目前尚无针对戊型肝炎病毒（HEV）的标准病毒中和检测方法，HEV 是一种非致细胞病变的正链 RNA 病毒。本文介绍一种基于荧光标记病毒衣壳蛋白定量的荧光减少中和试验（FRNT），用于评估抗 HEV 抗体的中和效果。
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本文内容
摘要
摘要
病毒中和试验用于检测抗体或抗体混合物对相应病毒的中和能力，是评估疫苗候选物及抗病毒中和抗体效果的重要技术。蚀斑减少中和试验（PRNT）是一种常用的测定病毒特异性中和抗体滴度的方法。然而，对于非致细胞病变病毒，PRNT并不可行。戊型肝炎病毒（HEV）属于Hepeviridae科，是一种正义单链RNA病毒，是全球急性病毒性肝炎的主要病因之一。该病毒在哺乳动物细胞培养中不产生明显的细胞病变效应。目前中国已有针对HEV的疫苗，但在世界大部分地区仍缺乏可用的疫苗或治疗性抗体。多个实验室正在研发抗HEV的疫苗候选物。因此，一种可用于评估HEV疫苗效力的中和试验对研究人员而言将极为重要。本文介绍了一种荧光减少中和试验（FRNT），用于估算抗HEV抗体的50%中和滴度（NT50）。实验中使用抗HEV ORF2抗体或兔IgG中和后的HEV感染Huh7细胞，随后对病毒ORF2蛋白进行免疫荧光染色。利用ImageJ软件定量分析荧光阳性细胞，测得NT50为2.1 × 103。该方法可用于评估免疫小鼠血清、HEV康复个体血清以及实验室制备的抗HEV抗体中的NT50值。
引言
戊型肝炎病毒（HEV）是一种正义单链RNA病毒，属于Hepeviridae科1,2。该病毒通常引起自限性急性肝炎，但在免疫抑制个体中可导致慢性肝炎3,4。孕妇发展为暴发性肝功能衰竭的风险较高，死亡率可高达30%5。世界卫生组织（WHO）报告称，2021年全球约有1947万例急性戊型肝炎（AHE）病例，由HEV导致的死亡人数约为3450人6。在发展中国家，由于卫生条件较差，HEV主要通过受污染的食物和水传播；而在发达国家，偶发的职业性感染则与食用生的或未煮熟的肉类有关6。HEV分为八个基因型。基因型（g）1和g2型HEV仅感染人类。g3和g4型HEV具有广泛的宿主，包括人、兔、猪、野猪和鹿。g5和g6型HEV感染野猪，而g7和g8型HEV感染骆驼。已有1例在中东地区因食用骆驼肉和骆驼奶导致g7型HEV人际传播的病例报道7,8。HEV感染在中低收入国家较为常见。在南亚、东南亚、非洲和墨西哥等地方性流行区域，已报告多起水源性暴发疫....
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方案
已获得机构伦理委员会（IEC）批准，以采集来自收治于新德里AIIMS消化内科的HEV感染患者的粪便样本。研究中参与患者的知情同意书已签署。所用试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 病毒分离与定量
- 在获得知情同意后，从HEV感染患者处获取粪便样本，用于病毒纯化。
- 将粪便样本用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）重悬，终浓度为10%（w/v），在4 °C下以7800 × g离心1小时。
注意：处理HEV粪便样本时需佩戴手套，操作结束后用70%乙醇清洁工作区域（所有步骤均需在生物安全柜内进行）。 - 收集上清液，并通过0.45 µm滤膜过滤。
- 向病毒上清液中加入终浓度为8%的PEG6000（溶于0.4 M NaCl中），在0 °C孵育16小时。
- 在4 °C下以18,000 × g离心30分钟。
- 弃去上清液，将沉淀物重悬于40 mL Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中。
- 使用30 kDa膜 cartridge 通过切向流过滤（TFF）将悬液浓缩至5 mL体积，在生物安全柜内经0.2 µm滤膜过滤，分装后于-80 °C保存。取一份分装样品用于总RNA提取并进行RT-qPCR。 <....
