肝炎E病毒荧光减少中和测试用于测量中和抗体滴度

Summary

目前尚无针对非细胞病理阳性RNA病毒E型肝炎病毒（HEV）的标准病毒中和检测方法。这里介绍了一种基于荧光标记病毒衣壳蛋白定量的荧光减少中和试验（FRNT），用于评估抗HEV抗体的疗效。

Abstract

病毒中和测定测量抗体或多种抗体混合物对相应病毒的中和潜能。这是一种评估疫苗候选体和中和抗体有效性的宝贵技术。斑块减少中和试验（PRNT）是一种常用的方法，用于评估病毒特异性中和抗体的滴度。然而，PRNT在非细胞病变病毒中不可行。E型肝炎病毒（HEV）是一种正义单链RNA病毒，属于 肝病毒科。它是全球急性病毒性肝炎的主要原因之一。在哺乳动物细胞培养中，它没有表现出细胞病理效应。中国已有针对HEV的疫苗。然而，世界上大多数地区尚无针对HEV的疫苗或治疗性抗体。多个实验室一直在研发针对HEV的疫苗候选方案。中和检测法用于测量HEV疫苗的有效性，将是研究人员非常有用的工具。这里介绍一种荧光减少中和试验（FRNT），用于估算抗HEV抗体的50%中和滴定（NT₅₀）。使用抗HEV ORF2中和（兔IgG中和HEV）感染Huh7细胞，随后对病毒ORF2蛋白进行免疫荧光染色。在ImageJ应用中定量了荧光阳性细胞，NT₅₀ 估计为2.1 x 10³。该方法可用于估算免疫小鼠血清、HEV回收的单个血清以及实验室制备的抗HEV抗体中存在的抗HEV抗体的NT₅₀ 。

Introduction

E型肝炎病毒（HEV）是一种正义单链RNA病毒，属于肝病毒科^1,2。它通常会引起自限性急性肝炎，但也可能在免疫^{抑制患者中}引发慢性肝炎^3,4。孕妇患暴发性肝衰竭的风险较高，死亡率可达30^%。世界卫生组织（WHO）报告称，2021年全球约有1947万例急性E型肝炎（AHE）病例和3450例因HEV^死亡。HEV主要通过受污染的食物和水传播，原因是卫生条件差;而发达国家的零星职业感染则与食用生肉或未熟肉类^有关6。HEV分为八个基因型。基因型（g）1型和g2型HEV仅感染人类。g3-和g4-HEV拥有多种宿主，如人类、兔子、猪、野猪和鹿。g5和g6-HEV感染野猪，而g7和g8-HEV感染骆驼。中东地区曾报告过一例通过食用骆驼肉和牛奶传播g7-HEV的^病例。HEV感染主要在中低收入国家较为常见。南亚和东南亚、非洲和墨西哥的流行地区曾报告多起水源性疫情，主要由g1引起，较少由g2-HEV感染引起。欧洲和东亚发达国家的职业性零星感染病例大多由g3-HEV ^6,7引起。

HEV基因组是一个7.2 kb加链RNA，5′端含有7-甲基鸟嘌呤帽，三个开放阅读框（ORF）后面是多腺苷酸化的3'端。ORF1编码非结构多蛋白，由七个不同结构域组成：甲基转移酶（Met）、Y结构域、类Papain半胱氨酸蛋白酶（PCP）、V结构域、宏结构域（X结构域）、解旋酶（Hel）和RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）。ORF2编码负责病毒衣壳组装的衣壳蛋白。ORF3编码一种磷蛋白，作为病毒多样蛋白，帮助病毒^排出。g1-HEV中还存在一个额外的开放阅读框ORF4， 通过 帽无关机制翻译，使用位于ORF1内部的核糖体进入位点样元件。ORF4表达通过内质网应激诱导化合物增强。ORF4被提出促进g1-HEV复制复合物^组装10。

