下一代测序克隆性检测：多发性骨髓瘤微小残留病监测的临床验证

摘要

本研究评估了一种基于下一代测序（NGS）的新型BCR/TCR克隆重排检测方法（OriMIRACLE LTM）在包括多发性骨髓瘤（MM）在内的淋巴系统恶性肿瘤微小残留病（MRD）检测中的应用。通过细胞系和临床涂片样本，研究显示该方法具有 >90% 的检出率和 81.36% 与流式细胞术的一致性。该检测具有高灵敏度，可预测复发，并支持治疗决策。

摘要

微小残留病（MRD）检测对于淋巴系统恶性肿瘤的管理至关重要。本研究介绍了一种基于新一代测序（NGS）技术的新型B细胞受体（BCR）和T细胞受体（TCR）克隆性检测方法——OriMIRACLE LTM，用于MRD检测。我们利用细胞系和多发性骨髓瘤（MM）患者的临床样本（包括残留涂片）对该检测方法进行了验证。BCR/TCR克隆性检测在淋巴系统恶性肿瘤中的阳性检出率超过90%。在MM患者中的验证研究表明，多色流式细胞术（MFC）与临床疗效评估在肿瘤细胞检测方面的一致率为81.36%（48/59）。值得注意的是，通过NGS和MFC均检测到MRD的MM患者中，有61.11%（11/18）出现了疾病进展或复发。仅通过NGS检测到MRD的患者临床完全缓解率较低，部分初始治疗有效的MM患者在停止治疗后出现复发。这些结果表明，该基于NGS的检测方法在淋巴系统恶性肿瘤（包括MM患者来源的残留涂片样本）中具有高度敏感性和特异性的MRD检测能力，相较于MFC具有优势，适用于MRD的动态监测。综上所述，现有证据支持将NGS作为MFC的补充工具，尤其对于MFC⁻/NGS⁺患者，NGS可提供更深入的风险分层。然而，最佳干预阈值仍有待前瞻性研究进一步确定。

引言

多发性骨髓瘤（MM）是一种血液系统恶性肿瘤，其特征是骨髓中异常克隆性浆细胞增殖¹。在中国，2022年约有22,450例新诊断的MM病例和17,360例相关死亡²。尽管过去十年间MM治疗取得了显著进展，显著延长了患者的中位生存期，但大多数患者最终仍会复发^3,4。这一显著增长凸显了精准监测缓解状态、早期预测复发以及及时实施治疗干预的迫切需求。

临床证据已明确证实微小残留病（MRD）状态在血液系统恶性肿瘤中的预后意义^5,6,7。鉴于其重要性，国际骨髓瘤工作组（IMWG）于2016年将MRD评估纳入其疗效评价标准⁸。目前用于骨髓MRD评估的方法包括等位基因特异性寡核苷酸聚合酶链式反应（ASO-PCR）、数字PCR（dPCR）、多参数流式细胞术（MFC）以及高通量测序（NGS）检测⁸。尽管ASO-PCR具有较高的检测灵敏度，但由于需要针对患者设计特异性引物，该方法耗时较长且标准化难度较大^9,10。同样，dPCR也受限于其等位基因特异性的设计^10,11。MFC在MRD检测中发挥了重要作用¹²，可快速提供细胞水平的信息，但在标准化和可重复性方面仍面临挑战。

下一代测序（NGS）提供了一种可重复且高度敏感的方法，无需使用患者特异性的引物，能够可靠地识别和定量血液系统恶性肿瘤中独特的免疫球蛋白重排¹³。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准Adaptive Biotechnologies公司的ClonoSEQ用于急性淋巴细胞白血病（ALL）、多发性骨髓瘤（MM）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的微小残留病（MRD）检测^14,15,16。目前，多项国际临床指南已将NGS列为推荐的MRD监测方法。《中国多发性骨髓瘤诊断与治疗指南（2020年修订版）》也推荐在MM患者中采用下一代流式细胞术（NGF）和NGS等方法进行MRD评估¹⁷。

据我们所知，由于成本和时间限制，下一代测序（NGS）技术在临床实践中并非淋巴系统恶性肿瘤微小残留病灶（MRD）检测的首选方法。当流式细胞术（MFC）结果为阴性时，通常需要额外进行一次骨髓穿刺以检测MRD。这一附加操作可能给患者带来显著的生理和心理负担，从而可能限制其在临床上的广泛应用。

