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方法文章

戊型肝炎病毒荧光减量中和试验用于测定中和抗体滴度

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DOI：

10.3791/69892

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2026年5月22日

 ,  ,  ,  , 
1Virology Laboratory, Centre for Virus Research, Therapeutics and Vaccines, Translational Health Science and Technology Institute, 2Department of Gastroenterology, All India Institute of Medical Sciences, New Delhi

本文内容

摘要

目前尚无针对戊型肝炎病毒（HEV）的标准病毒中和检测方法，HEV 是一种非致细胞病变的正链 RNA 病毒。本文介绍一种基于荧光标记病毒衣壳蛋白定量的荧光减少中和试验（FRNT），用于评估抗 HEV 抗体的中和效果。  

摘要

病毒中和试验用于检测抗体或抗体混合物对相应病毒的中和能力，是评估疫苗候选物及抗病毒中和抗体效果的重要技术。蚀斑减少中和试验（PRNT）是一种常用的测定病毒特异性中和抗体滴度的方法。然而，对于非致细胞病变病毒，PRNT并不可行。戊型肝炎病毒（HEV）属于Hepeviridae科，是一种正义单链RNA病毒，是全球急性病毒性肝炎的主要病因之一。该病毒在哺乳动物细胞培养中不产生明显的细胞病变效应。目前中国已有针对HEV的疫苗，但在世界大部分地区仍缺乏可用的疫苗或治疗性抗体。多个实验室正在研发抗HEV的疫苗候选物。因此，一种可用于评估HEV疫苗效力的中和试验对研究人员而言将极为重要。本文介绍了一种荧光减少中和试验（FRNT），用于估算抗HEV抗体的50%中和滴度（NT50）。实验中使用抗HEV ORF2抗体或兔IgG中和后的HEV感染Huh7细胞，随后对病毒ORF2蛋白进行免疫荧光染色。利用ImageJ软件定量分析荧光阳性细胞，测得NT50为2.1 × 103。该方法可用于评估免疫小鼠血清、HEV康复个体血清以及实验室制备的抗HEV抗体中的NT50值。

引言

戊型肝炎病毒（HEV）是一种正义单链RNA病毒，属于Hepeviridae科1,2。该病毒通常引起自限性急性肝炎，但在免疫抑制个体中可导致慢性肝炎3,4。孕妇发展为暴发性肝功能衰竭的风险较高，死亡率可高达30%5。世界卫生组织（WHO）报告称，2021年全球约有1947万例急性戊型肝炎（AHE）病例，由HEV导致的死亡人数约为3450人6。在发展中国家，由于卫生条件较差，HEV主要通过受污染的食物和水传播；而在发达国家，偶发的职业性感染则与食用生的或未煮熟的肉类有关6。HEV分为八个基因型。基因型（g）1和g2型HEV仅感染人类。g3和g4型HEV具有广泛的宿主，包括人、兔、猪、野猪和鹿。g5和g6型HEV感染野猪，而g7和g8型HEV感染骆驼。已有1例在中东地区因食用骆驼肉和骆驼奶导致g7型HEV人际传播的病例报道7,8。HEV感染在中低收入国家较为常见。在南亚、东南亚、非洲和墨西哥等地方性流行区域，已报告多起水源性暴发疫情，主要由g1型HEV引起，较少由g2型HEV引起。欧洲和东亚等发达国家的职业性散发感染病例则主要由g3型HEV引起6,7。

HEV 基因组为一条 7.2 kb 的正链 RNA，其 5′ 端带有 7-甲基鸟苷帽结构，随后包含三个开放阅读框（ORF），3′ 端为多聚腺苷酸尾。ORF1 编码非结构多聚蛋白，由七个不同的功能区组成：甲基转移酶（Met）、Y 结构域、类木瓜蛋白酶半胱氨酸蛋白酶（PCP）、V 结构域、宏结构域（X 结构域）、解旋酶（Hel）以及 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp）。ORF2 编码衣壳蛋白，负责病毒衣壳的组装。ORF3 编码一种磷蛋白，作为病毒孔蛋白发挥作用，并协助病毒释放。9在g1-HEV中存在一个额外的开放阅读框ORF4，该阅读框可被翻译 通过 一种不依赖于帽结构的机制，通过位于ORF1内的类似内部核糖体进入位点的元件实现。内质网应激诱导化合物可增强ORF4的表达。ORF4被认为能够促进g1型HEV复制复合体的组装10.