尽管HEV在体外复制效率不高，但从E型肝炎患者分离出的一些病毒株成功在肝细胞、肺细胞系和结肠上皮细胞系¹¹中繁殖。然而，在培养细胞中强健地繁殖病毒较为困难。g1-HEV（Sar55株）的感染性cDNA克隆已被用于体外研究，但迄今尚未实现g1-HEV菌株在培养细胞中的高效生产和繁殖。某些g3和g4-HEV菌株在培养细胞中生长得更好¹²。然而，从体外转录并封顶的p6 HEV基因组RNA转染的纯化病毒，仍不足以进行多项检测。此外，所有细胞培养产生的HEV颗粒均呈准包膜，影响其感染性。相比之下，污染食物和水中的HEV是无包膜的，且传染性极强。患者粪便中的HEV为无包膜，是自然感染的常见来源。因此，使用从患者粪便中纯化的HEV确保了哺乳动物细胞培养系统的高效感染。我们早期的研究显示，患者粪便纯化的g1-HEV在定量人类肝癌细胞病毒复制方面具有可靠性（Huh7）。纯化病毒储存在-80°C中可保持感染力多年，已被用于多项独立研究以估算病毒复制量^{10、13、14、15}。本研究设计了一种使用从患者身上纯化的g1-HEV进行HEV中和检测的方法。该病毒经过纯化、滴定、鉴定，并以-80°C的分格保存，以备将来用于中和检测。由于HEV非细胞病变，传统的PRNT方法无法用于估算抗HEV抗体的病毒中和潜能。曾多次尝试开发HEV中和方法，包括基于流式细胞图的中和分析、基于抗原ELISA试剂盒检测细胞上清液分泌pORF2的中和检测法、体外ELISA结合结合测定、基于RT-PCR的测定以及基于荧光的中和测量仪^{16、17、18、19、20}.基于ELISA的检测法间接检测抗体结合，以评估病毒的功能中和，但无法测量真实感染。基于流式细胞术的方法通常通过假病毒测量感染细胞的百分比。基于RT-PCR的中和方法比FRNT更复杂;因此，处理错误的概率更高。另一方面，这里描述的FRNT方法受限于高滴度感染病毒和成像能力的可用性。尽管如此，这是一种高效的方法来测量抗HEV抗体的NT₅₀。

Protocol

机构伦理委员会（IEC）批准，从一名被新德里AIIMS胃肠病科收治的HEV感染患者身上采集粪便样本。参与者均获得知情同意。试剂和所用设备的详细信息列于 材料表中。

1. 病毒分离与定量

1. 在知情同意下，从感染HEV的患者身上采集粪便样本进行病毒纯化。
2. 将粪便样本以10%最终浓度（w/v）重新悬浮于Dulbecco磷缓冲盐水（DPBS）中，并在7800 x g 离心机下4°C下离心1小时。
   注意：处理HEV粪便样本时请戴手套，工作后用70%乙醇清洁工作区域（所有步骤均在生物安全柜内完成）。
3. 收集上清液并通过0.45微米滤网。
4. 将8%在0.4 M NaCl制备的PEG6000加入病毒上清液中，并在0°C下培养16小时。
5. 在18,000 x g 下离心30分钟，温度为4°C。
6. 去除上清液，将沉淀重新悬浮在40毫升的杜尔贝科改良鹰培养基（DMEM）中。
7. 使用30千道尔膜筒通过切向流过滤（TFF）将悬浮液浓缩至5毫升体积。通过生物安全柜内的0.2微米过滤器过滤，制作分段，保存在-80°C。 使用一个分量分离总RNA并进行RT-qPCR。
8. 使用多次稀释pSK-HEV2质粒[pBluscript载体，含有g1-HEV感染性克隆cDNA（基因库编号：AF444002.1]）（10倍序列稀释下1 ng至0.000001 ng DNA/反应）绘制病毒RNA定量标准图。
9. 在X轴绘制pSK-HEV2 DNA数量，Y轴对应的Ct值。从标准图中推算病毒RNA浓度。
10. 从标准图中量化HEV基因组RNA水平，并使用以下公式计算病毒的基因组拷贝数：拷贝数 = ng*（数量/摩尔）/碱基 *（ng/g）*（g/摩尔碱基数）。