本研究开发、表征并验证了一种基于下一代测序（NGS）的B细胞或T细胞受体（BCR/TCR）克隆性检测方法（OriMIRACLE LTM）的性能。本研究的主要目标是验证该检测方法在追踪淋巴系统恶性肿瘤微小残留病（MRD）中的灵敏度和特异性，即使使用剩余的涂片样本也能实现。该方法可直接利用常规诊断后剩余的骨髓涂片，从而克服涂片样本固有的局限性。即使涂片中的DNA因固定、染色和长期储存而发生片段化、含量极低或部分降解，通过优化的核酸提取和多重PCR扩增，仍可获得可靠的免疫组库谱型。该方法可实现高灵敏度的克隆追踪，灵敏度达到10⁻⁵至10⁻⁶，优于传统基于流式细胞术的MRD检测的最低检出限。本研究凸显了基于NGS的BCR/TCR克隆性评估在增强MRD追踪能力以及指导多发性骨髓瘤（MM）患者治疗决策方面的潜力，有望解决当前临床实践中的部分局限性。

方案

本研究遵循赫尔辛基宣言的原则，并经赣南医科大学第一附属医院伦理委员会批准（伦理批准编号：22SC-2023011201）。在所有参与者纳入研究之前，均已获得其签署的知情同意书。

样本选择
临床样本来自40名被诊断患有多种血液系统恶性肿瘤的患者，包括急性淋巴细胞白血病（ALL）、多发性骨髓瘤（MM）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和淋巴瘤。此外，还收集了慢性髓系白血病患者在慢性期和急变期配对的样本。这些样本于2016年12月至2022年8月期间采集自中国江西省赣南医学院第一附属医院。样本来源于骨髓穿刺物（BMA）或外周血。研究还使用了四种淋巴系统恶性肿瘤细胞系：B-ALL细胞系REH和NALM6、T-ALL细胞系Jurkat以及淋巴瘤细胞系H9，均购自美国模式培养物集存库（ATCC；弗吉尼亚州马纳萨斯）。

在分析验证研究中，纳入了30例新诊断或复发性多发性骨髓瘤（MM）患者在治疗前和治疗后采集的一组配对的临床残留骨髓涂片。在相应时间点，对骨髓穿刺（BMA）样本进行4色流式细胞术检测。

样本使用六种不同的四色抗体组合进行染色（稀释比例按照制造商说明）：CD38/CD56/CD45/CD19、CD38/CD138/CD45/CD34、CD38/CD117/CD45/CD33、CD38/CD22/CD45/CD20、CD38/CD9/CD45/HLA-DR，以及K/L/CD45/CD38。染色在4 °C避光条件下进行30分钟，随后用PBS洗涤两次（4 °C下以500 × g离心5分钟）。在免疫血液学实验室中，目前骨髓中MFC-MRD阳性的定义采用10^-4（即每10,000个细胞中1个细胞）作为阈值。通过观察前向/侧向散射信号并确认每管至少获得10,000个CD45⁺事件，来验证流式细胞术检测的数据质量。

基于NGS的克隆性检测及微小残留病（MRD）追踪
根据制造商说明书，使用相应试剂盒从200 µL骨髓液（BMA）、外周血或完整残留涂片（重悬于200 µL PBS中）提取基因组DNA（gDNA）。要求gDNA最低浓度为20 ng/µL，总产量≥1 µg，并验证A260/A280比值在1.8–2.0之间。本检测采用位点特异性多重PCR引物扩增gDNA，随后在扩增的受体序列上添加反应特异性索引条形码以用于样本识别。将带有条形码的扩增DNA混合，构建测序文库，并在Illumina平台上进行高通量测序（NGS）。使用Bioanalyzer检测最终文库大小是否在350–450 bp范围内，浓度是否≥5 nM。测序数据通过定制的生物信息学流程和严格的质控措施进行处理。将测序读段分配至各样本的重排B细胞受体（BCR）或T细胞受体（TCR）序列，并聚类为克隆性受体序列。随后评估这些序列与疾病的相关性及其是否适用于后续追踪。一个序列若要被视为适合追踪，必须在相应位点占所有BCR序列的至少10%，并具有足够的独特性。在评估序列是否适用于MRD追踪时，需将其与全面的B或T细胞受体库数据库（如ImMunoGeneTics（IMGT）数据库（http://www.imgt.org））进行比对，以确定其独特性。该序列在数据库中的出现频率用于评估其特异性。一旦确定了合适的疾病相关序列，便将其与后续样本进行比对以监测MRD。若发现序列匹配，则样本被归类为MRD阳性（+）；若未检测到匹配，则归类为MRD阴性（-）。对每个被监测序列的浓度进行定量，从而计算出样本水平上的共识恶性细胞数和总有核细胞数。两者之比可估算样本中肿瘤细胞的频率，为疾病进展或缓解提供重要信息。在诊断时，若某一克隆序列被检测到至少50条支持性读段，且其占总BCR/TCR受体库的比例≥10%，则认为该序列可用于有效追踪。

