一种通过颈动脉部分结扎与PCSK9过表达联合诱导的小鼠动脉粥样硬化模型

摘要

通过结合PCSK9腺相关病毒（PCSK9-AAV）诱导的高脂饮食高胆固醇血症与左侧颈动脉部分结扎术（PCL），建立了一种可重复的小鼠模型，可模拟人类病理生理过程。该模型无需基因组编辑即可在野生型小鼠中快速诱导出类似人类的颈动脉粥样硬化病变，为颈动脉粥样硬化研究提供了一种标准化工具。

摘要

在野生型小鼠中缺乏快速且可重复的颈动脉特异性动脉粥样硬化模型，限制了斑块生物学及治疗策略的转化研究。本方案描述了一种无需基因组编辑、时间效率高的方法，通过联合使用腺相关病毒（AAV）介导的PCSK9过表达、致动脉粥样硬化高脂饮食以及左侧部分颈动脉结扎（PCL），在C57BL/6小鼠中诱导出可重复的颈动脉动脉粥样硬化。该方法旨在提供一种标准化操作流程，以在无需转基因动物的前提下，重现人类颈动脉疾病的关键病理生理特征——高脂血症与紊乱血流。本方案包括PCSK9-AAV的剂量与给药、围手术期准备、左侧颈动脉逐步结扎手术操作、术后护理、饮食管理、组织采集以及组织学评估（含油红O染色和Verhoeff-Van Gieson染色）。结果显示，与参考值相比，小鼠循环中的胆固醇和低密度脂蛋白水平显著升高。在左侧结扎的颈动脉处形成明显的动脉粥样硬化斑块，脂质积聚显著增加，且与右侧未结扎的对照动脉相比，动脉内膜-中膜厚度显著增厚。该标准化方案提高了颈动脉斑块形成、进展及干预策略研究的可重复性和可及性，并有助于不同实验室之间对实验性疗法进行比较。

引言

心血管疾病（CVDs）仍是全球死亡的首要原因，而动脉粥样硬化是其共同的病理基础¹颈动脉是动脉粥样硬化病变的关键部位；研究颈动脉粥样硬化对于理解心血管疾病（CVDs）的发病机制及开发治疗策略至关重要²动物模型是不可或缺的研究工具 体内 动脉粥样硬化研究，然而现有模型在便利性以及再现人类病理生理特征方面往往存在局限性。

与其他动脉部位（如主动脉、股动脉）的动脉粥样硬化相比，颈动脉粥样硬化的形成更显著地受到血流动力学的影响。颈动脉承受较高的剪切应力（10–15 dyn/cm²，即每平方厘米达因），仅次于冠状动脉（6–45 dyn/cm²）³。尤其在颈动脉分叉处，会出现涡流，其特征是紊乱且振荡的剪切应力。这种异常的血流动力学环境会引发局部内皮细胞持续的促炎性活化，表现为黏附分子和趋化因子表达上调，从而促进单核细胞募集并启动动脉粥样硬化过程³。此外，人类颈动脉高危粥样硬化病变常表现为狭窄程度超过70%，该值定义为斑块导致的管腔直径减少的百分比⁴。因此，能够诱导严重动脉粥样硬化性狭窄的动物模型具有重要意义。

部分颈动脉结扎（PCL）模型是一种通过持续的血流紊乱诱导的动脉粥样硬化模....

方案

所有实验程序均经北京协和医学院动物实验伦理委员会（ACUC-A02-2024-006）批准，并符合《实验动物护理与使用指南》的要求。

1. 实验动物准备

1. 购买6-8周龄的雄性C57BL/6小鼠（体重：22-25 g）。
2. 将小鼠饲养于严格控制条件的无特定病原体（SPF）环境中：温度（23 ± 1°C）、湿度（50 ± 5%）、12小时光照/黑暗循环（光照时间：07:00-19:00）。
3. 实验前，给予小鼠标准维持饲料（脂肪能量占比10%）和无菌水，自由摄食和饮水，适应环境1周。