尽管HEV不能高效复制 体外一些从戊型肝炎患者中分离出的病毒株已在肝细胞、肺细胞系和结肠上皮细胞系中成功增殖11然而，在培养细胞中 robust 地扩增该病毒具有较大难度。g1-HEV（Sar55 株）的感染性 cDNA 克隆已被用于 体外 研究，但迄今为止尚未实现基因1型HEV毒株在培养细胞中的高效产生和扩增。一些基因3型和基因4型HEV毒株在培养细胞中具有更好的生长能力。12然而，从转染细胞中纯化获得的病毒产量 体外 转录并加帽的p6 HEV基因组RNA不足以满足多种检测需求。此外，所有细胞培养产生的HEV颗粒均为准包膜结构，这会影响其感染性。相比之下，存在于污染食物和水中的HEV为无包膜形式，具有高度感染性。患者粪便中的HEV同样为无包膜形态，是自然感染的常见来源。因此，使用从患者粪便中纯化的HEV可确保在哺乳动物细胞培养系统中实现高效感染。我们先前的研究已证实，从患者粪便中纯化的g1-HEV在定量人肝癌细胞（Huh7）中病毒复制方面具有可靠性。将纯化的病毒储存于-80 °C可长期保持其感染性，且该病毒已在多项独立研究中被用于评估病毒复制水平10,13,14,15本研究设计了一种使用从患者体内获得的纯化g1-HEV的HEV中和试验。该病毒经过纯化、滴定、表征后，分装保存于-80℃ °C 以备将来用于中和试验。由于戊型肝炎病毒（HEV）不具有细胞病变效应，传统的空斑减少中和试验（PRNT）方法无法用于评估抗-HEV抗体的病毒中和能力。已有多种针对HEV的中和试验开发尝试，包括基于流式细胞术的中和试验、基于抗原ELISA试剂盒的中和试验以检测分泌至细胞上清液中的pORF2蛋白，以及一种 体外 基于ELISA的结合实验、基于RT-PCR的检测实验和基于荧光的中和实验16,17,18,19,20基于ELISA的检测方法通过间接检测抗体结合来评估病毒的功能性中和作用，但无法测量真实的感染情况。基于流式细胞术的方法通常使用假病毒来测定感染细胞的百分比。基于RT-PCR的中和检测方法比FRNT更复杂，因此操作误差的可能性更高。另一方面，本文所述的FRNT方法受限于高滴度感染性病毒的可获得性以及成像能力。尽管如此，它仍是一种测量中和效价（NT）的有效方法50 抗HEV抗体

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方案

已获得机构伦理委员会（IEC）批准，以采集来自收治于新德里AIIMS消化内科的HEV感染患者的粪便样本。研究中参与患者的知情同意书已签署。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.

1. 病毒分离与定量

  1. 在获得知情同意后，从HEV感染患者处获取粪便样本，用于病毒纯化。
  2. 将粪便样本用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）重悬，终浓度为10%（w/v），在4 °C下以7800 × g离心1小时。
    ​注意：处理HEV粪便样本时需佩戴手套，操作结束后用70%乙醇清洁工作区域（所有步骤均需在生物安全柜内进行）。
  3. 收集上清液，并通过0.45 µm滤膜过滤。
  4. 向病毒上清液中加入终浓度为8%的PEG6000（溶于0.4 M NaCl中），在0 °C孵育16小时。
  5. 在4 °C下以18,000 × g离心30分钟。
  6. 弃去上清液，将沉淀物重悬于40 mL Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。
  7. 使用30 kDa膜 cartridge 通过切向流过滤（TFF）将悬液浓缩至5 mL体积，在生物安全柜内经0.2 µm滤膜过滤，分装后于-80 °C保存。取一份分装样品用于总RNA提取并进行RT-qPCR。
  8. 使用pSK-HEV2质粒[含有基因型1 HEV感染性克隆cDNA的pBluescript载体（Genbank ID: AF444002.1）]的多个稀释浓度（1 ng至0.000001 ng DNA/反应，10倍系列稀释），绘制用于病毒RNA定量的标准曲线。
  9. 以pSK-HEV2 DNA量为X轴，对应的Ct值为Y轴绘制标准曲线，并根据该曲线推算病毒RNA浓度。
  10. 根据标准曲线定量HEV基因组RNA水平，并使用以下公式计算病毒基因组拷贝数：拷贝数 = ng × (阿伏伽德罗常数/摩尔) / 碱基数 × (ng/g) × (g/摩尔碱基)。

