转录组测序鉴定了动脉粥样硬化斑块中的枢纽致病化学因子

摘要

本研究旨在利用RNA测序分析与动脉粥样硬化斑块（AP）相关的炎症因子的潜在机制。结果鉴定出AP中CCL3、CCL4和CXCL1关键炎症枢纽基因。这些趋化因子可能通过促进M0巨噬细胞的积累，同时抑制保护性免疫细胞，从而推动动脉粥样硬化，揭示潜在的治疗靶点。

摘要

动脉粥样硬化斑块（AP）是一种炎症性纤维组织增生疾病，发生在动脉壁内皮细胞和平滑肌受损后，可能导致不同程度的心血管和脑血管血流阻塞。然而，迄今为止，针对炎症的有效治疗方法大多未能实现，表明仍需更多见解。本研究旨在利用RNA测序（RNA-seq）分析炎症因子相关的AP转录组变化。RNA测序对AP患者样本（n=11）和对照个体（n=3）进行了测序。通过Metascape鉴定差异表达基因（DEGs），随后使用R软件中的clusterProfiler包进行KEGG通路富集分析，CIBERSORT进行免疫浸润分析，以及使用STRING数据库进行蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析。通过CytoHubbba插件识别了PPI网络中的枢纽基因。AP组共鉴定了3713个DEGs，其中包括2097个上调基因和1616个下调基因。结果显示，DEG主要富含与免疫和炎症相关的通路。三种炎症相关因子CCL3、CCL4和CXCL1被认为是AP病理过程中的主要枢纽基因。免疫浸润分析显示AP中存在明显的微环境，表现为M0巨噬细胞显著增加，同时AP内CD8⁺ T细胞、活化NK细胞和休眠肥大细胞减少。总之，这些程序性发现描述了CCL3、CCL4和CXCL1的不同表达及其与AP中免疫细胞组成改变的关联，凸显了这三种趋化因子作为进一步机制研究的潜在候选。

引言

心血管疾病（CVD）一直是全球人类健康的严重^威胁。随着全球人口老龄化趋势加剧，心血管疾病的发病率也^在上升。其中，动脉粥样硬化斑块（AP）是心血管^疾病3型的主要原因之一。AP是一种慢性炎症性疾病，其特征是动脉内膜逐渐积累脂质并形成斑^块4。AP是心血管和脑血管事件的常见基础，主要涉及大中型动脉，导致缺血和损伤，是导致心血管和脑血管疾病及死亡的主要^因素5。由于早期缺乏明显症状，AP通常在确诊时已晚期，致死率较高。治疗AP的风险因素包括可调节因素，如低体力活动、久坐不动、吸烟、^{心理健康问题7}，以及因高脂饮食导致的肥胖和2型糖尿病，以及不可改变的因素，如基因、年龄和^性别8。最新研究发现，代谢综合征、同型半胱氨酸血症、高尿酸血症和胰腺耐受是动脉粥样硬化发生和发展的重要风险因素^9,10。

与AP发病机制相关的理论主要包括脂质浸润、炎症、氧化应激反应、感染以及遗传因素与环境因素相互作用的理论（^11,12）。其中，炎症和氧化应激被认为是AP的核心发病机制，参与^AP13的发生、发展和退化的所有过程。AP不稳定斑块的突然损伤、血小板活化和血栓形成是心肌梗死和出血性中风的重要发病机制¹⁴。通过持续研究，发现AP不仅含有脂质，还含有许多炎症细胞¹⁵。吸烟、高血压、脂质疾病、高胰岛素血症、高血糖、高尿酸及其他有害刺激会促使白细胞和内皮细胞持续释放可溶性粘附分子和各种细胞因子，并促进单核细胞附着于血管内皮细胞。积累的趋化因子进一步促使单核细胞迁移至内皮下空间，并分化为巨噬细胞，巨噬细胞随后吞噬组织内富含胆固醇的氧化低密度脂蛋白（LDL），从而转化为泡沫细胞，并启动脂质条纹的^形成。AS的早期病理损伤，即脂质条纹，主要由巨噬细胞和T淋巴细胞组成，T淋巴细胞是典型的炎症性病变¹⁷。因此，各种炎症细胞及其产物参与了^AP-18的起始和进展。然而，AP的炎症环境复杂，涉及多个已知和潜在未知因素。传统的候选基因方法可能无法捕捉到这一完整的炎症驱动因素。