2. PCSK9-AAV 的制备与给药

警告：将腺相关病毒（AAV）视为生物安全危害，所有操作均须在适当的机构生物安全等级（通常为BSL-2）下进行。操作时须佩戴双层手套、护目镜及防护服。避免操作过程中产生气溶胶。使用适当的消毒剂（如10%次氯酸钠）对被AAV污染的材料进行去污处理，并遵循明确的责任分工和事故应对规程。所有被病毒污染的废弃物必须通过浸入含氯消毒剂中进行灭活处理。

1. 购买重组PCSK9-AAV（rAAV8-HCRApoE/hAAT-D377Y-mPCSK9）。
2. 通过靶向CMV启动子的定量实时PCR验证AAV滴度：最终滴度为6.1....

结果

油红O染色结果显示，结扎侧动脉出现严重的动脉粥样硬化斑块形成，伴有明显的脂质核心和坏死区域。左侧颈动脉的脂质区域比例显著高于右侧颈动脉对照组（p < 0.001）（图2A）。VVG染色显示内膜弹性纤维破坏或消失，并伴有斑块内膜显著增厚。与右侧颈动脉对照组相比，左侧颈动脉的内膜-中膜厚度（IMT）和内膜厚度（IT）均显著增加（p < 0.001）（图2B）。这些结果表明，PCL+PCSK9 AAV+HFD模型（图2A、2B中的RCA组）可诱导产生类似于人类颈动脉的中至重度动脉粥样硬化斑块（图2C），并形成类似的脂质核心或坏死区域。脂质分析显示总胆固醇和低密度脂蛋白水平显著升高（图2D），表明PCSK9-AAV可在较短时间内（1个月）诱导明显的高脂血症。

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讨论

本方案描述了一种通过结合PCSK9-AAV诱导的高胆固醇血症、高脂饮食（HFD）以及颈总动脉部分结扎（PCL），在C57BL/6小鼠中建立颈动脉粥样硬化模型的标准化方法。

与传统的ApoE -/- 或 LDLR-/- 模型，以及使用野生型小鼠的PCL模型相比⁵，该模型在动脉粥样硬化研究中具有独特优势。首先，通过给予小鼠PCSK9-AAV并喂食高脂饮食（HFD）以诱导高胆固醇血症，同时实施PCL手术以在颈动脉中产生紊乱的血流；这两者是人类颈动脉粥样硬化的两个最重要危险因素。病变从早期脂质沉积发展为中等程度的内膜增厚，并伴有巨噬细胞浸润和大量脂质沉积，这一进程与人类病变的发展高度相似¹²。其次，PCSK9-AAV可在无需基因修饰的情况下实现持续高胆固醇血症（可持续超过12周），具有操作快速、高效的优势。此外，该模型可灵活应用于动脉粥样硬化研究的多个领域，例如通过使用转基因小鼠研究特定基因的功能、在HFD喂养期间评估抗动脉粥样硬化药物的疗效.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
6-0 无菌尼龙缝线	金环医疗	F602	NA
C57BL/6小鼠	上海南方模式生物中心股份有限公司 (SMOC)	SM-001	NA
周饮食	协同生物	No. XT93G	NA
冷冻切片机	Leica	CM1950	NA
脱毛膏	维特	RB Health LLC	NA
高脂饮食	协同生物	XT108c	NA
OCT	樱花	4582	NA
油红O溶液	赛维尔生物	G1017-100mL	NA
光学显微镜	Leica	DM4B	NA
多聚甲醛	Servicebio	G1101-500mL	NA
PCSK9-AAV	WZBioscience	AV208001-AV8	NA
多聚-L-赖氨酸包被载玻片	Sigma	P0425	NA
切片扫描仪	3DHISTECH	Pannoramic SCAN	NA
磺胺甲噁唑	Selleck	S1915	NA
组织粘合剂	3M Vetbond	1469SB	NA
静脉可视化小鼠尾部注射固定装置	济南易研科学 &科技发展有限公司	YLS-Q9G	NA