2. 使用 g1-HEV 感染 Huh7 细胞

  1. 取一个含有 Huh7 细胞的 T75 培养瓶。在显微镜下检查细胞是否融合且状态健康。
  2. 用吸管吸除培养基（所有步骤均在生物安全柜中进行）。加入 10 mL DPBS，轻轻晃动后吸除。
  3. 加入 1 mL 0.05% 胰蛋白酶溶液，确保其均匀覆盖培养瓶表面。
  4. 置于 CO2 培养箱中孵育 30–60 秒，直至细胞有 90% 脱落。
  5. 加入 5 mL 完全培养基，均匀覆盖 T75 培养瓶整个表面，并反复吹打数次，以获得均匀的单细胞悬液，避免细胞团块。
  6. 将细胞悬液转移至 50 mL 锥形管中，在室温下以 200 × g 离心 5 分钟。
  7. 在生物安全柜内用吸管吸除锥形管中的培养基。
  8. 向管中加入 5 mL 完全培养基，通过轻柔吹打使细胞重悬成均匀的单细胞悬液。
  9. 取 10 µL 细胞悬液滴加到细胞计数板上。计数四个象限内的细胞数，计算每毫升的平均细胞数。
  10. 在 6 孔板中每孔接种 0.5 × 106 个细胞，加入 2 mL DMEM 培养基（含 10% FBS）。
  11. 次日，吸除培养基，用 1 mL DPBS 洗涤一次，然后在 1 mL 无血清培养基（SFM）中加入 50 µL g1-HEV 病毒（相当于 4.5 × 104 拷贝纯化的 g1-HEV 基因组）。
  12. 将细胞置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 1 小时。
  13. 用 500 µL DPBS 洗涤细胞，然后加入 2 mL 完全培养基（DMEM 补充 2% FBS）。
  14. 将细胞在 37 °C、5% CO2 培养箱中继续孵育 72 小时。
  15. 进行后续下游检测。

3. 逆转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测

  1. 从6孔板（步骤2.15）中移除培养基，并用1 mL DPBS洗涤细胞。
  2. 向6孔板中直接加入1 mL TRI Reagent以裂解细胞。用移液器将裂解液上下吹打数次，然后转移至1.5 mL微量离心管中。
    注意：TRI试剂若被吸入、吞咽或接触皮肤具有毒性。使用该试剂时应佩戴防护手套，并避免吸入蒸气。建议在化学通风橱内操作。所有塑料器皿应为无RNA酶级。
  3. 将样品在室温下孵育5分钟。加入0.2 mL氯仿，盖紧管盖，涡旋振荡10–15秒（氯仿具有危害性和毒性，需佩戴适当的个人防护装备操作）。孵育2–3分钟。
  4. 在4 °C条件下，以12,000 × g离心15分钟。将水相转移至新的1.5 mL微量离心管中。向水相中加入0.5 mL异丙醇，通过反复倒置管子充分混匀。
  5. 在室温下孵育10分钟。
  6. 在4 °C条件下，以12,000 × g离心10分钟。弃去上清液。
  7. 用1 mL 75%乙醇重悬沉淀。在4 °C条件下，以7,500 × g离心5分钟。弃去上清液。
  8. 将RNA沉淀在空气中干燥5–10分钟。
  9. 用50 µL无核酸酶水（NFW）重悬沉淀，在55 °C孵育10分钟，用手轻弹混匀，并通过分光光度法测定RNA浓度。
  10. 使用以下引物进行基于TaqMan探针的一步法RT-qPCR：
    g1-HEV FP: 5′TATACTCGAGGGTGCCGATCGGTCCC3′;
    g1-HEV RP: 5′TATACCATGGCATCTGGCAGCAAGCTCAG3′;
    g1-HEV 探针: 5′[FAM] TTGACGCCTGGGAGCGGAATCACC [BHQ1]3′; 核糖核酸酶P（RP）FP: 5′AGATTTGGACCTGCGAGCG3′;
    RP RP: 5′GAGCGGCTGTCTCCACAAGT3′;
    ​RP 探针: 5′[FAM]TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG[BHQ1]3′。
  11. 采用2−ΔΔCT 法计算g1-HEV RNA的相对定量。