2. Huh7细胞被g1-HEV感染

1. 拿一个含有Huh7细胞的T75瓶。用显微镜检查细胞是否合流且健康。
2. 通过吸气器移除介质（在生物安全柜中执行所有步骤）。加入10毫升DPBS，搅拌后取出。
3. 加入1毫升0.05%胰蛋白酶溶液，确保均匀涂抹在表面。
4. 在_CO2 培养箱内孵育30–60秒，直到细胞脱落90%。
5. 加入5毫升完整培养基，均匀涂抹在T75表面，并多次移液，使单细胞群体均匀且无聚集体。
6. 将细胞悬浮液转移到50毫升锥形管中，在室温下以200 x g 离心5分钟。
7. 从生物安全柜内的锥形管中抽取培养基。
8. 将5毫升完整培养基加入管内，通过轻柔移液将细胞悬浮至均匀的悬浮状态。
9. 取10微升细胞悬浮液，放在细胞计数载玻片上。将细胞分为4个象限，计算平均值/毫升。
10. 种子0.5 x 10个6个细胞，6孔板，置于2 mL DMEM（补充10% FBS）。
11. 次日，取出培养基，用1毫升DPBS清洗，然后加入50微升g1-HEV病毒（相当于4.5 ×10个纯化后的g1-HEV基因组拷贝）于1毫升无血清培养基（SFM）。
12. 将细胞放入5%_CO2 培养箱，温度为37°C，孵育1小时。
13. 用500微升DPBS清洗细胞，然后加入2毫升完整培养基（DMEM补充2% FBS）。
14. 在37°C的5%二氧化碳培养箱中孵育细胞72小时。
15. 继续进行下游检测。

3. RT-qPCR测定

1. 从6孔板（步骤2.15）取出培养基，用1毫升DPBS清洗细胞。
2. 直接向6孔板加入1毫升TRI试剂，以裂解细胞。将裂解液上下移液多次移液，然后转移到1.5毫升微离心管中。
   注意：TRI试剂如果吸入、吞咽或接触皮肤则有毒。使用试剂时请戴防护手套，避免吸入蒸汽。最好是在化学罩内使用。所有塑料制品都应为无RNAse级别。
3. 在室温下培养样品5分钟。加入0.2毫升氯仿，密封管子，然后进行10–15秒的漩涡浸泡（氯仿有害且有毒，需佩戴适当的个人防护装备处理）。孵育2–3分钟。
4. 在12,000 × g 、4°C下离心15分钟。 将水相转移到新的1.5毫升微离心管中。向水相中加入0.5毫升异丙醇，通过倒置管子几次均匀混合。
5. 在室温下孵育10分钟。
6. 离心机在12,000 克 ×4摄氏度下离心10分钟。 丢弃上清液。
7. 将沉淀物重新悬浮在1毫升75%乙醇中。离心机在7500 克×4 摄氏度离心5分钟。 丢弃上清液。
8. 将RNA沉淀晾干5–10分钟。
9. 将沉淀重新悬浮在50微升无核酸酶水（NFW）中，在55°C下培养10分钟，手工敲击混合，并通过分光光度测量RNA浓度。
10. 使用以下引物进行基于TaqMan探针的一步RT-qPCR：
    g1-HEV的FP：5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′;
    g1-HEV RP：5′TATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′;
    g1-HEV探头：5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGGGAATCACC [BHQ1]3′;核糖核酸酶P（RP）FP：5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′;
    RP RP：5英尺GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3′;
    RP探针：5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTCTGGGCG[BHQ1]3′。
11. 使用2^−ΔΔCT 方法计算g1-HEV RNA的相对定量。

