一种通过颈动脉部分结扎与PCSK9过表达联合诱导的小鼠动脉粥样硬化模型

摘要

通过结合PCSK9腺相关病毒（PCSK9-AAV）诱导的高脂饮食高胆固醇血症与左侧颈动脉部分结扎术（PCL），建立了一种可重复的小鼠模型，可模拟人类病理生理过程。该模型无需基因组编辑即可在野生型小鼠中快速诱导出类似人类的颈动脉粥样硬化病变，为颈动脉粥样硬化研究提供了一种标准化工具。

摘要

在野生型小鼠中缺乏快速且可重复的颈动脉特异性动脉粥样硬化模型，限制了斑块生物学及治疗策略的转化研究。本方案描述了一种无需基因组编辑、时间效率高的方法，通过联合使用腺相关病毒（AAV）介导的PCSK9过表达、致动脉粥样硬化高脂饮食以及左侧部分颈动脉结扎（PCL），在C57BL/6小鼠中诱导出可重复的颈动脉动脉粥样硬化。该方法旨在提供一种标准化操作流程，以在无需转基因动物的前提下，重现人类颈动脉疾病的关键病理生理特征——高脂血症与紊乱血流。本方案包括PCSK9-AAV的剂量与给药、围手术期准备、左侧颈动脉逐步结扎手术操作、术后护理、饮食管理、组织采集以及组织学评估（含油红O染色和Verhoeff-Van Gieson染色）。结果显示，与参考值相比，小鼠循环中的胆固醇和低密度脂蛋白水平显著升高。在左侧结扎的颈动脉处形成明显的动脉粥样硬化斑块，脂质积聚显著增加，且与右侧未结扎的对照动脉相比，动脉内膜-中膜厚度显著增厚。该标准化方案提高了颈动脉斑块形成、进展及干预策略研究的可重复性和可及性，并有助于不同实验室之间对实验性疗法进行比较。

引言

心血管疾病（CVDs）仍是全球死亡的首要原因，而动脉粥样硬化是其共同的病理基础¹颈动脉是动脉粥样硬化病变的关键部位；研究颈动脉粥样硬化对于理解心血管疾病（CVDs）的发病机制及开发治疗策略至关重要²动物模型是不可或缺的研究工具 体内 动脉粥样硬化研究，然而现有模型在便利性以及再现人类病理生理特征方面往往存在局限性。

与其他动脉部位（如主动脉、股动脉）的动脉粥样硬化相比，颈动脉粥样硬化的形成更显著地受到血流动力学的影响。颈动脉承受较高的剪切应力（10–15 dyn/cm²，即每平方厘米达因），仅次于冠状动脉（6–45 dyn/cm²）³。尤其在颈动脉分叉处，会出现涡流，其特征是紊乱且振荡的剪切应力。这种异常的血流动力学环境会引发局部内皮细胞持续的促炎性活化，表现为黏附分子和趋化因子表达上调，从而促进单核细胞募集并启动动脉粥样硬化过程³。此外，人类颈动脉高危粥样硬化病变常表现为狭窄程度超过70%，该值定义为斑块导致的管腔直径减少的百分比⁴。因此，能够诱导严重动脉粥样硬化性狭窄的动物模型具有重要意义。

部分颈动脉结扎（PCL）模型是一种通过持续的血流紊乱诱导的动脉粥样硬化模型，具有建模时间短、病变严重等优点⁵。载脂蛋白E（ApoE）是参与循环中胆固醇和富含甘油三酯的脂蛋白代谢与清除的关键蛋白，在维持血浆脂质稳态中发挥重要作用。然而，传统的使用ApoE基因敲除（ApoE⁻/⁻）小鼠构建的PCL模型制备困难且成本较高⁵。当需要敲除目标基因时，必须同时敲除目标基因和ApoE基因，即进行双基因敲除，这进一步增加了建模的复杂性。相比之下，若仅使用野生型C57BL/6小鼠进行PCL手术，模型缺乏高胆固醇血症这一人类动脉粥样硬化的核心危险因素，极少形成明显的富含脂质的动脉粥样硬化病变^6,7。其他模型，如喂食高脂饮食（HFD）的ApoE⁻/⁻或LDLR基因敲除（LDLR⁻/⁻）小鼠，虽广泛应用于主动脉粥样硬化的研究，但这些模型未能整合血流紊乱的影响，且无法在短时间内形成严重的动脉粥样硬化病变。既往研究表明，在喂食高脂饮食3个月后，ApoE⁻/⁻或LDLR⁻/⁻小鼠仅在主动脉或头臂动脉区域形成轻度动脉粥样硬化斑块，而在颈动脉区域则无明显斑块形成^8,9。