4. 免疫荧光检测（IFA）

  1. 按照先前步骤所述对Huh7细胞进行传代。
  2. 将显微镜级玻璃盖玻片放入12孔板中，每孔接种0.2 × 106个细胞于1 mL完全培养基（含10% FBS的DMEM）中。
  3. 用500 µL无血清培养基（SFM）中含有1.8 × 104个基因组拷贝的纯化g1-HEV感染细胞。在37 °C、5% CO2培养箱中孵育1小时。
  4. 用500 µL DPBS洗涤细胞三次。
  5. 每孔加入2 mL完全培养基（含2% FBS的DMEM）。
  6. 在37 °C、5% CO2培养箱中孵育细胞72小时。
  7. 用500 µL DPBS洗涤细胞三次，每次洗涤之间于室温孵育5分钟。
  8. 向细胞中加入500 µL 4% PFA（多聚甲醛），室温孵育20分钟。
    ​注意：4% PFA吸入有害，可引起皮肤和眼睛刺激，可能引发过敏性皮肤反应。操作时请佩戴防护手套和护目镜，避免吸入蒸气。
  9. 用500 µL DPBS洗涤细胞三次，每次5分钟，并在DPBS中继续孵育30分钟。
  10. 向细胞中加入250 µL封闭液（含5%正常山羊血清、0.5% BSA、0.3% Triton X-100的DPBS），室温孵育1小时。
  11. 移除封闭液，用500 µL DPBS洗涤一次，然后加入250 µL一抗溶液（DPBS中含0.3% Triton X-100、5% BSA、0.5%正常山羊血清，以及1:500稀释的抗ORF2抗体或兔IgG），4 °C过夜孵育。
  12. 用500 µL DPBS洗涤细胞三次，每次5分钟。
  13. 加入二抗溶液（DPBS中含0.3% Triton X-100、5% BSA、0.5%正常山羊血清，1:1000稀释的山羊抗兔Alexa Fluor 594抗体），室温孵育1小时。
  14. 用DPBS洗涤细胞三次，每次5分钟。在载玻片上滴加10 µL含DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）的Prolong Gold抗荧光淬灭封片剂。将含有细胞的盖玻片细胞面朝下覆盖在DAPI溶液上，避免产生气泡。
  15. 用指甲油密封盖玻片。
  16. 使用60倍物镜在共聚焦显微镜下采集荧光图像。
  17. 设置显微镜以进行荧光信号的观察与图像采集。
  18. 首先在60倍放大倍数下聚焦模拟感染（未感染）细胞对应的载玻片上的细胞核。调节电压阈值和激光强度，使背景荧光信号不可见。检查对照抗体（兔IgG）染色的载玻片，确认无背景荧光信号。
  19. 在不改变上述参数的情况下观察HEV感染细胞的载玻片，并以1028 × 1028像素分辨率采集图像。

5. 荧光减少中和试验（FRNT）

  1. 病毒中和与Huh7细胞感染
    1. 按照先前步骤对Huh7细胞进行传代。将盖玻片放入12孔板中，每孔接种0.2 × 106个细胞于1 mL完全培养基（DMEM + 10% FBS）中。
    2. 次日，在SFM中配制抗体（抗ORF2抗体和兔IgG）的10倍系列稀释液，起始浓度为25 µg/mL，以1:10梯度稀释至1:105。每个稀释度的终体积应为100 µL。
    3. 向每种抗体稀释液中加入相当于1.8 x 104个基因组拷贝的纯化g1-HEV病毒。
    4. 将抗体与病毒混合物置于含5% CO2的培养箱中，37 °C孵育1小时。
    5. 取出前一天接种Huh7细胞的12孔板，用500 µL DPBS洗涤细胞一次。
    6. 将抗体-病毒混合物加入细胞中，将培养板置于含5% CO2的培养箱中，37 °C孵育1小时。
    7. 用500 µL DPBS洗涤细胞一次。
    8. 向细胞中加入DMEM + 2% FBS培养基，将培养板置于含5% CO2的培养箱中，37 °C继续培养72小时。
    9. 按第4节（步骤4.7起）所述进行免疫荧光染色（IFA）。
    10. 使用10倍物镜在1028 x 1028像素下采集5个随机视野的荧光图像。
    11. 将图像保存为JPEG/TIFF格式。按照下文所述方法，使用ImageJ软件对荧光斑点进行定量分析。
    12. 在ImageJ中分析图像时，先将RGB图像转换为8位图像。点击 图像 > 类型 > 8位。
    13. 调整图像的阈值。点击 图像 > 调整 > 阈值，设置下限阈值为40，上限阈值为255。
    14. 进行计数时，选择 分析> 分析颗粒。勾选“显示结果”、“清除结果”、“汇总”、“排除边缘”和“复合ROI”；取消勾选“添加到管理器”、“包含孔洞”和“叠加”。点击“确定”，荧光斑点计数结果将自动显示。
  2. NT50的估算
    1. 使用以下公式计算每个稀释度的中和率：
      % 中和率 = 100 - [((稀释样本中的ORF2阳性细胞数)⁄(病毒对照组中的ORF2阳性细胞数))  × 100]
    2. 使用以下公式计算NT50：
      log10(NT50) = log10D1 + (50 - N1 ⁄ N2 - N1) × (log10D2 - log10D1)
      其中，D1 = 中和率低于50%时的稀释倍数
      D2 = 中和率高于50%时的稀释倍数
      N1 = 低于50%的中和率值
      N2 = 高于50%的中和率值
    3. 使用以下公式计算Log10 NT50的反对数：
      NT50 = 10log10(NT50)
    4. 绘制所有视野的（均值±标准差）统计图。

