本研究的目的是建立一种安全且可重复的手术方法，用于对Ambystoma mexicanum进行完整的横向下颌骨截骨，以研究颅面组织的再生能力。
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方法文章
用于研究Ambystoma mexicanum模型中颅面组织再生的下颌损伤模型的设计与标准化
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
颅面复合体是一个解剖学区域，在人类中可能因发育畸形、创伤以及癌症等病理状况而受到影响，导致受损组织的丧失。这促使人们寻求再生这些缺失组织的策略。因此，研究具有再生能力的物种中调控颅面结构损伤后再生反应的细胞与分子机制成为重要方向，其中墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum，A. mexicanum）是一个备受关注的物种。
根据上述原则，本研究在墨西哥钝口螈的下颌设计并标准化了一种可重复的手术损伤模型，以研究损伤组织的再生反应，并模拟在人类中实施的临界缺损。选取体长12-15 cm的幼年/成年动物，使用0.1%三卡因麻醉20-30分钟。随后采用四手操作技术，在下颌骨远端三分之一处进行完全横向截除，包括联合部及旁联合区域，去除相当于齿骨和梅克尔软骨的骨骼结构，以及肌肉、结缔组织、神经和皮肤等软组织。之后对残留骨组织进行修整，并涂抹0.5%磺胺嘧啶。通过宏观观察和透明化技术评估组织反应。所有实验操作均经哥伦比亚安蒂奥基亚大学动物实验伦理委员会批准。结果表明，截肢后的动物能够从形态、结构和功能上再生被移除的颅面结构。
尤为重要的是，本研究提供了一种可重复的手术技术，在需要采集再生组织时，截肢和再截肢动物的存活率达到100%。因此，该手术设计为今后与其他能够再生颅面结构的脊椎动物进行比较分析，以及研究这一再生反应背后的细胞和分子机制，提供了基本的技术基础。
引言
在动物界中，组织、器官和复杂结构的再生能力已有广泛描述1,2,3。因此，了解这些物种在附肢（如肢体和尾部）的某些结构受到损伤或截除后，如何激活并调控再生反应，已成为再生生物学研究的关注重点4,5,6,7,8。
与此项工作密切相关的是，颅面组织再生的研究也是全球范围内备受关注的重要领域，因为该解剖区域极易受到面部创伤、颅面发育障碍、感染性疾病以及包括口腔癌在内的肿瘤性疾病的严重影响9。在存在肿瘤的情况下，通常需要切除颌骨或其他面部区域的部分结构或大范围组织，从而导致后续必须对缺损区域进行重建并促进其修复10,11,12。因此，近几十年来，随....
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方案
本项目使用的模式生物是墨西哥钝口螈A. mexicanum，该物种原产于墨西哥的霍奇米尔科。该动物种群于2014年通过从肯塔基大学的钝口螈遗传资源中心引进亲代个体而合法建立，目前拥有32只亲代个体和超过200只幼体动物。所有实验程序均经安蒂奥基亚大学（UdeA）动物实验伦理委员会批准，批准文号为2023年3月27日第151号决议，并遵循了国家和国际动物实验伦理标准，包括1989年第84号法律第六章以及哥伦比亚卫生部1993年第8430号决议第五章的规定32,33。
1. 动物操作
注意：本实验方案的标准化使用了体长约为 12 至 15 cm、具有野生表型的动物。然而，并不排除使用体型较小或其他表型的动物。
- 选择长度约为 12–15 cm（从吻端到尾部）的墨西哥钝口螈。
- 将每只墨西哥钝口螈单独放入一个足够大的容器中，以使其能够自由活动，容器最好为透明且呈长方形。
- 操作前将动物置于 19 °C 至 21 °C 的环境中，并使用 20% Holtfreter 溶液饲养，光照与黑暗周期为 12 小时:12 小时。
注意：在操作前 24 小时内，应尽可能避免过度喂食，以防发生呕吐。
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结果
考虑到研究某些物种颅面结构在截肢后潜在再生反应的重要性与相关性 A. mexicanum29因此，必须具备一种安全且可重复的手术技术，该技术不仅能够评估组织的再生反应，还能使接受手术的动物死亡率保持在较低水平或为零。因此，本研究介绍了一种成功的手术方法的标准化操作，涉及完全横断性截除，切除两侧下颌骨最远端区域（包括双侧联合部及旁联合部区域） A. mexicanum
为标准化完整的横断式下颌截骨术，选取了37只体型和体重特征相似的野生型动物进行实验（图2A）。在实施截骨手术并严格遵循本方法部分所述指南及各项建议后，首次接受手术的动物术后存活率达到100%（图2B，C）。值得注意的是，动物在游泳、觅食以及进食时开闭下颌的行为均未出现明显异常，表明该技术具有良好的安全性和可行性。然而，在饮食习惯方面，术后前48小时内需改为较软的食物（见.......