前蛋白转化酶枯草溶菌素/kexin 9型（PCSK9）是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）代谢的关键调控因子：它促进LDL受体的降解，从而升高血清LDL-C水平¹⁰。表达PCSK9的重组腺相关病毒（PCSK9-AAV）可在野生型小鼠中实现剂量可控的高胆固醇血症，且无需进行基因修饰¹¹。将PCSK9-AAV诱导的高胆固醇血症、高脂饮食（HFD，可进一步加重脂质代谢紊乱）以及部分颈动脉结扎术（PCL，可诱导局部血流动力学紊乱）相结合，可构建一种包含人类动脉粥样硬化两个关键危险因素——高胆固醇血症和血流紊乱——的动物模型。

在先前研究进展的基础上¹²，本实验方案建立了在C57BL/6小鼠中诱导颈动脉粥样硬化的标准化方法。与现有的模型方案相比，本方法具有三个关键优势：（1）病理生理相关性：可同时模拟高胆固醇血症和血流紊乱，从而产生与人类中晚期动脉粥样硬化病变特征相似的颈动脉病变；（2）可重复性：对腺相关病毒（AAV）剂量、手术操作和饮食控制等参数进行了详细规定，降低了不同实验室之间的变异；（3）时效性：建模总周期为5周，显著缩短了模型建立所需时间。

本方案适用于研究血管壁生物学、评估抗动脉粥样硬化药物疗效，以及探索动脉粥样硬化中血流动力学与脂质代谢相互作用的研究人员。需要注意的是，本方案为颈动脉聚焦模型，无法完全模拟人类动脉粥样硬化的全部系统性危险因素，包括但不限于吸烟、糖尿病、高血压和肥胖。以下是模型建立与病变评估的逐步操作指南。

方案

所有实验程序均经北京协和医学院动物实验伦理委员会（ACUC-A02-2024-006）批准，并符合《实验动物护理与使用指南》的要求。

1. 实验动物准备

1. 购买6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠（体重：22-25 g）。
2. 将小鼠饲养于严格控制条件的无特定病原体（SPF）环境中：温度（23 ± 1°C）、湿度（50 ± 5%）、12小时光照/黑暗循环（光照时间：07:00-19:00）。
3. 实验前，给予小鼠标准维持饲料（脂肪能量占比10%）和无菌水，自由摄食和饮水，适应环境1周。

2. PCSK9-AAV 的制备与给药

警告：将腺相关病毒（AAV）视为生物安全危害，所有操作均须在适当的机构生物安全等级（通常为BSL-2）下进行。操作时须佩戴双层手套、护目镜及防护服。避免操作过程中产生气溶胶。使用适当的消毒剂（如10%次氯酸钠）对被AAV污染的材料进行去污处理，并遵循明确的责任分工和事故应对规程。所有被病毒污染的废弃物必须通过浸入含氯消毒剂中进行灭活处理。

1. 购买重组PCSK9-AAV（rAAV8-HCRApoE/hAAT-D377Y-mPCSK9）。
2. 通过靶向CMV启动子的定量实时PCR验证AAV滴度：最终滴度为6.10×10¹³ vg/mL（每毫升载体基因组数）。将AAV储存于-80°C，避免反复冻融（≤3次冻融循环）。
3. 将AAV置于冰上解冻15–20分钟，然后轻轻倒置离心管3–5次以混匀（避免涡旋振荡）。
4. 用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）稀释PCSK9-AAV，使终浓度为每只小鼠2×10¹¹ vg/200 µL。
5. 通过尾静脉注射（i.v.）给药：使用可观察静脉的小鼠尾部注射固定装置固定小鼠，用胰岛素注射器缓慢注入200 µL稀释后的AAV（注射速率：10 µL/s）。注射时间点为PCL前1周（图1A）。

3. 颈动脉部分结扎术的术前准备

警告：三溴乙醇为受控试剂，存在过量使用风险。必须严格根据体重给药，避免重复注射，并准确记录给药时间和剂量。应将其存放于上锁容器中，且仅由经过培训的人员进行配制和使用。如怀疑发生过量，应立即启动应急处理并记录事件详情。

