开发高效的小鼠组织扩展模型以用于皮肤再生研究

摘要

本研究提出了一种实用高效的方法，用于在大鼠中建立连续组织扩展模型，从而促进了皮肤再生机制的研究和技术的进步。

摘要

皮肤再生对于各种表浅伤口的愈合至关重要，可以通过机械刺激促进。组织扩张是一种广泛使用的策略，通过受控的机械拉伸加速皮肤再生;然而，其临床疗效常受限于机械负荷与皮肤再生能力之间的不匹配。为解决这一限制，迫切需要开发标准化的动物组织扩展模型。本研究中，我们在Sprague-Dawley大鼠中建立了组织扩展模型。手术后，背侧植入10毫升组织扩宽器后，立即注射5毫升生理盐水。经过两周的恢复期后，动物接受了每周两次生理盐水注射（每次10毫升）的治疗方案。膨胀动力学表现出快速皮肤生长后逐渐减缓的典型趋势。在后期阶段，观察到严重并发症，如皮肤坏死、组织分解和扩张器暴露。这项工作建立了一个可重复的临床前框架，紧密模拟人体组织扩张的生理和病理过程，为研究再生机制和优化临床方案提供了基础模型。

引言

皮肤是身体的第一道防线，提供机械保护并防止水分流失，同时在体温调节、外部刺激反应和免疫调节中也发挥关键^作用。皮肤伤口在临床实践中很常见，通常由创伤、微生物感染、化学损伤和^{外科切除引起}。虽然小伤口可以恢复正常外观，但大伤通常会留下严重的纤维化瘢痕，损害组织功能，甚至可能危及生命。自身全层皮肤移植被广泛认为管理大面积伤口和预防瘢痕的黄金标准。然而，获得足够可粘附的皮肤仍是一个关键的临床挑战。因此，创新皮肤再生技术的发展已成为再生医学和^{生物材料领域}的核心关注点。

自1957年诺伊曼首次引入组织扩张原理，通过在耳后乳突区域植入聚乙烯气球重建耳畸形^以来，这一技术已有显著发展。如今，它是重建手术中最广泛采用的方法之一，仍然是治疗广泛皮肤缺陷的重要方法。具体来说，组织扩增通过招募邻近皮肤并刺激再生，产生额外的自身组织⁷。在机械刺激驱动下，新形成的皮肤在外观和结构上与原生皮肤极为相似，非常适合临床应用⁸。然而，由于载荷力大小与晚期皮肤生长速率不匹配，采集皮肤的数量不足以覆盖大规模伤口^9。此外，组织扩增技术的进步受到扩张效能不佳、严重并发症、定量评估指标不完整以及分子机制描述不充分的阻碍¹⁰.鉴于 体内调控网络的复杂性，合适的动物组织扩展模型对于忠实复现皮肤组织对机械刺激的生理和病理反应至关重要。

目前，小鼠（小鼠和大鼠）和猪模型是体内研究的主要选择¹¹。由于作简便，鼠背侧或头皮膨胀模型被广泛使用;然而，皮肤过薄，无法耐受长时间或持续的扩张¹²。由于大鼠背膨胀模型具有广泛的皮下空间，适合连续扩张，但由于缺乏明确的终止扩张方案，其临床应用受限（^13,14）。尽管猪皮与人类皮肤的同源性最高，但其较低的弹性导致对机械拉伸的反应延迟，且过程中需要深度镇静，使实验作更具挑战性¹⁵。因此，开发一个模拟临床过程的适当连续扩展模型仍是科学上的一大挑战。

本研究旨在建立一个持续皮肤扩张的大鼠模型。手术后，在Sprague-Dawley（SD）大鼠的背部区域插入10毫升硅胶扩孔器，并立即注射5毫升生理盐水。经过两周恢复期后，每周两次注射10毫升生理盐水，累计容量达到155毫升，此时观察到皮肤生成显著下降，表明再生能力已耗尽。再生性耗竭意味着皮肤再生能力的严重下降，在细胞层面表现为增殖潜力减弱和细胞外基质的^分解。宏观上，这表现为皮肤质地明显恶化，表现为皮肤变薄、缺血和张紧纹状体，可能进展为坏死和^{组织分解。}除了技术上的简单性外，该临床前模型还成功复制了连续的皮肤扩张，使研究人员能够根据特定研究目标研究不同的扩展阶段进行研究。这种建模方法也可以应用于转基因大鼠，有助于阐明关键基因功能，从而揭示其背后的机制。此外，背皮的充足表面积便于自控研究设计，使实验性和对照治疗都能^{在同一动物体内}进行。总体而言，该模型为研究组织扩展的特定机制提供了有用工具，有助于克服当前技术局限。