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结果

使用g1-HEV感染Huh7细胞及病毒表征

g1型HEV通过一系列步骤从粪便样本中分离获得，如图所示（图1A）。使用RT-qPCR方法估测纯化后的g1-HEV基因组拷贝数，随后在-80 °C保存。为确认病毒感染与复制情况，将纯化的g1-HEV病毒液以每细胞1.8 × 104个基因组拷贝当量感染Huh7细胞，持续72小时，之后进行RT-qPCR和IFA检测。与模拟感染细胞相比，感染细胞中检测到显著水平的g1-HEV RNA（图2A）。同样，使用抗ORF2抗体的IFA检测证实了感染的Huh7细胞中存在ORF2蛋白表达（图2B）。

荧光减少中和试验

FRNT 检测按所示方法进行（

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讨论

FRNT 是一种基于免疫染色的方法，用于评估抗体的中和能力。该方法已被用于估算针对多种病毒的抗体的 NT50 值，包括登革病毒（DENV）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）和日本脑炎病毒（JEV）23,24,25。在此方法中，先将病毒与待测抗体（或血清）共同孵育，然后用该混合物感染培养的细胞。感染后的细胞需孵育较长时间，以允许病毒进行可检测的复制。最后，使用病毒特异性抗体对细胞进行免疫染色，定量感染细胞的比例，并与平行处理的对照抗体-病毒感染样本进行比较。如果待测抗体具有中和病毒的能力，则感染细胞的比例会降低，从而反映该抗体的中和潜力。总体而言，该实验需要通过滴定病毒和抗体浓度以及感染后的孵育时间来进行优化。此外，该方法中的关键步骤包括从粪便中分离高滴度的HEV、使用抗ORF2抗体进行免疫染色，以及高分辨率荧光图像的采集。粪便样本中存在的HEV为无包膜病毒，因此可被抗ORF2抗体高效中和。相比之下，血液中循环或...

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披露

作者声明无竞争利益。

致谢

本研究部分由印度政府生物技术部生物技术产业研究援助委员会授予MS、S和BN的资助项目提供资金支持。MS实验室的研究工作由转化健康科学与技术研究所的核心资助支持。SA由印度政府医学研究委员会资助的项目研究科学家职位提供支持。UB由印度政府生物技术部资助的高级研究奖学金提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 mL 微量离心管AxygenMCT-150-C
12 孔细胞培养板Corning3512
37 度摇床培养箱Thermo Scientific50163013
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚AbcamAB104139DAPI
50 mL 离心管Falcon352070
6 孔细胞培养板Corning 3516
Alexa Fluor 594 标记的二抗 IgG 抗体Thermo ScientificA-11012
抗 ORF2 抗体GenscriptNA由 Genscript 定制合成，并在本实验室中进行表征14
抗兔 IgG 抗体GenscriptNA
牛血清白蛋白HIMEDIAMB083BSA
共聚焦显微镜OlympusFV3000
DMEM，高糖HIMEDIAAL007A
胎牛血清GIBCO16000-044FBS
ImageJ 1.54gImageJ.org (Wayne Rasband 和贡献者，NIH，美国)
正常山羊血清HIMEDIARM-10701
多聚甲醛HIMEDIAGRN3660PFA
磷酸盐缓冲液，pH 7.4HIMEDIATL1006PBS
聚乙二醇 6000SIGMA81255PEG6000
SOLIScript 一步法探针试剂盒SOLIS BIODYNE08-57-00250
TRI 试剂Molecular Research CentreTR118
吐温 X-100SIGMAX100
胰蛋白酶-EDTAGIBCO25300-54

参考文献

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