所有来源于人类的样本均在II级生物安全柜（BSC）中作为生物危害物处理，并使用个人防护装备（PPE）。受污染的耗材在丢弃前经高压灭菌（121 °C，20 分钟）；液体废物用10%次氯酸钠溶液处理。

精确度与灵敏度研究
通过在健康供体外周血基因组DNA（gDNA）背景下使用临床样本和细胞系，确定检测下限（LOD）。为建立检测的线性关系，将细胞系gDNA掺入正常gDNA中，以构建跨越多个数量级的克隆频率范围。具体而言，恶性细胞起始掺入量为10个细胞，随后进行10倍系列稀释：10、100、1,000和10,000个细胞。LOD定义为拟合的probit曲线达到95%检测概率时所对应的预期恶性细胞输入数量。通过线性回归分析观察值与预期频率之间的一致性。这些参数为后续评估研究中的样本水平微小残留病（MRD）估算提供了可靠基础。本优化版本在保持学术严谨性的同时，提升了表述的清晰度与简洁性，并确保了生命科学与医学领域学术写作中科学术语的准确使用和规范表达。

统计学分析
双侧 p 值 < 0.05 被认为具有统计学显著性。使用 GraphPad Prism 软件通过 Pearson 相关系数（r）评估并计算线性关系。统计学分析采用 R 语言（版本 3.6.1）进行。无进展生存期（PFS）的计算从患者达到完全缓解（CR）、部分缓解（PR）或非常好的部分缓解（VGPR）时开始，持续至疾病进展（PD）发生或因任何原因死亡为止。采用 Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，并使用对数秩检验（log-rank test）比较亚组间生存差异。Cox 分析同时采用单变量和多变量分析方法进行。

结果

克隆性检测的处理流程、线性及精密度
BCR/TCR 克隆性检测基于两轮多重 PCR 扩增，随后进行高通量测序（NGS）（图1）。BCR 克隆性检测可分别通过独立反应或单次优化混合反应，识别 IGH（VH-DH-JH 或 DH-JH）、IGK（Vκ-Jκ、Vκ-Kde 和 intronRSS-Kde）及 IGL（Vλ-Jλ）基因重排，以及 BCL1-IGH 和 BCL2-IGH 易位。TCR 克隆性检测可检测 TCRB（Vβ-Dβ-Jβ）和 TCRG（Vγ-Jγ）基因重排。B细胞淋巴系统恶性肿瘤的BCR克隆性检测阳性率为93.94%，T细胞淋巴系统恶性肿瘤的TCR克隆性检测阳性率为90.91%（表1）。

根据细胞系测试结果，在跨越多个数量级的广泛样本输入范围（0.2 µg、2 µg 和 20 µg）内均表现出良好的线性。为建立线性关系，采用10倍系列稀释法（10、100、1,000 和 10,000 个细胞）将恶性细胞加入正常gDNA中。在克隆频率从1到10^-6的范围内，估算斜率介于0.93–1.06之间，显示出良好的线性（图2A）。在BCR和TCR克隆性检测中，检测限（LOD）估计为1至2个恶性细胞（图2B）。此外，BCR/TCR克隆性检测能够利用组织样本（BMA）及配对外周血检测淋巴瘤中的克隆性（补充表1）。

用于验证微小残留病灶（MRD）检测的患者与样本
微小残留病灶（MRD）检测的验证共纳入29例多发性骨髓瘤（MM）患者，其中1例因样本损坏被排除。研究人群包括65.52%（19/29）的男性和34.48%（10/29）的女性，中位年龄为65岁（范围33–82）（表2）。根据国际骨髓瘤工作组（IMWG）标准¹⁸，队列中31.03%（9/29）的患者被归类为高危，24.14%（7/29）为标准风险，37.93%（11/29）为低危。修订的多发性骨髓瘤国际分期系统（R-ISS）I期、II期和III期分别占患者总数的10.34%（3/29）、48.28%（14/29）和20.69%（6/29）¹⁹。

