开发一种用于皮肤再生研究的高效小鼠组织扩张模型

摘要

本研究提出了一种在大鼠中建立连续组织扩张模型的实用且高效的实验方案，从而促进皮肤再生机制的研究和技术进步。

摘要

皮肤再生对于各种浅表伤口的愈合至关重要，并可通过机械刺激得以促进。组织扩张是一种通过可控的机械牵张来加速皮肤再生的常用策略；然而，其临床疗效常受限于机械负荷与皮肤再生能力之间的不匹配。为解决这一局限性，迫切需要建立标准化的组织扩张动物模型。在本研究中，我们建立了Sprague-Dawley大鼠的组织扩张模型。在背部植入一个10 mL的组织扩张器后，术后立即注入5 mL生理盐水。经过两周的恢复期后，动物接受每周两次的生理盐水注射方案（每次10 mL）。扩张动力学表现出典型的特征：皮肤快速生长后逐渐减缓。在后期阶段，观察到严重的并发症，如皮肤坏死、组织破裂和扩张器暴露。本研究建立了一个可重复的临床前研究框架，能够紧密模拟人体组织扩张的生理和病理过程，为研究再生机制及优化临床方案提供了基础模型。

引言

皮肤是机体的第一道防线，提供机械保护并防止水分流失，同时在体温调节、对外界刺激的反应以及免疫调节中发挥关键作用¹。临床上，皮肤创伤十分常见，可由外伤、微生物感染、化学损伤和手术切除引起²。小面积伤口通常可愈合并恢复正常的外观，但大面积损伤往往会导致严重的纤维化瘢痕，损害组织功能，甚至可能危及生命³。自体全层皮片移植被广泛认为是处理大面积创面、预防瘢痕形成的金标准⁴。然而，获取足够量的可移植皮肤仍是临床面临的重要挑战。因此，开发创新的皮肤再生技术已成为再生医学和生物材料领域研究的核心方向⁵。

自1957年Neumann首次提出组织扩张原理以来，通过在耳后乳突区植入聚乙烯气囊以修复耳部畸形⁶该技术已得到显著发展。如今，它已成为重建外科中最广泛应用的方法之一，仍是修复大面积皮肤缺损的重要手段。具体而言，组织扩张通过动员邻近皮肤并刺激其再生，从而产生额外的自体组织⁷在机械刺激的驱动下，新形成的皮肤在外观和结构上均与天然皮肤高度相似，因此非常适合临床应用⁸然而，由于在后期加载力的大小与皮肤生长速率之间存在不匹配，所获取的皮肤量不足以覆盖大面积创面。⁹此外，组织扩张技术的发展受到扩张效果欠佳、并发症严重、定量评估指标不完善以及分子机制研究不足的限制。¹⁰. 鉴于调控网络的复杂性 体内因此，建立合适的组织扩张动物模型对于真实再现皮肤组织对机械刺激的生理和病理反应至关重要。

目前，小鼠和大鼠以及猪模型是主要的选择 体内 研究¹¹小鼠背部或头皮扩张模型因操作简便而被广泛应用；然而，其皮肤过薄，难以耐受长时间或持续的扩张。¹²大鼠背部扩张模型因其具有较大的皮下空间，适用于持续扩张，但缺乏明确的扩张终止方案，限制了其临床应用。^13,14尽管猪皮肤与人类皮肤具有最高的同源性，但其弹性较低，导致对机械拉伸的响应延迟，且在操作过程中需要深度镇静，使得实验操作变得相当困难。¹⁵因此，建立一种能够模拟临床过程的连续扩增适当模型仍然是一个科学难题。

本研究旨在建立一种大鼠持续皮肤扩张的动物模型。简言之，将一个10 mL的硅胶扩张器植入Sprague-Dawley（SD）大鼠的背部区域，术后立即注入5 mL生理盐水。经过两周的恢复期后，每周两次注入10 mL生理盐水，直至累计注入量达到155 mL；此时观察到皮肤新生能力显著下降，提示再生能力已趋于耗竭。再生能力耗竭是指皮肤再生能力发生关键性衰退，在细胞水平上表现为增殖潜能降低以及细胞外基质的破坏¹⁶。宏观上，这种状态表现为皮肤质地明显恶化，出现皮肤变薄、缺血及膨胀纹，严重时可进展为坏死和组织崩解¹⁷。该模型不仅技术操作简便，而且成功模拟了持续皮肤扩张过程，使研究人员能够根据特定研究目标探究不同扩张阶段的生物学变化。此外，该建模方法还可应用于基因修饰大鼠，有助于阐明关键基因的功能，进而揭示其潜在作用机制。同时，背部皮肤具有较大的表面积，便于采用自身对照的研究设计，可在同一只动物体内同时实施实验处理与对照处理¹⁸。综上所述，该模型为深入研究组织扩张过程中的特定机制提供了有力工具，并有助于突破当前技术瓶颈。