为解决这一局限性，我们采用了RNA测序（RNA-seq），一种无偏高通量转录组方法。这种方法特别适用于假设生成研究，因为关键分子驱动因素尚未预先确定。与候选基因或微阵列方法不同，RNA-seq具有更宽的动态范围、更高的灵敏度，并且能够在无需事先探针设计的情况下检测新转录本^19,20。这些特性使其特别适合发现AP中与炎症相关的特征，因为AP的分子基础尚未完全表征。

本研究通过RNA-seq分析与AP相关的炎症因子的潜在机制。利用不同算法的生物信息学工具筛查一系列DEGs。随后进行了富集分析（WGCNA、KEGG通路、mcode、GSEA、枢纽基因分析）及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。本研究结果有助于更好地理解炎症驱动的抗病毒性抗炎的分子病理机制，并在寻找新颖生物标志物中发挥重要作用。

方案

该研究获得辽城人民医院伦理委员会批准（批准号：2023014），并遵循了《赫尔辛基宣言》的原则。所有参与者均获得知情同意。所有患者或其家属均签署了知情同意书。

患者与样本

本研究回顾性分析了2023年1月至12月期间，在中国山东省辽城人民医院血管神经外科接受颈动脉内膜切除术的11例严重颈动脉狭窄患者。这些患者被纳入AP组。颈动脉狭窄的诊断基于CTA或脑血管造影等影像数据。AP组的纳入标准为：（1）年龄在50至80岁之间;（2）计算机断层扫描/数字减去血管造影确认颅内颈内动脉狭窄≥70%;（3）发病前修正的Rankin评分≤1;（4）获得患者或其法律代表的知情同意。排除标准为：（1）炎症性或免疫性疾病;（2）精神疾病的存在;（3）恶性肿瘤的存在;（4）怀孕、哺乳或生育潜力。年龄匹配且在同一医院接受器官捐献的严重创伤性脑损伤患者被选为对照组（NA;正常控制，n = 3）。两组受试者在年龄、性别和身体质量指数上进行了匹配，以排除混杂因素。对照组的纳入标准为：（1）年龄在50至80岁之间;（2）无冠状动脉疾病、颈动脉狭窄或其他全身性血管疾病史;（3）获得患者法定代理人的知情同意。在颈动脉内膜切除术期间，从AP组采集颈动脉内膜和斑块样本，而器官捐献后从对照组采集主动脉内膜样本。血管组织和斑块组织被储存在液氮罐中进行后续检测。AP患者的基线特征见 表1。

样品制备

按照制造商说明，使用TRIzol试剂提取了总RNA。使用Nanodrop ND-2000分光光度计在260 nm和280 nm（A260/A280比值介于1.8至2.0之间）评估RNA浓度和纯度。通过2%琼脂糖凝胶电泳在100伏电阻下30分钟评估RNA完整性。RNA完整性值（RIN）使用安捷伦2100生物分析仪获得（下游分析使用RIN ≥ 7.0样本）。除非另有说明，所有样本处理和RNA提取均在室温下进行。废物TRIzol试剂的处置遵循机构危险化学废物指南。

RNA测序

在用DNase I处理总RNA后，mRNA被用寡核苷酸D（T）磁珠富集，然后在94°C下短片化为短片段，持续5分钟。由此产生的mRNA片段作为模板，随机寡核苷酸作为引物。第一股cDNA通过M-MuLV逆转录酶系统在42°C下合成50分钟，随后RNase H介导RNA链降解。第二链合成则在DNA聚合酶I系统中使用dNTPs进行。双链cDNA经过纯化，末端修复，并以“A”型悬垂尾部进行尾部连接，以便适配连接。利用AMPure XP珠子筛选250-300碱基对的cDNA片段，随后通过PCR扩增。随后，扩增产物被纯化生成最终的文库。文库测序在Illumina HiSeq平台上完成，采用对端150碱基对读长。为了数据质量控制（QC），包含适配器序列或低质量碱基的原始数据通过内部脚本过滤掉。由于仪器可能引发测序错误，数据质量通过分析测序错误率分布来评估（错误率<1%被认为是可接受的）。此外，GC内容分布也被确定。除非另有说明，所有测序程序均在常温下进行。含有危险化学品（如DNase I缓冲液）的试剂按照机构生物安全指南进行处置。