NGS 与 MFC 检测方法的比较
为评估OriMIRACLE LTM和MFC检测方法的定量准确性，进行了直接的成对比较。结果显示，在测试范围内，两种方法的定量准确性相似，尤其是在微小残留病（MRD）频率高于10⁻⁴时，皮尔逊相关系数（R值）为0.73（图3）。在29例多发性骨髓瘤（MM）患者的59份样本中，MFC和NGS检测均检出了肿瘤细胞，一致性达到81.36%（48/59）。这种一致性反映的是在不同时间点均可检测到肿瘤细胞的存在，而非两种方法之间的真正一致性。在这些样本中，62.07%（18/29）的患者通过NGS和MFC检测均呈MRD阳性，1例患者在两种方法中均呈MRD阴性，另有11例患者仅NGS检测为MRD阳性而MFC检测为MRD阴性。在检测结果不一致的患者中，3例的检测频率低于10^-4，而8例的检测频率处于10^-2–10^-4 范围内（图3）。从残留的骨髓涂片样本中提取DNA，以尽可能获得足量DNA。在治疗前进行克隆性检测时，平均输入DNA量为91.95 ng（最高达100.0 ng）。在后续MRD检测中，平均提取DNA量为1623.39 ng（范围为50.1–17400.0 ng）（补充表2）。结果表明，即使残留样本量不足，NGS仍可检测到MRD，而MFC在部分情况下未能检出MRD。

NGS检测MRD用于预测时间间隔的临床有效性
所有多发性骨髓瘤患者在基线时均检测到克隆性序列，随后进行微小残留病（MRD）评估图4）。18例患者通过NGS和MFC检测确认为MRD阳性。在MFC和NGS均检测为MRD阳性的患者中，61.11%（11/18）随后出现疾病进展或复发；38.89%（7/18）的患者在研究期间达到疾病稳定（SD）或部分缓解（PR）。在NGS确认为MRD阳性但MFC检测为MRD阴性的患者中，36.36%（4/11）在最近一次临床评估时未能达到临床完全缓解（CR）补充表 2）。此外，在所有临床反应为完全缓解（CR）的患者中，有37.50%（3/8）在停止治疗后出现复发。我们还探讨了主要临床特征和MFC结果与无进展生存期（PFS）结局之间的关系（补充图1). 无进展生存期（PFS）的单变量和多变量分析结果显示，两者无显著相关性。本研究中，仅分析通过MFC获得的微小残留病（MRD）结果时，PFS未观察到显著差异。

数据可用性
由于患者隐私限制和机构政策，原始数据不对外公开。收集的数据汇总见补充文件1。

图1：BCR/TCR 克隆性检测包括多重 PCR 扩增，随后进行高通量测序（NGS）。 第一轮 PCR 使用位点特异性引物和样本特异性索引扩增重排免疫受体基因的 CDR3 区域，NGS 接头在第二轮 PCR 中加入。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：通过将细胞系基因组DNA以不同克隆频率掺入正常基因组DNA中，评估克隆性检测的线性范围。（A）BCR和TCR克隆性检测的线性表现。（B）使用临床样本及掺入健康供体外周血基因组DNA的细胞系估计的检测下限（LOD）。请点击此处查看该图的放大版本

图3：MFC与NGS MRD检测方法在MRD频率测量上的成对比较。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：多发性骨髓瘤患者微小残留病灶（MRD）的动态变化及其与患者不同临床状态的关系。 请点击此处查看该图的放大版本