方案

所有动物手术均经上海第九人民医院伦理委员会批准（编号SH9H-2025-A1673-1）以及根据美国国立卫生研究院实验动物护理与使用指南进行。

1. 准备

1. 在研究前，让所有SD大鼠适应7天。把SD老鼠关在动物设施里，周期为12小时光明，12小时黑暗。在整个 实验过程中， 提供标准的小麦/大豆基饮食和水。
2. 设计10毫升半圆形组织扩张器用于实验用途（见图1A），包括一个可扩展的球囊、一个注射口和一个结缔导管。使用电子束照射（25 kGy）消毒膨胀器。手术前，检查每个扩弓器的完整性以确保安全。通过注射口注入10毫升生理盐水，然后观察导管通畅度和扩张情况，以确认无漏水。
   注意：将预注射的生理盐水排干。

2. 术前及术中动物护理

1. 获得雄性SD大鼠，6-8周龄，体重240-260克。
2. 通过吸入异氟醚对SD大鼠进行麻醉。将大鼠放入诱导舱，并以3升/分钟流量使用5%异氟醚诱导麻醉。手术期间使用2%异氟醚，流量1.5升/分钟维持麻醉。
3. 麻醉后的SD大鼠在手术期间保持保温，麻醉恢复后将其放在加热垫（约28°C）上20分钟，以防止体温过低。
4. 利用脚趾夹住的撤退反射来评估麻醉深度。
   注意：监测麻醉服务犬大鼠的呼吸频率和模式、体温以及脚趾皮肤颜色。

3. 组织扩张器植入

1. 用理发器刮除SD鼠的背部皮肤。评估皮肤颜色、质地及病变的存在，以判断是否适合扩张。
2. 在背部中央画一条水平虚线，标记切口位置。用75%酒精消毒剃须区域，并用无菌的开口布覆盖。
3. 沿标记线皮下注射生理盐水，使用1毫升注射器，针头直径30克（0.31毫米），然后用手术刀进行水平切口。对切口上方和下方的皮下组织进行广泛剥离，沿着背侧肌筋膜进行。用蚊子钳制造一个足够大的口袋，容纳膨胀气球和注射口。将膨胀气囊的下极放置在切口3-5厘米处，顶端朝向皮肤层，底板则放在肌肉上。此外，在连接导管与注射口连接处相邻的筋膜两侧缝合，以稳定导管口。调整球囊和注射口的位置，确保连接管无明显弯曲或弯曲（图1B）。
   注意：生理盐水注射有助于皮肤切口和解剖平面识别。将注射口的软面朝向皮肤层，以便后续溶液注射。
4. 用断续的4-0缝线闭合切口。随后，用直径25克（0.5毫米）的头皮针头注射初始5毫升生理盐水。
   注意：缝合切口时要小心，避免用缝针尖刺穿扩张器。将头皮针垂直插入注射口，然后垂直抽出。
5. 让SD大鼠从麻醉中恢复，然后将其放入单独的笼子中。

4. 连续膨胀过程

1. 允许携带扩张器的SD大鼠恢复2周，确保切口完全愈合。在扩展区标记一个2.5×2.5厘米的虚线框，便于观察皮肤变化（见图2A）。
2. 使用步骤2.2至2.4中描述的方法对SD大鼠进行麻醉。削减膨胀区域以便观察。如果皮肤扩张因感染、皮疹或坏死而复杂，应立即终止扩张手术。
   注意：每周至少剃一次扩展区域，以适应快速的毛发生长。
3. 剃净注射口周围区域，并用75%酒精消毒。修复输液口，然后用25克头皮针慢慢注射10毫升生理盐水。用无菌纱布按压注射点2分钟以确认止血。
4. 让SD大鼠从麻醉中恢复，将其放置在加热垫上20分钟，然后转移到单独的笼子中。
5. 每周注射两次生理盐水。随访期间监测扩张相关并发症，包括扩张器漏液、连接管弯曲、扩张器暴露、皮肤赤皮、坏死、感染及分解（见图2E）。如果生理盐水注射时遇到阻力，调查导管可能出现的弯曲。如果膨胀气球变软，怀疑是膨胀器泄漏。将局部性皮脓症识别为灌注受损的信号，皮肤变暗为坏死。观察到明显局部发红、肿胀及局部皮肤温度升高，怀疑感染。将未愈合的伤口归类为皮肤损伤，并检查是否暴露于扩张剂。
   注意：每次注射前后检查肿大的皮肤，以便及早发现不良事件。如果出现严重并发症，包括扩张器渗漏、皮肤损坏或坏死，以及暴露于扩张器，应立即终止扩张手术，以最大化活细胞的挽救。