质量控制阈值与故障排除

仅使用了RIN ≥ 7.0和片段大小为250–300 bp的文库样本。每个样本至少需1400万次原始读数，且Q30≥98%。文库产率低的问题通过将PCR周期增加到18个解决，但为了将重复率控制在15%以下，优先考虑15个周期。

DEG筛查

我们评估了不同样本中基因表达水平的分布。样本间基因表达水平的相关性用于验证实验信度及样本选择的适当性。采用主成分分析（PCA）评估组间差异及组内可重复性。DEGs通过Metascape在线数据库（http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）识别。DEG被定义为|log₂（重叠变化） |> 1 和 p.-值< 0.05，均被认为具有统计学显著性。除非另有说明，所有生物信息学分析均使用默认参数进行。作为中间可重复性检查点，生成了PCA图以确认样本按组而非批次分组。

京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析

KEGG（http://www.genome.jp/）分析是一种系统性的方法，用于评估基因功能，以发现生物调控通路。本文首次获得了 org.Hs.eg（版本3.12.0）差异基因的官方符号转换基因ID。KEGG 路径分析使用 R 软件（版本 4.2.0）中的 clusterProfiler 包完成。p . < 0.05被认为具有统计学显著性。中间结果是生成一个富集通路的排名列表，包含对应的基因计数和调整后的p值。

PPI网络分析

为了构建PPI网络和屏幕密钥基因，采用了STRING数据库（版本11.0，https://string-db.org/）。仅有综合分数超过0.9的交互被保留为统计学显著。该网络通过Cytoscape（版本3.10.1）进行可视化和分析，Cytoscape是一款开源生物信息学工具，旨在探索分子相互作用网络。通过CytoHubba插件（版本0.1）识别了PPI网络中的枢纽基因。

枢纽基因

CytoHubba 插件选出了前20个关键基因。红色表示该基因水平较高。Metascape在线数据库（3.5版，http://metascape.org/gp/index 年）对枢纽基因进行生物信息学分析，分析了20个枢纽基因。基因富集在以下本体类别中被识别：WGCNA、PCA、mcode、GSEA。基因组中的所有基因都作为富集背景。筛查了p . < 0.05、最低计数3和富集因子>1.5的项目。

统计分析方法

使用SPSS 25.0统计软件分析数据。计数数据以频率或百分比表示，组间比较则采用卡方检验。测量数据与常态分布的平均±标准差一致，组间比较采用T检验。 第< 页0.05被视为显著差异。

结果

动脉粥样硬化斑块中差异基因的RNA-seq数据分析

仅使用RIN ≥ 7.0的样本用于文库制备。所有14个样本（11个AP，3个对照）都超过了这个阈值。所有样本均一次性测序;因此，无需批量效应调整。每个样本平均生成1680万条原始读数;经过质量过滤后，保留了1650万条干净读段（98%），其中91%唯一映射到人类参考基因组（HG38）。DEG分析显示，动脉粥样硬化斑块患者中有2097个上调基因和1616个下调基因（|log2FC| >1， P <0.05），与健康对照组相比（见图1A）。 图1B展示了前20个上调和下调差异表达基因的热图。转录组RNAseq测序揭示了样本相关性（见图1C）。WGCNA分析了共表达基因模块与表型之间的相关性（见图1D）。PCA分析显示，NA组与AP组之间存在显著差异（P .< 0.05）（图1E）。