样本类型		编号	疾病类型	优势克隆型
细胞系	REH	1	B-ALL	IGH, IGK
	NALM6	2	B-ALL	IGH, IGK
	Jurkat	3	T-ALL	TCRB, TCRG
	H9	4	淋巴瘤	TCRB, TCRG
临床B细胞淋巴系统恶性肿瘤		5	B-ALL	IGH
		6	B-ALL	IGL
		7	B-ALL	IGH
		8	B-ALL	未检出
		9	CLL	IGH, IGK
		10	CLL	IGH, IGK
		11	CP-CML	IGH
		12	BP-CML	IGH
		13	MM	IGK
		14	MM	IGH, IGK
		15	MM	IGK
		16	MM	IGH
		17	MM	IGH
		18	MM	IGK
		19	MM	IGH
		20	MM	IGH, IGK
		21	MM	IGH, IGK
		22	MM	IGH
		23	淋巴瘤	IGH, IGK
		24	淋巴瘤	IGH, IGK, IGL
		25	淋巴瘤	IGH, IGK, IGL
		26	淋巴瘤	IGH, IGK, IGL
		27	淋巴瘤	IGH
		28	淋巴瘤	IGH
		29	淋巴瘤	IGH, IGK, IGL
		30	淋巴瘤	IGH, IGK
		31	淋巴瘤	IGH, IGK
		32	淋巴瘤	IGH, IGK, IGL
		33	淋巴瘤	IGK
		34	淋巴瘤	IGH
		35	淋巴瘤	未检出
临床T细胞淋巴系统恶性肿瘤		36	淋巴瘤	TCGR
		37	淋巴瘤	TCRB, TCRG
		38	淋巴瘤	TCRB, TCRG
		39	淋巴瘤	TCRB, TCRG
		40	淋巴瘤	TCRB, TCRG
		41	淋巴瘤	TCRB, TCRG
		42	淋巴瘤	TCRB, TCRG
		43	淋巴瘤	TCRB, TCRG
		44	淋巴瘤	未检出

表1：使用BCR/TCR克隆性检测方法在4种细胞系和40例临床样本中进行克隆性检测的结果。 B-ALL：B细胞急性淋巴细胞白血病；T-ALL：T细胞急性淋巴细胞白血病；CP-CML：慢性期慢性髓系白血病；BP-CML：急变期慢性髓系白血病；CLL：慢性淋巴细胞白血病；MM：多发性骨髓瘤。

特征	总计 (N = 29)
中位年龄，年（范围）	65 (33-82)
性别，n (%)
男性	19 (65.52)
女性	10 (34.48)
重链类型，n (%)
IgG	14 (48.28)
IgA	7 (24.14)
IgE	1 (3.45)
轻链类型，n (%)
k	19 (65.52)
λ	8 (27.59)
细胞遗传学异常，n (%)
del17p	2 (6.90)
del13q14	9 (31.03)
1q21 扩增/增多	12 (41.38)
t (4;14)	2 (6.90)
无异常	9 (31.03)
ISS 分期，n (%)
I	4 (13.79)
II	13 (44.83)
III	12 (41.38)
R-ISS 分期，n (%)
I	3 (10.34)
II	14 (48.28)
III	6 (20.69)
缺失	6 (20.69)
IMWG 风险分层，n (%)
高危	9 (31.03)
标准风险	7 (24.14)
低危	11 (37.93)
缺失	2 (6.90)

表2：本研究纳入的29例多发性骨髓瘤患者的基线特征。 k：κ；λ：λ；DS：Durie-Salmon分期系统；ISS：国际分期系统；R-ISS：修订的国际分期系统；IMWG：国际骨髓瘤工作组

补充图1：基于临床特征和MFC结果的生存分析。（A）无进展生存期（PFS）的单因素和多因素分析。（B）基于MFC结果的Kaplan-Meier曲线。（C）基于NGS结果的Kaplan-Meier曲线。请点击此处下载该文件。

补充表1：使用BCR/TCR克隆重排检测方法在组织样本及配对外周血中检测淋巴瘤的克隆性。NHL：非霍奇金淋巴瘤；HGBL：高级别B细胞淋巴瘤；FL：滤泡性淋巴瘤；DLBCL：弥漫性大B细胞淋巴瘤；ITLPD-GI：胃肠道惰性T淋巴细胞增殖性疾病。 请点击此处下载该文件。

补充表 2：基于 MFC 和 NGS 检测方法的微小残留病（MRD）检测结果。 ND：未检出；部分缓解：PR；完全缓解：CR；疾病稳定：SD；非常好的部分缓解：VGPR。 请点击此处下载该文件。

补充文件1：本研究中收集的原始数据摘要。 请点击此处下载该文件。

讨论

近年来，淋巴系统恶性肿瘤的临床治疗效果显著提升，推动了对能够更早预测生存终点并加速新疗法评估的替代性标志物的研究热潮²⁰。一项涵盖8,098例患者的综合性荟萃分析再次证实，微小残留病（MRD）阴性在提高多发性骨髓瘤（MM）患者长期生存率方面具有强有力的预后价值²¹。此外，BCR和TCR克隆性重排已作为关键的诊断及微小残留病监测标志物，在淋巴系统恶性肿瘤的治疗决策中发挥指导作用²²。