方案

所有动物实验均经上海第九人民医院伦理委员会批准（编号：SH9H-2025-A1673-1），并依照美国国立卫生研究院《实验动物护理与使用指南》进行。

1. 准备

1. 实验前将所有SD大鼠适应性饲养7天。将SD大鼠饲养在12小时光照/12小时黑暗循环的动物设施中，并提供标准的小麦/大豆基础饲料和饮水 随意摄取 在整个实验过程中。
2. 设计用于实验的10 mL半圆形组织扩张器（图1A），包括可扩张球囊、注射端口和连接导管。使用电子束辐照（25 kGy）对扩张器进行灭菌。手术前，检查每个扩张器的完整性以确保安全。通过注射端口注入10 mL生理盐水，观察连接导管的通畅性及扩张情况，确认无液体渗漏。
   注意：排出预先注入的生理盐水。

2. 术前和术中动物护理

1. 选取6至8周龄、体重240至260 g的雄性SD大鼠。
2. 通过吸入异氟烷对SD大鼠进行麻醉。将大鼠放入诱导室，以3 L/min的气流使用5%异氟烷诱导麻醉。手术过程中以1.5 L/min的气流使用2%异氟烷维持麻醉状态。
3. 将麻醉后的SD大鼠置于棉垫上以在手术期间保持体温，并在麻醉恢复后将其置于加热垫（约28 ℃）上20分钟，以防止低体温。
4. 采用足趾夹捏回缩反射评估麻醉深度。
   注意：监测麻醉状态下SD大鼠的呼吸频率与呼吸模式、体温以及足趾皮肤颜色。

3. 组织扩张器植入

1. 使用毛发修剪器剃除SD大鼠背部的皮肤毛发。评估皮肤颜色、质地以及是否存在任何病变，以确定是否适合进行扩张。
2. 在背部中央区域画一条水平虚线，标记切口位置。用75%酒精对剃毛区域进行消毒，并覆盖无菌洞巾。
3. 使用1 mL注射器（配30 G（直径0.31 mm）针头）沿标记线皮下注射生理盐水，然后用手术刀做水平切口。沿背部肌筋膜在切口上下方广泛分离皮下组织。使用蚊式钳创建一个足够大的腔隙，以容纳扩张气囊和注射端口。将扩张气囊的下极置于距离切口3–5 cm处，尖端朝向皮层，基板置于肌肉上。此外，缝合连接导管与注射端口交界处两侧的筋膜，以固定端口。调整气囊和注射端口的位置，确保连接管无锐角弯曲或折叠（图1B）。
   注意：皮下注射生理盐水有助于切口操作及解剖平面的识别。放置注射端口时应使其柔软面朝向皮层，以便后续注射溶液。
4. 使用间断的4-0缝线关闭切口。随后，用25 G（直径0.5 mm）头皮针注入初始5 mL生理盐水。
   注意：缝合切口时应小心操作，避免缝合针尖刺破扩张器。将头皮针垂直插入注射端口，并垂直拔出。
5. 让SD大鼠从麻醉中恢复，并将其放入单独的笼子中。

4. 连续扩增过程

1. 让携带扩张器的SD大鼠恢复2周，确保切口完全愈合。在扩张区域标记一个2.5 × 2.5 cm的虚线框，以方便观察皮肤变化（图2A）。
2. 采用2.2至2.4步骤所述方法对SD大鼠进行麻醉。剃除扩张区域的毛发以方便观察。若皮肤扩张过程中出现感染、瘀斑或坏死，应立即终止扩张操作。
   注意：由于毛发生长迅速，至少每周剃毛一次。
3. 剃除注射口周围的毛发，并用75%酒精消毒。固定注射口后，使用25 G头皮针缓慢注入10 mL生理盐水。用无菌纱布按压注射点2分钟，确认止血。
4. 让SD大鼠从麻醉中恢复，将其置于加热垫上20分钟，然后转移至单独的笼子中。
5. 每周注射生理盐水两次。随访期间监测与扩张相关的并发症，包括扩张器渗漏、连接管扭曲、扩张器外露、皮肤瘀斑、坏死、感染和皮肤破损（图2E）。若生理盐水注射时遇到阻力，应排查导管扭曲的可能。若扩张球囊变软，提示可能存在扩张器渗漏。局部瘀斑提示灌注不良，皮肤变暗提示发生坏死。若观察到明显的局部红肿及皮肤温度升高，应怀疑感染。将无法愈合的伤口归类为皮肤破损，并检查是否存在扩张器外露。
   注意：每次注射前后均应检查扩张后的皮肤，以便早期发现不良事件。若出现严重并发症，包括扩张器渗漏、皮肤破损或坏死、扩张器外露，应立即终止扩张操作，以最大限度保留可存活的皮肤。