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结果
使用g1-HEV感染Huh7细胞及病毒表征
g1型HEV通过一系列步骤从粪便样本中分离获得，如图所示（图1A）。使用RT-qPCR方法估测纯化后的g1-HEV基因组拷贝数，随后在-80 °C保存。为确认病毒感染与复制情况，将纯化的g1-HEV病毒液以每细胞1.8 × 104个基因组拷贝当量感染Huh7细胞，持续72小时，之后进行RT-qPCR和IFA检测。与模拟感染细胞相比，感染细胞中检测到显著水平的g1-HEV RNA（图2A）。同样，使用抗ORF2抗体的IFA检测证实了感染的Huh7细胞中存在ORF2蛋白表达（图2B）。
荧光减少中和试验
FRNT 检测按所示方法进行（
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讨论
FRNT 是一种基于免疫染色的方法，用于评估抗体的中和能力。该方法已被用于估算针对多种病毒的抗体的 NT50 值，包括登革病毒（DENV）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）和日本脑炎病毒（JEV）23,24,25。在此方法中，先将病毒与待测抗体（或血清）共同孵育，然后用该混合物感染培养的细胞。感染后的细胞需孵育较长时间，以允许病毒进行可检测的复制。最后，使用病毒特异性抗体对细胞进行免疫染色，定量感染细胞的比例，并与平行处理的对照抗体-病毒感染样本进行比较。如果待测抗体具有中和病毒的能力，则感染细胞的比例会降低，从而反映该抗体的中和潜力。总体而言，该实验需要通过滴定病毒和抗体浓度以及感染后的孵育时间来进行优化。此外，该方法中的关键步骤包括从粪便中分离高滴度的HEV、使用抗ORF2抗体进行免疫染色，以及高分辨率荧光图像的采集。粪便样本中存在的HEV为无包膜病毒，因此可被抗ORF2抗体高效中和。相比之下，血液中循环或.......
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
本研究部分由印度政府生物技术部生物技术产业研究援助委员会授予MS、S和BN的资助项目提供资金支持。MS实验室的研究工作由转化健康科学与技术研究所的核心资助支持。SA由印度政府医学研究委员会资助的项目研究科学家职位提供支持。UB由印度政府生物技术部资助的高级研究奖学金提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 微量离心管 | Axygen | MCT-150-C | |
| 12 孔细胞培养板 | Corning | 3512 | |
| 37 度摇床培养箱 | Thermo Scientific | 50163013 | |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚 | Abcam | AB104139 | DAPI |
| 50 mL 离心管 | Falcon | 352070 | |
| 6 孔细胞培养板 | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 594 标记的二抗 IgG 抗体 | Thermo Scientific | A-11012 | |
| 抗 ORF2 抗体 | Genscript | NA | 由 Genscript 定制合成，并在本实验室中进行表征14 |
| 抗兔 IgG 抗体 | Genscript | NA | |
| 牛血清白蛋白 | HIMEDIA | MB083 | BSA |
| 共聚焦显微镜 | Olympus | FV3000 | |
| DMEM，高糖 | HIMEDIA | AL007A | |
| 胎牛血清 | GIBCO | 16000-044 | FBS |
| ImageJ 1.54g | ImageJ.org (Wayne Rasband 和贡献者，NIH，美国) | ||
| 正常山羊血清 | HIMEDIA | RM-10701 | |
| 多聚甲醛 | HIMEDIA | GRN3660 | PFA |
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 | HIMEDIA | TL1006 | PBS |
| 聚乙二醇 6000 | SIGMA | 81255 | PEG6000 |
| SOLIScript 一步法探针试剂盒 | SOLIS BIODYNE | 08-57-00250 | |
| TRI 试剂 | Molecular Research Centre | TR118 | |
| 吐温 X-100 | SIGMA | X100 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | GIBCO | 25300-54 |
参考文献
- Smith, D. B., et al. International Committee on Taxonomy of Viruses Hepeviridae Study Group. Consensus proposals for classification of the family Hepeviridae. J Gen Virol. 95 (Pt 10), 2223-2232 (2014).
- Nan, Y., Zhang, Y. J. Molecular biology and infection of hepatitis E virus. Fron....
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重印与许可