越来越多的证据表明，基于高通量测序（NGS）的BCR/TCR克隆重排检测在样本量充足的情况下，优于基于多色流式细胞术（MFC）和PCR的检测方法。NGS具有更高的灵敏度和更简便的标准化流程^{10,23,24,25,26}，并已被确认为维持治疗开始时无进展生存期（PFS）和总生存期的重要预后因素²⁷。
在本研究中，我们开发了一种基于NGS的检测方法，该方法在淋巴系统恶性肿瘤中对BCR和TCR克隆重排的阳性检出率均超过90%。该检测方法的检出限（LOD）估计为每1至2个恶性细胞，与clonoSEQ检测方法的高灵敏度相当（其LOD为1.903个恶性细胞）¹⁶。我们在克隆重排频率范围为1至10^-6时观察到良好的线性关系，估计斜率为0.93至1.06，表明观测值与预期值之间具有高度的比例一致性。在建立标准化检测流程并完成实验室验证后，我们进一步开展了临床验证，以确保该检测方法适用于临床微小残留病（MRD）监测。

本研究显示，基于NGS的检测方法与MFC之间的一致性为81.36%（48/59）。两种方法在识别新诊断或复发病例中的肿瘤细胞时均表现出100%的敏感性。在治疗后监测中，我们发现MFC评估的微小残留病（MRD）状态与无进展生存期（PFS）之间无显著相关性，这可能归因于样本量有限。因此，我们对所有病例进行了全面分析。

在18例经两种方法均检测为微小残留病（MRD）阳性的患者中，MRD结果与临床疗效评估一致。其中9例患者出现疾病进展（PD）或复发，4例达到疾病稳定（SD），4例达到部分缓解（PR），1例死亡。这表明，对于两种方法均检测为MRD阳性的患者，几乎 invariably 会出现疾病进展或复发。这些数据提示，NGS和MFC检测均呈MRD阳性，大多反映这些患者的治疗效果有限或预后不良。在11例NGS检测为MRD阳性但MFC检测为MRD阴性的患者中，有36.36%未能达到完全缓解（CR）。这些发现进一步凸显了NGS能够在10^-2至10^-6的频率范围内检测MRD，即使在残留样本有限的情况下仍具检测能力，而MFC在部分情况下未能检出MRD。这进一步支持NGS在MRD检测中相较于MFC具有更高的敏感性和特异性。

既往研究表明，通过MFC评估的MRD状态是多发性骨髓瘤患者无进展生存期（PFS）和总生存期的强有力预测指标，凸显了在自体干细胞移植后通过MRD监测指导治疗决策和评估预后的重要性²⁸。本文结果进一步强调了NGS检测的重要意义，其中两名患者（患者11和患者14）经MFC检测为MRD阴性，但NGS检测为MRD阳性。需要特别注意的是，在此类情况下停止治疗可能导致复发风险，因此当MRD检测结果不一致时，必须谨慎评估治疗反应。

本研究打破了现有二代测序（NGS）和多色流式细胞术（MFC）方法对新鲜骨髓穿刺液或冻存细胞的依赖，首次系统性验证了常规诊断后剩余的、甚至已染色的骨髓涂片可作为高灵敏度微小残留病（MRD）检测的可靠起始材料。该方法直接解决了以下临床与方法学上的空白：（1）避免了为MRD监测而抽取大量骨髓液的需求，尤其适用于老年患者或采样困难的患者；（2）可对存档涂片进行回顾性分析，从而利用现有的病理资源，在历史队列中建立基于MRD的预后证据；（3）其检测灵敏度达到10^-5-10^-6，远优于传统的MFC方法（通常为10^-4-10^-5），并规避了MFC因样本质量问题导致的假阴性结果，为临床实践提供了基于DNA、可追踪的MRD评估工具。