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讨论
本文介绍了在 A. mexicanum 动物模型中成功实施下颌骨完全横断截骨术的外科手术方法，并提供了若干必要建议，以重现该手术模型，用于监测这些结构的再生反应，以及潜在调控该再生过程的因素的鉴定。
在本研究中，对A. mexicanum下颌远端三分之一处进行了完全横断性截除，涉及双侧结构，包括皮肤、真皮、齿骨、牙齿、梅克尔软骨以及后部间下颌肌、前部间下颌肌和颏舌骨肌等肌肉组织。类似地，尽管存在一些根本性差异，该物种也曾接受过其他类型的手术操作。例如Kramer等人的研究.，他们采用了下颌侧方截肢的手术设计28。在该研究中，截肢始于下颌联合内侧区域，仅涉及一侧的梅克尔软骨、周围骨组织（齿骨）、表皮、疏松结缔组织及肌肉组织28。尽管该手术方案与我们所采用的方法在设计及截除组织范围上存在差异，但两种方案均观察到被切除组织的再生反应，表明完全横断性和单侧性截肢均可作为研究A. mexicanum模型下颌再生的合适模型。
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
我们感谢安蒂奥基亚大学研究副校长提供的首项附属教师项目基金资源。我们感谢哥伦比亚皇家系统总署以及安蒂奥基亚大学第15届奖学金项目对萨曼塔·塔尔金诺攻读硕士学位的资助。最后，我们还要感谢每一位参与我们实验室蝾螈种群日常养护工作的学生。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum） | Ambystoma遗传资源中心 | 不适用 | 15-18 cm，16 g - 22 g野生型 |
| 二水氯化钙 | Duksan | 1098 | CaCl2 2H2O |
| 数码相机 MotiCAM 5 | MotiCAM | https://www.motic.com/upload/File/201407/2014071115335993.pdf | |
| EDTA 二钠盐，二水合物 | Biobasic | EB0185 | C10H14N2O8Na2 · H2O |
| 玻璃培养皿 | 任意厂家 | 不适用 | 硼硅酸盐玻璃 |
| 七水硫酸镁 | ITW Reagents | 131404.1211 | MgSO4 7H2O |
| 显微外科器械 | 不适用 | 不适用 | 镊子、夹子、7A刮匙、牙科测量尺和剪刀 |
| 巴斯德吸管 | 任意厂家 | 不适用 | 低密度聚乙烯 |
| 氯化钾 | Duksan | 372 | KCl |
| 红色蜡笔 | 任意厂家 | 不适用 | |
| 氯化钠 | Merk | K48297604 717 | NaCl |
| 软件 Motic Images Plus-Versión 2.0 | Motic | https://www.motic.com/As_Support_Download/d42.html | |
| 体视显微镜 | Olympus SZX16 | 不适用 | |
| 磺胺二甲嘧啶钠盐 | Sigma- Aldrich | S0800 | 4-氨基-N-(4-甲基-2-嘧啶基)苯磺酰胺 |
| 三卡因甲磺酸盐 | Sigma- Aldrich | E10521 | 氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐 |
| 1.5 mL离心管 | Axygen | MCT150C | 纯聚丙烯 |
参考文献
- Agata, K., Inoue, T. Survey of the differences between regenerative and non-regenerative animals. Dev Growth Differ. 54 (2), 143-152 (2012).
- Alvarado, A. S., Tsonis, P. A. Bridging the regeneration gap:Genetic insights from diverse animal models. Nat Re....
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重印与许可