差异基因的KEGG富集分析

使用R软件中的clusterProfiler包（版本4.2.0）对疾病组中上调和下调的差异表达基因分别进行了KEGG通路富集分析（见图2A，B）。结果显示，这些基因在与免疫和炎症相关的通路中显著富集，如造血细胞谱系、类风湿关节炎、局部粘连、整合素信号和趋化因子信号通路。

GSEA分析

GSEA分析显示，实验组的核心基因主要在顶部富集，显示出上调趋势（图3A）。对照组的核心基因主要在底部富集，显示出下降趋势（见图3B）。总之，实验组（ASA）中炎症基因上调，对照组（NA）下调。

PPI 网络分析

在使用 STRING 数据库（版本 11.0）分析的 PPI 网络中，共享相同集群 ID 的节点往往彼此靠近。如 图4A所示，这一聚类显示对应基因主要参与细胞激活、炎症反应和细胞激活的调控。 图4B 展示了以p值着色的同一网络，其中含有更多基因的簇表现出更显著的 p值。

枢纽基因鉴定与免疫细胞浸润分析

选择DEG进行mcode分析，分析结果主要与乙酰胆碱受体相关（图5 和 表2）。使用CytoScape中的CytoHubba插件进行中心基因分析，识别出前20个中心基因，其中大多数与免疫和炎症相关（见图6A，左侧面板）。前十名枢纽基因包括CXCR4、CCL4、CCL3、CCL20、CXCL1、CCL5、CXCL8、CD4、CCR2和CCR5（见图6A，右侧面板）。中心基因与Olink炎症面板92基因的交汇揭示了5个共同基因，包括CXCL1、CCL20、TNF、CCL3和CCL4（见图6B）。CIBERSORT分析显示疾病组与健康对照组在免疫细胞浸润方面存在显著差异。与对照组相比，疾病组表现出显著更高的M0巨噬细胞比例（p < 0.05）（见图6C）。相反，疾病组中CD8 T细胞、活化NK细胞和大多数静息细胞的比例显著较低（全部 为< 0.05页）（见图6C）。

枢纽基因的功能分析

我们进一步利用metascape数据库分析了Hub基因的生物学功能，发现这些基因主要与细胞因子介导的信号通路和钙介导的信号相关（见图7A和表3）。随后利用细胞类型特征来丰富枢纽基因的转录调控因子，显示枢纽基因主要与gao大肠24W C11样细胞、发育中的心脏C8巨噬细胞以及manno中脑神经型hmgl相关（见图7B）。DisGeNET数据库疾病富集分析显示，枢纽基因与皮肤病变、爱泼斯坦-巴尔病毒感染和蜱虫脑炎相关（见图7C）。PaGenBase数据库的组织特征富集分析显示，中心基因主要富集在脾脏、血液和肺部（图7D）。此外，TRRUST数据库分析发现RELA和NFKB1是调控枢纽基因的主要转录因子（见图7E）。

数据可用性：

处理后的计数矩阵作为补充文件（补充文件1和补充文件2）提供。其他所有数据均完整呈现于文章中。如有合理要求，通讯作者可提供原始测序数据。

图1：DEGs分析。 （A） 健康斑块和动脉粥样硬化斑块，基因火山分布图谱，上调2097，下调1616（|log2FC| > 1，P 。< 0.05）。（B）前20个上调和下调差异表达基因的热图。（C）样本相关分析。（D）WGCNA分析了共表达基因模块与表型之间的相关性。（E）PCA分析（无中核组与AP组显著不同）。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：KEGG分析。 KEGG通路富集分析分别对疾病组中上调（A）和下调（B）差异表达基因进行。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：GSEA分析。 （A）GSEA分析显示，实验组的核心基因主要在顶部富集，显示出上调趋势。（b）对照组中，核心基因主要在底部富集，且呈下降趋势。总之，炎症基因在实验组（AP）中上调，对照组（NA）下调。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：PPI网络图。 （A） 按集群ID着色，共享相同集群ID的节点通常彼此较近。 （b） 用P值着色，即含有更多基因的项目具有更显著的P值。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：DEGs的mcode分析。请点击此处查看该图的更大版本。