已确定多个关键步骤，以确保检测的成功性和可靠性。轻柔刮除残留涂片后立即加入缓冲液，对获得足够的基因组DNA（gDNA）产量至关重要。精确的DNA输入量（每反应100 ng，误差在±10%以内）是避免等位基因丢失或扩增偏倚的必要条件。等摩尔量混合带条形码的产物（2 nM）有助于实现均匀的测序深度，而一致应用生物信息学阈值（诊断时克隆频率≥10%，追踪时错配率≤5%）有助于防止微小残留病（MRD）的假阳性判断。此外，针对常见实验问题，对标准方案进行了若干修改。当最终文库浓度低于5 nM时，谨慎增加2–4个额外PCR循环进行第二轮扩增，以避免过度扩增带来的偏倚。对于因错配过多（>5%）导致克隆追踪失败的样本，更新参考IMGT数据库，并将错配容忍度临时放宽至8%以进行探索性分析，但临床报告仍以5%为标准阈值。若测序深度低于每样本50,000条读长，则重新混合文库并重新测序，无需重复PCR步骤。

总体而言，这一真实世界验证表明，残留的骨髓涂片样本在不同治疗环境下均能产生一致且可靠的检测结果。在经济欠发达地区，通常进行骨髓活检和多色流式细胞术（MFC）而非下一代测序（NGS），研究结果提示，当初始检测结果为阴性时，可考虑采用NGS进行进一步的分子学评估。在此类情况下，利用残留样本是合适的，因其可避免重复进行骨髓穿刺，从而减轻患者负担。

尽管我们正在进行的真实世界研究旨在扩大样本量以进行进一步分析，但仍存在若干局限性。假阴性结果可能出现，尤其是在提取的DNA含量不足时，例如患者10在第二次微小残留病（MRD）检测中所观察到的情况。此外，NGS检测到的克隆比例受细胞定量的影响，可能导致对MRD细胞比例的高估。本研究的验证主要集中在骨髓样本上。然而，NGS-MRD的长期意义在于治疗后的多次随访，而外周血可能更适用于此类监测。目前尚未开展对外周血样本的验证。由于本真实世界研究中临床验证样本数量有限、患者入组具有随机性，且治疗方案多样，连续采集MRD样本具有挑战性。因此，我们重点评估了早期MRD反应与后续疾病进展之间的关系，但未能阐明持续MRD状态对长期预后的影响。此外，本研究未将下一代流式细胞术（NGF）纳入比较分析。尽管我们系统地比较了NGS与传统多参数流式细胞术（MFC），但NGF作为国际骨髓瘤工作组（IMWG）推荐的两种MRD检测方法之一（另一种为NGS），若纳入分析将有助于进一步评估检测方法的性能。此外，本研究样本量相对较小（n = 40），队列具有异质性，涵盖了多种血液系统恶性肿瘤。未来有必要开展多中心、大样本的研究，纳入NGF检测，并聚焦于单一恶性疾病（如多发性骨髓瘤），以验证并拓展本研究的结论。

在对基于高通量测序的BCR/TCR克隆性检测方法进行了全面的表征和性能验证后，我们证明该方法在定量和监测多发性骨髓瘤患者残留骨髓涂片样本中的微小残留病（MRD）方面具有高度敏感性、准确性和实用性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗CD19	Abcam	AB134114	按制造商说明书进行稀释
抗CD20	Abcam	AB64088	按制造商说明书进行稀释
抗CD22	Abcam	AB32123	按制造商说明书进行稀释
抗CD33	Abcam	AB134115	按制造商说明书进行稀释
抗CD34	Abcam	AB81289	按制造商说明书进行稀释
抗CD38	Abcam	AB183326	按制造商说明书进行稀释
抗CD45	Abcam	AB40763	按制造商说明书进行稀释
抗CD56	Abcam	AB75813	按制造商说明书进行稀释
抗CD9	Abcam	AB2215	按制造商说明书进行稀释
抗HLA-DR	Abcam	AB20181	按制造商说明书进行稀释
GraphPad Prism	GraphPad	https://www.graphpad.com/
Illumina NovaSeq 6000	Illumina	NovaSeq 6000	https://www.illumina.com/systems/sequencing-platforms/novaseq.html
ImMunoGeneTics (IMGT) 数据库	ImMunoGeneTics (IMGT) 数据库	http://www.imgt.org/
淋巴系统恶性肿瘤细胞系	ATCC	https://www.atcc.org/	B-ALL 细胞系 REH 和 NALM6，T-ALL 细胞系 Jurkat，以及淋巴瘤细胞系 H9（DSMZ）
多参数流式细胞术	BECKMAN COULTER	CytoFLEX
OriMIRACLE LTM 检测试剂盒	Origimed Co., Ltd., Shanghai, China
R 语言	R Foundation for Statistical Computing	version 3.6.1