）。
3. 给药1小时后，向右侧后足底侧区域注射0.1 mL新鲜配制的1%角叉菜胶溶液。
4. 使用数字游标卡尺在0、1、2、3和4小时测量足爪厚度，并计算相对于基础值的增加量。
5. 与对照组相比，计算水肿抑制百分率¹⁰。
   注意：角叉菜胶粉末可能引起刺激。避免吸入和皮肤接触，生物废弃物应按照机构生物安全规程处理。

6. 镇痛活性（尾浸法测试）

1. 使用在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养、可自由进食和饮水的白化Wistar大鼠。
2. 将动物分为五组（n = 5）。对照组给予蒸馏水，给药组分别口服给予100、200和300 mg/kg的提取物，标准组给予对乙酰氨基酚（20 mg/kg）。
3. 将水浴温度维持在55 ± 1 °C。将大鼠尾尖远端1–2 cm浸入水中，使用15秒作为截止时间，记录基础回缩潜伏期。
4. 在给药后30、60、90和120分钟重复测量，每次确保浸入尾部的相同部位。
5. 计算潜伏期的百分比增加量，结果以均值 ± 标准差表示。

7. 解热活性

1. 使用已适应环境的大鼠，用润滑过的数字体温计测量其正常直肠温度。
2. 将20%的啤酒酵母悬浮液用蒸馏水配制，按10 mL/kg剂量皮下注射至背部以诱导发热。
3. 注射18小时后再次测量直肠温度，排除体温升高不足0.5 °C的动物。
4. 将发热大鼠随机分为五组（每组n = 5）。对照组给予生理盐水，治疗组分别口服给予100、200和300 mg/kg的植物提取物，标准组给予对乙酰氨基酚（150 mg/kg）。
5. 给药后0、1、2和3小时测量直肠温度，并计算相对于基线的体温下降值¹¹。
   CAUTION: 啤酒酵母悬浮液属于生物材料，应按照标准生物安全规范操作。未使用的悬浮液及受污染材料应作为生物废弃物处理。
   ​NOTE: 酵母注射后，可将动物放回笼中，在标准条件下饲养直至测量体温。

8. 急性毒性研究

1. 按照经济合作与发展组织（OECD）指南423，使用健康成年、任一性别的白化Wistar大鼠（体重180–220 g）进行实验。
2. 给药前将动物禁食过夜，并随机分为若干组（每组5只）。
3. 向给药组动物单次口服给予5 g/kg体重的提取物，对照组动物给予蒸馏水（1 mL/kg）。
4. 给药后最初4小时内持续观察动物，24小时内定期观察，并在14天内每日观察。
   注：观察指标包括皮肤和毛发状况、眼睛和黏膜、呼吸模式、流涎、震颤、抽搐、运动活动能力以及一般行为反应的变化。
5. 在第0天、第7天和第14天记录毒性临床症状、死亡率及体重变化。
6. 根据存活率以及观察到的行为或生理变化评估安全性¹²。
   ​注：行为学评分包括对姿势、步态、活动水平、理毛行为、对外界刺激的反应以及嗜睡或过度活跃迹象的监测。

9. 统计分析

1. 汇总所有实验数据，并以均值 ± 标准差表示结果，每组 n = 5 只动物。
2. 将数据以列表格式输入 GraphPad Prism 软件。
3. 在进行比较分析前，使用 Shapiro–Wilk 检验评估数据的正态性。
4. 在 GraphPad Prism 软件中选择：Analyze → One-way ANOVA → Tukey multiple comparisons，进行统计分析。
5. 采用单因素方差分析，随后进行 Tukey 事后多重比较检验，以确定各组之间的统计学显著性差异。
6. 当 p < 0.05 时，认为差异具有统计学显著性。

结果

本研究中描述的实验方法获得了可重复的体外和体内数据，从而能够评估T. mantaly甲醇提取物的植物化学成分及其药理活性。所有实验测量均设置重复，结果以均值±标准差（SD）表示。组间差异的统计学显著性采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后检验进行判断，以p < 0.05为差异具有统计学意义。

采用福林-酚法（Folin–Ciocalteu）和氯化铝法测定总酚含量和黄酮含量，重复测量得到的吸光度值具有一致性，没食子酸和芦丁标准品的校准曲线显示出良好的线性关系（图1 和 图2）。提取物的总酚含量定量为每克提取物含1.084 ± 0.445 mg没食子酸当量，总黄酮含量为每克提取物含0.114 ± 0.008 mg芦丁当量。在最佳实验条件下，吸光度读数稳定，重复样品间变异极小，表明分光光度测定结果可靠。相比之下，若标准曲线的吸光度值异常或线性降低，可能提示试剂新鲜度、孵育时间或分光光度...

讨论

本研究结合植物化学成分表征和已建立的体内药理学模型，评价了T. mantaly甲醇提取物的抗炎、镇痛和解热潜力。所采用的实验模型在天然产物研究中被广泛应用，为生物活性的初步评估提供了实用的框架。

化合物保留时间的可重复性反映了提取物的化学复杂性，并为后续的靶向研究提供了依据。这些成分常与植物提取物的抗炎和抗氧化活性相关。例如，脂肪酸（如亚油酸）已知可调节炎症介质释放和氧化通路，而植物甾醇（如γ-谷甾醇）则被报道可抑制前列腺素合成和炎症信号传导。生育酚（包括维生素E）具有抗氧化和稳定细胞膜的作用，可能在炎症反应过程中保护组织^13,14,15。这些化合物的存在支持如下解释：体内实验中观察到的生物学效应可能源于多种植物化学成分之间的协同作用，而非单一活性分子的作用。近年来的植物化学研究已报道了GC-MS鉴定出的化合物与药理活性之间的类似关联¹⁶

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
白化Wistar大鼠	机构动物房	N/A	实验动物
氯化铝	Sigma-Aldrich	237051	黄酮类测定
Brewer’s酵母	Sigma-Aldrich	YSC2	发热诱导
角叉菜胶	Sigma-Aldrich	C1013	足跖水肿诱导
离心机	Eppendorf	5810R	样品处理
双氯芬酸钠	Sigma-Aldrich	D6899	抗炎标准品
数字直肠体温计	欧姆龙	MC-246	直肠温度测量
数字游标卡尺	Mitutoyo	500-196-30	足跖厚度测量
蒸馏水	本机构制备	N/A	溶剂
Folin–Ciocalteu试剂	Sigma-Aldrich	F9252	酚类测定
没食子酸	Sigma-Aldrich	G7384	酚类标准品
GC–MS系统	安捷伦科技	7890B–5977A	植物化学成分分析
GraphPad Prism	GraphPad Software	版本 8.0	统计分析软件
甲醇（HPLC级）	默克	106009	提取溶剂
口服灌胃针	Instech	FTP-20-38	口服给药
对乙酰氨基酚	Sigma-Aldrich	P0300000	镇痛与解热标准品
乙酸钾	默克	104820	黄酮类测定
旋转蒸发仪	Büchi	R-200	提取物浓缩
芦丁	Sigma-Aldrich	R5143	黄酮类标准品
碳酸钠	默克	106392	酚类测定
紫外–可见分光光度计	岛津	UV-1800	吸光度测量
恒温水浴锅	Memmert	WNB14	尾浸试验