4. 免疫荧光测定（IFA）

1. 按照前面步骤中描述的拆分Huh7单元。
2. 将显微级玻璃盖片放入12孔板中，在1毫升完整培养基中播种0.2 ×10个⁶ 细胞/孔（DMEM加10% FBS）。
3. 用1.8×10个4个纯化的g1-HEV基因组拷贝，在500微升每分钟中感染细胞。将细胞放入5%_CO2培养箱，温度为37°C，孵育1小时。
4. 用500微升DPBS洗细胞三次。
5. 加入2毫升全培养基（DMEM补充2% FBS）。
6. 将细胞在5%_CO2 培养箱中，37°C培养72小时。
7. 用500微升DPBS洗细胞三次，每次洗涤间隔室温培养5分钟。
8. 向细胞中加入500微升4%的PFA（对甲醛），并在室温下培养20分钟。
   注意：4%的PFA如果吸入有害，会引起皮肤和眼睛刺激，并可能引发过敏性皮肤反应。为了安全起见，使用试剂时请佩戴防护手套和护目镜，并避免吸入蒸汽。
9. 用500微升DPBS清洗细胞，每次3次，每次5分钟，然后在DPBS中培养30分钟。
10. 向细胞中加入250微升阻断液（5%普通山羊血清，0.5%BSA，0.3%Triton X-100，DPBS中），并在室温（RT）下培养1小时。
11. 去除阻断液，用500微升DPBS洗涤一次，并用250微升原版抗体（DPBS，0.3% Triton X-100,5% BSA，0.5%普通山羊血清，1：500稀释抗ORF2抗体或兔IgG）在4°C下培养细胞，隔夜。
12. 用500微升DPBS洗细胞三次，每次5分钟。
13. 用二级抗体（DPBS，0.3% Triton X-100,5% BSA，0.5% 普通山羊血清，1：1000稀释山羊抗兔Alexa fluor 594抗体）在RT下孵育细胞1小时。
14. 用DPBS清洗细胞三次，每次5分钟。在玻片上加入10微升Prolong金抗衰减试剂和DAPI（4′，6-二酰胺-2-苯哟多）溶液。将含有盖片的细胞安装在玻璃载玻片上，使细胞朝向DAPI溶液，避免气泡。
15. 用指甲油封住盖片。
16. 用60倍物镜在共軛焦显微镜中获取荧光图像。
17. 设置显微镜进行荧光信号的可视化和获取。
18. 首先，以60倍放大对应的载玻片中对应的模拟细胞核（未感染细胞）。调整阈值电压和激光，使得无背景荧光信号可见。检查对照抗体（兔IgG染色）载玻片，确认没有背景荧光信号可见。
19. 在不改变上述参数的情况下，可视化HEV感染细胞的载玻片。获取1028 x 1028像素的图像。

5. 荧光还原中和测试（FRNT）

1. Huh7细胞的病毒中和与感染
   1. 按照前面步骤中描述的拆分Huh7单元。将盖片放入12孔板中，在1毫升完整培养基（DMEM + 10% FBS）中播种0.2×10个⁶ 细胞/孔。
   2. 次日，在SFM中制备10倍序列稀释抗体（抗ORF2和兔IgG），起始浓度为25 μg/mL，分1：10至1：10 5稀释。最终稀释体积应为100微升。
   3. 在每次抗体稀释中加入1.8 x 10 4份纯化后的g1-HEV基因组拷贝。
   4. 将抗体和病毒混合物置于5%_CO2 培养箱中，37°C，孵育1小时。
   5. 取出含有Huh7细胞的12孔板（前一天播种），并用500微升DPBS清洗细胞。
   6. 将抗体-病毒混合物加入细胞中，并将平板放入5%_CO2 培养箱中，37°C下保存1小时。
   7. 用500微升DPBS清洗细胞。
   8. 将DMEM+2%FBS培养基加入细胞，并将平板放入5%_CO2 培养箱，37°C培养72小时。
   9. 按照第4节（步骤4.7起）中提到的进行IFA。
   10. 使用10倍物镜在1028 x 1028像素中获取5个随机场的荧光图像。
   11. 将图片保存为JPEG/TIFF格式。使用ImageJ分析对荧光斑点进行定量，如下所述。
   12. 要分析ImageJ中的图像，将RGB图像转换为8位图像。点击 图片>输入>8位。
   13. 调整图像的阈值。点击 图片>调整阈值>。选择下限值为40，上限为255。
   14. 计数时，选择 分析>分析粒子。选择显示结果、清除结果、总结、边缘排除和复合投资回报率。取消选择添加到管理器，添加洞，并叠加。按下确定键，荧光点数就会显示出来。
2. 估计新新币₅₀
   1. 用以下公式计算每种稀释物的中和百分比：
      中和百分比= 100-[（稀释中的ORF2阳性细胞）⁄（病毒对照中的ORF2阳性细胞））乘以100]
   2. 请用以下公式计算NT₅₀ ：
      log₁₀（NT₅₀） = log₁₀D1+（50-N1 ⁄ N2-N1） X （log₁₀D2-log₁₀D1）
      其中，D1 = 稀释，且中和率低于50
      D2 = 稀释，中和率超过50
      N1=中和率低于50%
      N2= 中和率超过50%
   3. 计算Log₁₀ NT₅₀ 的抗对数，公式如下：
      新约₅₀=10^{对数₁₀（新约₅₀）}
   4. 绘制所有字段的（均值±标准差）图。