1. 通过腹腔注射（i.p.）给予三溴乙醇（2.5% Avertin，0.18 mL/10 g）麻醉小鼠，直至翻正反射消失（约2-3分钟）。随后将小鼠转移至加热垫（37 ± 0.5°C）上，并通过轻捏脚趾检查麻醉效果。
   注意：麻醉对于手术成功至关重要。为降低麻醉风险，应避免多次注射麻醉剂。在开始手术前，应根据预期手术时长确定麻醉剂量。此外，建议每只小鼠的手术时间<30分钟，以减少长时间操作带来的风险。
2. 手术过程中，每5分钟用镊子轻轻夹压后肢足垫，检查小鼠的呼吸频率（正常值：40-60次/分钟）和足底反射。
3. 将脱毛膏均匀涂抹于小鼠颈部腹侧皮肤。2-3分钟后，用棉签清除颈部前方的毛发，并用生理盐水清洗残留毛发。用5%聚维酮碘对暴露的皮肤进行三次消毒。
4. 在无菌动物房的生物安全柜内进行手术。使用紫外线照射对手术区域进行灭菌，尽可能维持无菌环境，并对所有金属器械进行高压灭菌。
   注意：无菌环境和彻底消毒对于确保术后存活率及小鼠生理稳定性至关重要。

4. 颈动脉部分结扎——手术步骤

1. 使用无菌手术剪在小鼠颈部做一正中切口（长度约1.0–1.5 cm）；用钝头镊子分离皮下组织和胸锁乳突肌，暴露左侧颈总动脉（LCCA）。
   注意：手术区域应持续用温热的生理盐水湿润，以防止血管或组织干燥造成额外损伤。
2. 钝性分离左侧颈总动脉与迷走神经（位于动脉旁），避免损伤迷走神经（以免引起呼吸抑制）。
3. 沿左侧颈总动脉向上解剖，暴露颈内动脉（ICA）、颈外动脉（ECA）、枕动脉（OA）和甲状腺上动脉（STA）（图1B）。
4. 使用6-0无菌丝线在甲状腺上动脉上方结扎左侧颈外动脉；然后用另一根6-0无菌丝线同时结扎颈内动脉和枕动脉的根部。
   注意：避免结扎神经及其他周围组织。应完全阻断颈外动脉/颈内动脉/枕动脉的分流血流，同时在左侧颈总动脉中保留一定程度的逆向血流。可通过观察出血/血流情况及远端动脉搏动来评估结扎效果。
5. 检查手术部位有无出血。若发生出血，用无菌棉签轻轻按压30–60秒以止血。使用组织胶或手术缝线缝合皮肤。
   注意：避免过多的组织胶渗入皮下组织。

5. 颈动脉部分结扎术后护理及高脂饮食干预

1. 术后通过腹腔注射0.5 mL温热的生理盐水以补充液体。
2. 手术后立即及术后12小时，通过皮下注射美洛昔康（0.1 mg/kg）缓解疼痛。
3. 将小鼠置于加热的恢复笼中（37°C），直至翻正反射恢复（约15–30分钟）。术后24小时内密切观察小鼠是否出现异常行为（如嗜睡、呼吸困难）。
4. 根据兽医建议，术后给予抗生素以预防感染，例如术后7天内提供含抗生素的饮用水。
5. 使用西式高脂饮食（HFD，脂肪能量占比40%，胆固醇含量1.25%）喂养至病变评估（术后4周）。
   注意：HFD应储存在4°C环境中，以防止脂肪氧化，并在开封后2周内使用完毕。每2天更换一次HFD，以确保饲料新鲜；每日监测小鼠摄食量（正常摄食量：每只小鼠约4–5 g/天）。将HFD喂养与PCSK9-AAV诱导的高胆固醇血症同步，可最大化颈动脉中的脂质沉积；延迟HFD喂养的开始时间将减轻病变严重程度。

6. 样本采集与处理

警告：多聚甲醛会释放有毒蒸气。配制、使用和清除操作必须在化学通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（手套、安全护目镜和实验服）。废液应按照既定的中和程序和化学废液收集规程进行处理。固定剂应根据机构的液体废弃物处置规程进行中和并集中收集。