图6：枢纽基因分析。 （A） 通过CytoHubba插件在Cytoscape中通过度数计算方法获得的前20名枢纽基因（左侧面板）和前10名枢纽基因（右侧面板），这些基因主要与免疫和炎症相关。（B）枢纽基因与Olink炎症面板的交汇，92个基因识别出5个交错基因。（C） CIBERSORT算法被用于比较AP组和NA组22个免疫细胞亚组的浸润丰度。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7：枢纽基因的生物信息学分析。 （A） 利用Metascape数据库对枢纽基因进行功能性注释。（B） 基于细胞类型特征的枢纽基因相关转录调控因子富集分析。 （C） 利用DisGeNET数据库对枢纽基因进行疾病富集分析。（D） 通过PaGenBase数据库识别的中心基因组织特异表达模式。（E） 利用TRRUST数据库分析枢纽基因的转录调控网络。 请点击此处查看该图的放大版本。

MCODE	走	描述	日志10（P）
MCODE_1	R-HSA-629597	高度钙通透性尼古丁乙酰胆碱受体	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	突触前尼古丁乙酰胆碱受体	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	高度钙通透性后突触尼古丁乙酰胆碱受体	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	串联孔域钾通道	-10.3
MCODE_2	去吧：0030322	膜电位的稳定	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	第四阶段——静息膜电位	-9.7

表1：AP患者的基线特征

MCODE	走	描述	日志10（P）
MCODE_1	去吧：0030322	高度钙通透性尼古丁乙酰胆碱受体	-19.9
MCODE_1	R-HSA-5576886	突触前尼古丁乙酰胆碱受体	-19.6
MCODE_1	R-HSA-1296346	高度钙通透性后突触尼古丁乙酰胆碱受体	-16.7

表2：DEGs的MCODE富集分析。

MCODE	走	描述	日志10（P）
MCODE_1	R-HSA-629597	高度钙通透性尼古丁乙酰胆碱受体	-10.7
MCODE_1	R-HSA-622323	突触前尼古丁乙酰胆碱受体	-10.3
MCODE_1	R-HSA-629594	高度钙通透性后突触尼古丁乙酰胆碱受体	-10.3
MCODE_2	R-HSA-1296346	串联孔域钾通道	-10.3
MCODE_2	去吧：0030322	膜电位的稳定	-9.8
MCODE_2	R-HSA-5576886	第四阶段——静息膜电位	-9.7

表3：枢纽基因的MCODE富集分析。

补充文件1：对照组（n=3）基因表达。请点击这里下载此文件。

补充文件2：患者（n=10）核心表基因。请点击这里下载此文件。

讨论

随着AP研究的不断深入，AP中不断检测到新的细胞因子，炎症已成为AS^21,22的形成和发展的重要因素。白蛋白的激活可能切断内皮细胞与血管内膜基质的连接，促进内皮细胞从血管内膜剥离。诱发性血管内膜损伤^23,24。炎症会诱导LDL-C的氧化修饰，而修饰的LDL-C又引发动脉内膜内的炎症过程，从而加速AP的形成²⁵。不稳定斑块最终可能破裂，在^{内外原因的}使用下引发ACS。在斑块破裂过程中，巨噬细胞、血管平滑肌细胞（VSMC）和淋巴细胞分泌炎症因子，如白细胞白介素-1（IL-1）、IL-6、血管间粘连因子-1和细胞间粘连因子-1。同时，白细胞整合素（CD11b/CD18）表达增加，这是一种单核细胞和颗粒细胞受体，表达量增加了^27,28。然而，导致AP形成的炎症分子机制仍有待进一步探讨。

炎症引起的AP的发生和发展是一个复杂的过程，包含多因子作用、多基因变化和多阶段疾病，尤其与许多基因的异常表达密切相关。本研究通过RNA-Seq和生物信息学分析显示，在健康对照组织和AP之间的火山图中，DEGs显示2097个基因上调，1616个下调基因。进一步的KEGG富集分析显示，DEG主要富集于免疫和炎症相关通路。枢纽基因分析确定了前10个枢纽基因，包括CXCR4、CCL4、CCL3、CCL20、CXCL1、CCL5、CXCL8、CD4、CCR2和CCR5。枢纽基因与奥连发炎面板92基因的交汇揭示了5个共同基因，包括CXCL1、CCL20、TNF、CCL3和CCL4。这些结果表明，炎症相关因子CCL3、CCL4和CXCL1可能在AP的病理过程中起关键作用。免疫浸润分析显示，其特征是M0巨噬细胞显著增加，同时斑块中CD8⁺ T细胞、活化NK细胞和静息肥大细胞减少。