Results

Huh7细胞感染g1-HEV及病毒特性分析

g1-HEV通过一系列步骤从粪便样本中分离出来，如图1A所示。通过RT-qPCR估算纯化g1-HEV的基因组拷贝数，随后在-80°C下储存。 为确认病毒感染和复制，Huh7细胞被纯化的g1-HEV库存1.8×4基因组当量分子感染72小时，随后进行RT-qPCR和IFA。与模拟感染细胞相比，感染细胞中检测到显著水平的g1-HEV RNA（见图2A）。同样，IFA使用抗ORF2抗体确认感染Huh7细胞中的ORF2表达（见图2B）。

荧光还原中和测试

FRNT测定如图所示进行（

Discussion

FRNT是一种基于免疫染色的方法，用于估算抗体的中和潜力。它已被用于估计多种病毒抗体的NT₅₀值，包括登革热病毒（DENV）、重症急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）和日本脑炎病毒（JEV）23,24,25。该方法中，病毒与测试抗体（或血清）一起培养，然后用混合物感染培养细胞。感染细胞被允许培养较长时间，以便病毒可检测复制。最后，细胞被病毒特异性抗体染色;该细胞的感染率被量化并与并行处理的抗体-病毒感染对照样本进行比较。如果测试抗体能中和病毒，感染细胞的比例会降低，反映测试抗体的中和潜力。总体而言，检测方法需要通过调整病毒和抗体浓度，以及感染后的潜伏期来优化。此外，该方法的关键步骤包括从粪便中分离高滴度HEV、用抗ORF2抗体进行免疫染色以及高分辨率荧光图像采集。粪便样本中的HEV是无包膜的，使其能够被抗ORF2抗体高效中和。相比之下，血液中循环或细...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL微量离心管	Axygen	MCT-150-C
12孔细胞培养皿	Corning	3512
37度培养箱摇床	Thermo Scientific	50163013
4',6-二胺基-2-苯基吲哚	Abcam	AB104139	DAPI
50mL离心管	Falcon	352070
6孔细胞培养皿	Corning	3516
Alexa荧光594二抗IgG抗体	Thermo Scientific	A-11012
抗ORF2抗体	Genscript	NA	由Genscript定制合成并在我们实验室中表征14
抗兔IgG抗体	Genscript	NA
牛血清白蛋白	HIMEDIA	MB083	BSA
共聚焦显微镜	Olympus	FV3000
DMEM，高葡萄糖	HIMEDIA	AL007A
胎牛血清	GIBCO	16000-044	FBS
ImageJ 1.54g	ImageJ.org（Wayne Rasband及其贡献者，NIH，美国）
正常山羊血清	HIMEDIA	RM-10701
甲醛	HIMEDIA	GRN3660	PFA
磷酸盐缓冲盐水pH 7.4	HIMEDIA	TL1006	PBS
聚乙二醇6000	SIGMA	81255	PEG6000
SOLIScript 1步探针套件	SOLIS BIODYNE	08-57-00250
TRI试剂	Molecular Research Centre	TR118
Triton X100	SIGMA	X100
胰蛋白酶-EDTA	GIBCO	25300-54