肝炎E病毒荧光减少中和测试用于测量中和抗体滴度

Summary

目前尚无针对非细胞病理阳性RNA病毒E型肝炎病毒（HEV）的标准病毒中和检测方法。这里介绍了一种基于荧光标记病毒衣壳蛋白定量的荧光减少中和试验（FRNT），用于评估抗HEV抗体的疗效。

Abstract

病毒中和测定测量抗体或多种抗体混合物对相应病毒的中和潜能。这是一种评估疫苗候选体和中和抗体有效性的宝贵技术。斑块减少中和试验（PRNT）是一种常用的方法，用于评估病毒特异性中和抗体的滴度。然而，PRNT在非细胞病变病毒中不可行。E型肝炎病毒（HEV）是一种正义单链RNA病毒，属于 肝病毒科。它是全球急性病毒性肝炎的主要原因之一。在哺乳动物细胞培养中，它没有表现出细胞病理效应。中国已有针对HEV的疫苗。然而，世界上大多数地区尚无针对HEV的疫苗或治疗性抗体。多个实验室一直在研发针对HEV的疫苗候选方案。中和检测法用于测量HEV疫苗的有效性，将是研究人员非常有用的工具。这里介绍一种荧光减少中和试验（FRNT），用于估算抗HEV抗体的50%中和滴定（NT₅₀）。使用抗HEV ORF2中和（兔IgG中和HEV）感染Huh7细胞，随后对病毒ORF2蛋白进行免疫荧光染色。在ImageJ应用中定量了荧光阳性细胞，NT₅₀ 估计为2.1 x 10³。该方法可用于估算免疫小鼠血清、HEV回收的单个血清以及实验室制备的抗HEV抗体中存在的抗HEV抗体的NT₅₀ 。

Introduction

E型肝炎病毒（HEV）是一种正义单链RNA病毒，属于肝病毒科^1,2。它通常会引起自限性急性肝炎，但也可能在免疫^{抑制患者中}引发慢性肝炎^3,4。孕妇患暴发性肝衰竭的风险较高，死亡率可达30^%。世界卫生组织（WHO）报告称，2021年全球约有1947万例急性E型肝炎（AHE）病例和3450例因HEV^死亡。HEV主要通过受污染的食物和水传播，原因是卫生条件差;而发达国家的零星职业感染则与食用生肉或未熟肉类^有关6。HEV分为八个基因型。基因型（g）1型和g2型HEV仅感染人类。g3-和g4-HEV拥有多种宿主，如人类、兔子、猪、野猪和鹿。g5和g6-HEV感染野猪，而g7和g8-HEV感染骆驼。中东地区曾报告过一例通过食用骆驼肉和牛奶传播g7-HEV的^病例。HEV感染主要在中低收入国家较为常见。南亚和东南亚、非洲和墨西哥的流行地区曾报告多起水源性疫情，主要由g1引起，....

Protocol

机构伦理委员会（IEC）批准，从一名被新德里AIIMS胃肠病科收治的HEV感染患者身上采集粪便样本。参与者均获得知情同意。试剂和所用设备的详细信息列于 材料表中。

1. 病毒分离与定量

1. 在知情同意下，从感染HEV的患者身上采集粪便样本进行病毒纯化。
2. 将粪便样本以10%最终浓度（w/v）重新悬浮于Dulbecco磷缓冲盐水（DPBS）中，并在7800 x g 离心机下4°C下离心1小时。
   注意：处理HEV粪便样本时请戴手套，工作后用70%乙醇清洁工作区域（所有步骤均在生物安全柜内完成）。
3. 收集上清液并通过0.45微米滤网。
4. 将8%在0.4 M NaCl制备的PEG6000加入病毒上清液中，并在0°C下培养16小时。
5. 在18,000 x g 下离心30分钟，温度为4°C。
6. 去除上清液，将沉淀重新悬浮在40毫升的杜尔贝科改良鹰培养基（DMEM）中。
7. 使用30千道尔膜筒通过切向流过滤（TFF）将悬浮液浓缩至5毫升体积。通过生物安全柜内的0.2微米过滤器过滤，制作分段，保存在-80°C。 使用一个分量分离总RNA并进行RT-qPCR。
8. 使用多次稀释p....

Results

Huh7细胞感染g1-HEV及病毒特性分析

g1-HEV通过一系列步骤从粪便样本中分离出来，如图1A所示。通过RT-qPCR估算纯化g1-HEV的基因组拷贝数，随后在-80°C下储存。 为确认病毒感染和复制，Huh7细胞被纯化的g1-HEV库存1.8×4基因组当量分子感染72小时，随后进行RT-qPCR和IFA。与模拟感染细胞相比，感染细胞中检测到显著水平的g1-HEV RNA（见图2A）。同样，IFA使用抗ORF2抗体确认感染Huh7细胞中的ORF2表达（见图2B）。

荧光还原中和测试

FRNT测定如图所示进行（

Discussion

FRNT是一种基于免疫染色的方法，用于估算抗体的中和潜力。它已被用于估计多种病毒抗体的NT₅₀值，包括登革热病毒（DENV）、重症急性呼吸综合征冠状病毒-2（SARS-CoV-2）和日本脑炎病毒（JEV）23,24,25。该方法中，病毒与测试抗体（或血清）一起培养，然后用混合物感染培养细胞。感染细胞被允许培养较长时间，以便病毒可检测复制。最后，细胞被病毒特异性抗体染色;该细胞的感染率被量化并与并行处理的抗体-病毒感染对照样本进行比较。如果测试抗体能中和病毒，感染细胞的比例会降低，反映测试抗体的中和潜力。总体而言，检测方法需要通过调整病毒和抗体浓度，以及感染后的潜伏期来优化。此外，该方法的关键步骤包括从粪便中分离高滴度HEV、用抗ORF2抗体进行免疫染色以及高分辨率荧光图像采集。粪便样本中的HEV是无包膜的，使其能够被抗ORF2抗体高效中和。相比之下，血液中循环或细.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 微量隔管	阿克西根	MCT-150-C
12孔细胞培养皿	科宁	3512
37度孵化器摇篮	热力科学	50163013
4′，6-二酰胺-2-苯吲哆	阿布卡姆	AB104139	达皮
50毫升离心管	猎鹰	352070
6孔细胞培养皿	康宁	3516
Alexa flour 594 二级 IgG 抗体	热力科学	A-11012
抗ORF2抗体	Genscript	匿名	由Genscript定制合成，并在我们实验室鉴定14
抗兔IgG抗体	Genscript	匿名
牛血清白蛋白	希梅迪亚	MB083	BSA
共焦显微镜	奥林匹斯	FV3000
DMEM，高血糖	希梅迪亚	AL007A
胎牛血清	GIBCO	16000-044	FBS
ImageJ 1.54g	ImageJ.org（Wayne Rasband及贡献者，美国国立卫生研究院）
普通山羊血清	希梅迪亚	RM-10701
对甲醛	希梅迪亚	GRN3660	PFA
磷酸盐缓冲盐水pH值 7.4	希梅迪亚	TL1006	PBS
聚乙二醇 6000	SIGMA	81255	PEG6000
SOLIScript 1步探针套件	索利斯生物动力	08-57-00250
TRI试剂	分子研究中心	TR118
特里顿X100	SIGMA	X100
胰蛋白酶-EDTA	GIBCO	25300-54