M0巨噬细胞代表一个未被定义的池，能够轻易内化氧化的LDL并分化成泡沫细胞，这是早期动脉粥样硬化形成的标志性事件²⁹。该病组中观察到的M0巨噬细胞比例升高，表明这些前体细胞在斑块微环境中积累。CCL4主要由活化的巨噬细胞和T细胞产生，作为持续刺激，通过NFκB信号通路维持巨噬细胞活化，促进粘附分子表达，并诱导基质金属蛋白酶-2和-9，从而促进M0巨噬细胞向促动脉粥样状态转变，直接损害斑块稳定性³⁰.CD8⁺ T细胞比例的降低可能反映了CCL3介导对动脉粥样保护T细胞亚组的抑制。Komissarov 等人证明，T细胞迁移到人类动脉粥样硬化斑块中，主要通过CCR5-CCL3轴³¹进行。此外，Döring等^人发现了 一条非典型通路，CCL17通过CCR8信号诱导CCL3表达，进而抑制调控T细胞分化;CD4⁺ T细胞中CCL3的基因消融提升了FoxP3⁺ Treg数值并限制了动脉粥样硬化，而CCL3给药则加重了疾病并抑制了Treg分化。这一转变可能削弱了保护动脉粥样的CD8⁺调控T细胞，同时促进致病效应T细胞，导致我们分析中观察到CD8⁺ T细胞比例的净减少。活化NK细胞和静息肥大细胞的减少，很可能反映了激活状态的变化，而非这些群体的绝对损失。Bonaccorsi等人³³ 报告称，有症状的颈动脉斑块表现出NK细胞浸润和IFN-γ产生增加，直接将NK细胞活化与临床斑块不稳定性联系起来。对于肥大细胞，Wezel等人³⁴ 证明，激活肥大细胞释放的趋化因子，特别是CXCL1，通过CXCL1/CXCR2轴诱导中性粒细胞招募，从而加剧持续的炎症反应，促进斑块的进展和不稳定。因此，活化的NK细胞和静息肥大细胞比例的减少，更可能反映了它们在炎症斑块环境中的激活、脱颗粒或耗尽，而非真正的数值耗尽。

本研究存在若干局限性。首先，本研究仅基于转录组测序，且样本量有限。除了样本量有限外，还应注意RNA-seq协议的若干技术局限性。体型RNA测序掩盖了细胞异质性;需要单细胞方法来解析CCL3、CCL4和CXCL1的细胞类型特异表达。计算免疫解卷积（CIBERSORT）仅提供估计值，不提供直接测量。RNA丰度并不总是与蛋白质水平相关;需要正交验证。未来研究应通过单细胞转录组学、更大且独立的队列、正交蛋白验证来解决这些局限性。

总之，本研究结果强调了炎症因子在AP病理生理过程中的重要作用。此外，我们鉴定出枢纽基因CCL3、CCL4和CXCL1，这些基因可能形成协调的趋化因子网络，通过促进M0巨噬细胞积累、抑制保护性T细胞亚组以及改变NK细胞和肥大细胞的激活状态来驱动动脉粥样硬化。总体而言，这些发现凸显了三种趋化因子作为斑块免疫微环境的关键调节者及潜在治疗靶点。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
特里佐尔	Invitrogen	15596026CN	RNA提取
纳米滴ND-2000分光光度计	赛莫飞世尔科学	ND2000	RNA浓度检测
安捷伦2100生物分析仪	安捷伦	G2939BA	RNA质量控制
光辉HiSeq TM 2000	光辉	HiSeq 2000	转录组测序
寡核苷D（T）磁珠	新英格兰生物实验室	S1550S	RNA富集