5. 膨胀面积测量与再生皮肤采集

1. 使用高精度三维扫描仪测量膨胀面积。通过扫描扩展器上方的皮肤，自动计算扫描区域的表面积（图2B）。
   注意：每次注射前对麻醉后的SD大鼠进行扫描。
2. 用数码相机拍摄膨胀的皮肤;测量并称重虚线框划定的面积，记录表面积（图2C）和质量（图2D）的变化。
3. 在实验结束时，通过暴露于过量二氧化碳来安乐死服务德兰大鼠。
   注意：在本研究中，终点定义为总注射体积为155毫升，以在临床实践中复制整个扩增过程。
4. 尸检时，在扩张的皮肤和相邻的正常皮肤上标记采样区域。从扩弓器抽取一半总体积后，用剪刀横切注射口覆盖的皮肤。使用蚊式镊子广泛切除扩张器与扩张皮肤之间的平面，以便完全完整地取出扩张器。用剪刀切除皮肤样本并对组织进行两半切割。用4%的对甲醛溶液定型，进行组织染色。
   注意：在取出扩弓前，应划定取样关注区域，以防止因皮肤回撤导致误认，确保准确识别局部治疗区域（见图3A）。
5. 将收集的动物尸体单独放入黄色医疗废物袋中。将用过的扩孔器、注射器和纱布装入黄色医疗废物袋中处理。将刀片、针头和其他锐器丢入指定的锐器容器中。
   注：本研究中所有废弃物处理均符合上海第九人民医院实验动物中心管理规定。

6. 皮肤组织学染色

1. 将皮肤样本嵌入石蜡中，切成5微米切片，放置于粘性载玻片上。
2. 使用血液素和伊红染色（HE染色）评估皮肤厚度（图3B，C），使用马森三色染色评估胶原沉积（图3D，E）。使用整片扫描仪扫描切片，并使用ImageJ 1.54版软件进行分析。
3. 使用CD31免疫荧光染色来评估血管形成。应用初级抗体并在4°C下过夜培养，使用FITC结合的二级抗体，然后在荧光显微镜下观察（见图3F，G）。
4. 使用GraphPad Prism 10.0版软件分析定量数据，并以均值±标准差（SD）形式呈现结果。使用学生t检验进行统计比较，统计显著性定义为 *p < 0.05。

结果

本研究建立了连续组织扩展模型的标准方案。确认扩张器安全性后（见图1A），手术将扩弓器植入SD大鼠背部区域。其充气表面朝向皮肤。为防止扩张器移位，导管与注射口之间的连接点被固定在肌肉筋膜上（见图1B）。在每周两次生理盐水注射后，记录了皮肤逐渐扩张的过程（见图2A）。随着注射量增加，肿大的皮肤逐渐生长，这一点从虚线盒内区域的扩大和皮肤逐渐变薄可见一斑。所有SD大鼠扩展面积的变化和标记表面积的变化都证实了皮肤再生表现出双相模式，初期快速阶段随后减缓（图2B，C）。标记区域的皮肤重量在155毫升输注时显著高于45毫升时（见图2D）。该大鼠模型还观察到严重的晚期并发症，如皮肤坏死和皮肤分解（见图2E）。这些结果表明，这种连续组织扩展模型有效模拟了临床组织扩展过...

讨论

组织扩张已成为一种广泛使用的技术，用于生成在质地^和颜色上与邻近健康皮肤相似的额外皮肤。它已应用于多种临床疾病，包括疤痕修复、乳房重建以及体表肿瘤切除后的重建²⁰。然而，长期组织扩张仍是一个关键挑战，主要由于皮肤^{再生能力耗}竭。缺乏合适的动物模型阻碍了对其潜在机制的探索。因此，我们建立了连续组织扩增模型，其高度模拟临床长期组织扩增，并展现出高稳定性和可重复性。

C57BL/6小鼠和SD大鼠是组织扩增研究中常用的动物模型。鉴于小鼠和大鼠皮肤特征^相似，老鼠因其皮肤组织更丰富而被优先考虑。与C57BL/6小鼠相比，SD大鼠表现出更温顺的性格，并对长期重复的实验程序具有更高的耐受性。头皮²³ 和背²⁴ 均有发表文章报道为扩张器植入部位。尽管头皮...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD31抗体	雅康上海贸易有限公司	AB182981	IHC染色
电子束照射仪	通威新达科技（江苏）有限公司。有限公司	高能电子加速器（10 MeV，24 kW）	绝育
FITC结合二抗抗体	蛋白质科技集团公司	SA0003-2	IHC染色
Graghpad Prism 软件及nbsp;	GraphPad 软件	版本 10.0	统计分析
血液素和嗜氨酸染色套件	碧约时生物科技公司	C0105S	组织学染色
高精度三维扫描仪	闪耀3D	EinScan Pro 2X V2	面积测量
Image J 软件	美国国立卫生研究院	版本 1.54	统计分析
马松三色染色套件	碧约时生物科技公司	C0189S	组织学染色
组织扩宽器	上海温纳整形外科产品有限公司	无	特殊定制