注意：本研究中的人类颈动脉粥样硬化标本取自接受颈动脉内膜切除术的颈动脉狭窄患者。本研究遵循《赫尔辛基宣言》，并经北京协和医院（PUMCH）机构伦理审查委员会批准（编号：JS-2966）。所有研究参与者均签署了书面知情同意书。

1. 术后4周，通过腹腔注射三溴乙醇麻醉小鼠。
2. 对麻醉后的小鼠进行双侧开胸术，穿刺心脏采集血液样本用于血脂检测。随后以20 mL冰冻磷酸盐缓冲液（PBS）经左心室灌注，以3-6 mL/min的速度冲洗血管内残留血液。观察组织颜色变化，作为判断灌注是否完成的视觉指标。
   注意：若机构伦理或法规允许，可采用其他方法，但必须明确说明并符合当地机构动物护理与使用委员会（IACUC）的要求。动物尸体必须由机构兽医团队或授权承包商按照生物废弃物管理规定，通过焚烧或经批准的生物危害处置程序进行处理。
3. 解剖并取出颈动脉连同心脏，在显微镜下分离双侧颈动脉，并将其置于4%多聚甲醛（PFA）中，4°C固定24小时。
4. 将固定后的颈动脉转移至30%蔗糖溶液（溶于PBS）中，4°C孵育24小时（直至组织沉底）。将动脉包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，并在-80°C保存。
5. 使用冷冻切片机对左侧颈总动脉进行横切，切片厚度为5 µm（切片位置：结扎位点近端1 mm处；切片温度：-20°C ~ -22°C，根据组织含水量微调）。用预冷的细毛刷轻轻将切片转移至冷冻切片机的防卷板上，确保其平整。手持经多聚-L-赖氨酸处理的载玻片，保持接近垂直的角度，缓慢接触切片使其附着。
   注意：灌注步骤对于清除残留血液至关重要，否则将干扰病变染色。动物安乐死后应在30分钟内完成动脉固定，以保持组织形态结构。

7. 动脉粥样硬化病变评估 1 - 油红O染色

1. 将切片在室温（20–25 °C）下空气干燥 30 分钟；浸入 60% 异丙醇中 1 分钟，然后在 Oil Red O 工作液（用 60% 异丙醇按 3:2 稀释）中室温（20–25 °C）孵育 10 分钟。
2. 将玻片完全浸入室温下的 60% 异丙醇中，轻轻振荡约 5–10 秒以去除未结合的染料进行分化；用苏木精染色 30 秒；用自来水冲洗 5 秒（使细胞核变蓝）。
3. 使用玻片扫描仪或光学显微镜（放大倍数为 5x、10x 和 20x）拍摄切片图像；使用 ImageJ 软件（版本 1.54p）对脂质沉积区域进行定量分析——计算 Oil Red O 阳性区域占总内膜面积的百分比。
4. ImageJ 定量分析步骤
   1. 打开图像；选择自由手选择工具手动勾勒出内膜-中膜区域。进入分析 > 工具 > ROI 管理器，点击添加。
   2. 进入图像 > 调整 > 颜色阈值；调节色相和亮度参数以匹配 Oil Red O 阳性区域。点击选择，然后将其添加至 ROI 管理器。
   3. 同时选中内膜-中膜 ROI 和染色 ROI，点击AND，以获得内膜-中膜区域内 Oil Red O 阳性区域。
   4. 点击添加和测量，以计算内膜-中膜区域和 Oil Red O 阳性区域的面积。
   5. 计算公式：
      Oil Red O 面积 (%) = (Oil Red O_阳性_面积 / 内膜_中膜_面积) × 100