5. 扩张区域测量与再生皮肤采集

1. 使用高精度3D扫描仪测量扩张区域。通过扫描扩张器上方的皮肤，系统可自动计算扫描区域的表面积（图2B）。
   注意：每次注射前，对麻醉状态下的SD大鼠进行扫描。
2. 使用数码相机拍摄扩张后的皮肤；测量并称量虚线框内区域，记录表面积（图2C）和质量（图2D）的变化。
3. 实验终点时，通过过量二氧化碳暴露处死SD大鼠。
   注意：本研究中，将终点定义为总注射量达到155 mL，以模拟临床实践中的完整扩张过程。
4. 死后解剖时，在扩张皮肤和邻近正常皮肤上标记取样区域。从扩张器中吸出一半总体积液体后，用剪刀在注射口上方水平切开皮肤。使用蚊式钳广泛分离扩张器与扩张皮肤之间的组织平面，以完整、无损地取出扩张器。用剪刀切除皮肤样本，并将组织一分为二。将其固定于4%多聚甲醛溶液中，进行组织学染色处理。
   注意：在取出扩张器前，预先标记感兴趣的取样区域，以防止因皮肤回缩导致误判，确保准确定位局部处理区域（图3A）。
5. 将收集的动物尸体分别放入黄色医疗废物袋中。使用过的扩张器、注射器和纱布也放入黄色医疗废物袋中。刀片、针头及其他锐器应丢弃至指定的锐器容器中。
   注意：本研究中所有废弃物处理均遵守上海第九人民医院实验动物中心的管理规定。

6. 皮肤组织学染色

1. 将皮肤样本包埋于石蜡中，切成5 µm切片，并置于粘附性载玻片上。
2. 采用苏木精-伊红染色（HE染色）评估皮肤厚度（图3B、C），采用Masson三色染色评估胶原沉积（图3D、E）。使用全切片扫描仪扫描切片，并用ImageJ 1.54版软件进行分析。
3. 采用CD31免疫荧光染色评估血管化。加入一抗，于4 °C孵育过夜，使用FITC标记的二抗，然后在荧光显微镜下观察（图3F、G）。
4. 使用GraphPad Prism 10.0版软件进行定量数据分析，结果以均值±标准差（SD）表示。采用Student t检验进行统计学比较，以*p < 0.05定义为具有统计学显著性。

结果

本研究建立了一种连续组织扩张模型的标准操作流程。在确认扩张器的安全性后（图1A），将其通过手术皮下植入SD大鼠背部区域，扩张面朝向皮肤。为防止扩张器移位，将导管与注射端口的连接处固定于肌肉筋膜上（图1B）。在每周两次的生理盐水注射后，记录皮肤逐步扩张的过程（图2A）。随着注射体积的增加，扩张皮肤逐渐生长，表现为虚线框内区域扩大及皮肤进行性变薄。所有SD大鼠扩张区域的变化以及标记表面区域的变化均证实，皮肤再生呈现双相模式，即初始阶段快速扩张，随后增速减缓（图2B，C）。在灌注体积达到155 mL时，标记区域的皮肤重量显著高于45 mL时的重量（图2D）。在该大鼠模型中还观察到皮肤坏死和皮肤破裂等严重的晚期并发症（图2E）。这些结果表明，该连续组织扩张模...

讨论

组织扩张已成为一种广泛应用的技术，可生成在质地和颜色上均与邻近健康皮肤高度相似的额外皮肤¹⁹。该技术已应用于多种临床情况，包括瘢痕修复、乳房重建以及体表肿瘤切除后的修复重建²⁰。然而，长期组织扩张仍然是一个关键挑战，主要原因是皮肤再生能力耗竭²¹。由于缺乏合适的动物模型，相关潜在机制的研究受到阻碍。因此，我们建立了一种连续组织扩张模型，该模型能够紧密模拟临床长期组织扩张过程，并具有高度的稳定性和可重复性。

C57BL/6小鼠和SD大鼠是组织扩张研究中常用的动物模型。由于小鼠与大鼠的皮肤特性相似²²，大鼠因其更丰富的皮肤组织而更受青睐。与C57BL/6小鼠相比，SD大鼠性情更为温顺，对长期、重复性的实验操作具有更强的耐受性。已有文献报道，头皮²³和背部²⁴均可作为扩张器植入的部位。尽管头皮血供更为丰富...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD31 抗体	Abcam Shanghai Trading Co.,Ltd	ab182981	免疫组化染色
电子束辐照仪	Tongwei Xinda Technology (Jiangsu) Co,. Ltd	高能电子加速器（10 MeV，24 kW）	灭菌
FITC 标记的二抗	Proteintech Group, Inc	SA0003-2	免疫组化染色
GraphPad Prism 软件	GraphPad Software	版本 10.0	统计分析
苏木精-伊红染色试剂盒	碧云天生物技术有限公司	C0105S	组织学染色
高精度三维扫描仪	先临三维科技股份有限公司	EinScan Pro 2X V2	面积测量
ImageJ 软件	美国国立卫生研究院	版本 1.54	统计分析
Masson 三色染色试剂盒	碧云天生物技术有限公司	C0189S	组织学染色
组织扩张器	上海 Winner 整形外科产品有限公司	N/A	特殊定制