8. 动脉粥样硬化病变评估 2 —— Verhoeff Van Gieson 染色

1. 取出包埋在OCT包埋剂中的冷冻切片。
2. 将切片置于室温（20–25°C）蒸馏水中浸泡10–15分钟，期间轻柔振荡2–3次，以彻底溶解OCT包埋剂。
3. 弃去含OCT包埋剂的水，再用新鲜蒸馏水冲洗切片2分钟，以去除残留的OCT包埋剂。
4. 将切片在Verhoeff染液（含苏木精、碘和三氯化铁）中室温（20–25°C）孵育15分钟，孵育过程中轻轻摇动染色架2–3次，确保染色均匀。
5. 用蒸馏水快速冲洗切片两次，每次10秒。
6. 在2%三氯化铁溶液中分化30–60秒；在显微镜下观察，直至弹性纤维呈蓝黑色，背景呈灰色。然后用蒸馏水冲洗两次，每次1分钟。
7. 用5%硫代硫酸钠溶液处理切片1–2分钟，以去除残留的碘。
8. 用蒸馏水冲洗2分钟，然后用Van Gieson染液（酸性品红 + 苦味酸）复染5分钟，使胶原纤维呈鲜红色。
9. 依次在95%乙醇（两次，每次1分钟）和100%乙醇（两次，每次1分钟）中脱水；二甲苯透明5分钟；使用合成树脂封片剂封片。
10. 采集切片图像；使用数字图像分析软件，通过长度测量工具，在四个方向（前、后、左、右）测量斑块的内膜-中膜厚度或内膜厚度，然后计算平均值。
    1. 打开切片图像，放大至目标血管横截面，点击测量工具。
    2. 依次点击前、后、左、右方向的内膜内缘和内膜/中膜外缘，记录四个厚度值。
    3. 计算平均值并记录测量结果。
       ​平均值 = (前 + 后 + 左 + 右) ÷ 4

结果

油红O染色结果显示，结扎侧动脉出现严重的动脉粥样硬化斑块形成，伴有明显的脂质核心和坏死区域。左侧颈动脉的脂质区域比例显著高于右侧颈动脉对照组（p < 0.001）（图2A）。VVG染色显示内膜弹性纤维破坏或消失，并伴有斑块内膜显著增厚。与右侧颈动脉对照组相比，左侧颈动脉的内膜-中膜厚度（IMT）和内膜厚度（IT）均显著增加（p < 0.001）（图2B）。这些结果表明，PCL+PCSK9 AAV+HFD模型（图2A、2B中的RCA组）可诱导产生类似于人类颈动脉的中至重度动脉粥样硬化斑块（图2C），并形成类似的脂质核心或坏死区域。脂质分析显示总胆固醇和低密度脂蛋白水平显著升高（图2D），表明PCSK9-AAV可在较短时间内（1个月）诱导明显的高脂血症。

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讨论

本方案描述了一种通过结合PCSK9-AAV诱导的高胆固醇血症、高脂饮食（HFD）以及颈总动脉部分结扎（PCL），在C57BL/6小鼠中建立颈动脉粥样硬化模型的标准化方法。

与传统的ApoE -/- 或 LDLR-/- 模型，以及使用野生型小鼠的PCL模型相比⁵，该模型在动脉粥样硬化研究中具有独特优势。首先，通过给予小鼠PCSK9-AAV并喂食高脂饮食（HFD）以诱导高胆固醇血症，同时实施PCL手术以在颈动脉中产生紊乱的血流；这两者是人类颈动脉粥样硬化的两个最重要危险因素。病变从早期脂质沉积发展为中等程度的内膜增厚，并伴有巨噬细胞浸润和大量脂质沉积，这一进程与人类病变的发展高度相似¹²。其次，PCSK9-AAV可在无需基因修饰的情况下实现持续高胆固醇血症（可持续超过12周），具有操作快速、高效的优势。此外，该模型可灵活应用于动脉粥样硬化研究的多个领域，例如通过使用转基因小鼠研究特定基因的功能、在HFD喂养期间评估抗动脉粥样硬化药物的疗效...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-0 无菌尼龙缝线	金环医疗	F602	NA
C57BL/6小鼠	上海南方模式生物中心股份有限公司 (SMOC)	SM-001	NA
周饮食	协同生物	No. XT93G	NA
冷冻切片机	Leica	CM1950	NA
脱毛膏	维特	RB Health LLC	NA
高脂饮食	协同生物	XT108c	NA
OCT	樱花	4582	NA
油红O溶液	赛维尔生物	G1017-100mL	NA
光学显微镜	Leica	DM4B	NA
多聚甲醛	Servicebio	G1101-500mL	NA
PCSK9-AAV	WZBioscience	AV208001-AV8	NA
多聚-L-赖氨酸包被载玻片	Sigma	P0425	NA
切片扫描仪	3DHISTECH	Pannoramic SCAN	NA
磺胺甲噁唑	Selleck	S1915	NA
组织粘合剂	3M Vetbond	1469SB	NA
静脉可视化小鼠尾部注射固定装置	济南易研科学 &科技发展有限公司	YLS-Q9G	NA