用于研究Ambystoma mexicanum模型中颅面组织再生的下颌损伤模型的设计与标准化

摘要

本研究的目的是建立一种安全且可重复的手术方法，用于对Ambystoma mexicanum进行完整的横向下颌骨截骨，以研究颅面组织的再生能力。

摘要

颅面复合体是一个解剖学区域，在人类中可能因发育畸形、创伤以及癌症等病理状况而受到影响，导致受损组织的丧失。这促使人们寻求再生这些缺失组织的策略。因此，研究具有再生能力的物种中调控颅面结构损伤后再生反应的细胞与分子机制成为重要方向，其中墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum，A. mexicanum）是一个备受关注的物种。

根据上述原则，本研究在墨西哥钝口螈的下颌设计并标准化了一种可重复的手术损伤模型，以研究损伤组织的再生反应，并模拟在人类中实施的临界缺损。选取体长12-15 cm的幼年/成年动物，使用0.1%三卡因麻醉20-30分钟。随后采用四手操作技术，在下颌骨远端三分之一处进行完全横向截除，包括联合部及旁联合区域，去除相当于齿骨和梅克尔软骨的骨骼结构，以及肌肉、结缔组织、神经和皮肤等软组织。之后对残留骨组织进行修整，并涂抹0.5%磺胺嘧啶。通过宏观观察和透明化技术评估组织反应。所有实验操作均经哥伦比亚安蒂奥基亚大学动物实验伦理委员会批准。结果表明，截肢后的动物能够从形态、结构和功能上再生被移除的颅面结构。

尤为重要的是，本研究提供了一种可重复的手术技术，在需要采集再生组织时，截肢和再截肢动物的存活率达到100%。因此，该手术设计为今后与其他能够再生颅面结构的脊椎动物进行比较分析，以及研究这一再生反应背后的细胞和分子机制，提供了基本的技术基础。

引言

在动物界中，组织、器官和复杂结构的再生能力已有广泛描述^1,2,3。因此，了解这些物种在附肢（如肢体和尾部）的某些结构受到损伤或截除后，如何激活并调控再生反应，已成为再生生物学研究的关注重点^4,5,6,7,8。

与此项工作密切相关的是，颅面组织再生的研究也是全球范围内备受关注的重要领域，因为该解剖区域极易受到面部创伤、颅面发育障碍、感染性疾病以及包括口腔癌在内的肿瘤性疾病的严重影响⁹。在存在肿瘤的情况下，通常需要切除颌骨或其他面部区域的部分结构或大范围组织，从而导致后续必须对缺损区域进行重建并促进其修复^10,11,12。因此，近几十年来，随着对探索和鉴定能够增强低再生能力物种（如人类）颅面组织再生反应的细胞与分子机制的需求日益增长，颅面组织再生的研究也不断深入^13,14。这促使研究人员采用具有颅面结构再生能力的动物模型，例如能够再生颌骨的模型，以研究和阐明在颌骨上造成小范围损伤或临界缺损后参与再生反应的相关机制¹⁵。

先前关于下颌骨截肢的研究强调了各种手术入路的设计，这些设计挑战了不同物种再生该结构的能力¹⁶。以斑马鱼为例，在下颌远端三分之一处进行的横断截肢以及侧方入路截肢表明，被截除的节段在形态学和组织学上均可实现再生恢复^17,18。另一方面，对蝾螈类两栖动物（如Notophthalmus viridescens）的开创性研究表明，当下颌骨横断截肢平面包含舌体和咽部结构时，丢失的组织（包括齿骨、肌肉组织和牙齿）能够再生，但舌体结构和咽部装置无法再生^19,20。然而，当在同一物种中截肢平面不包含舌体和咽部结构时，所有再生组织均可重现被截除组织的形状与结构^21,22。此外，在Cynops pyrrhogaster物种中，若截肢平面未包含舌体，亦可观察到下颌结构的再生反应²³。其他研究还表明，在Ambystoma maculatum、Desmognathus fuscus、Plethodon cinereus、Eurycea bislineata和Ambystoma opacum等物种中，下颌近端三分之一处的完全横断截肢以及下颌侧方退缩手术均可促进损伤组织的再生反应^24,25。这表明，在两栖动物中，再生反应的成功与否可能取决于截肢平面的设计及其所涉及组织的范围。

另一方面，在用于研究再生反应机制的两栖动物中，A. mexicanum 是一种常用的模式物种^26,27。 既往研究已证实，该物种是一种具有卓越再生能力的模型，能够再生包括口腔底部软组织、齿骨、梅克尔软骨以及肌肉和牙齿结构在内的颅面结构^28,29,30,31。这些发现基于多种手术方法，包括对口腔底部造成穿孔损伤、拔除牙齿并切除部分齿骨，以及通过侧向截除部分下颌骨的更广泛手术方式^28,29,30,31。然而，迄今为止，尚未有研究报道一种完整的横向手术方法，可造成一个关键性缺损，同时累及左右两侧下颌支的远端区域、齿骨、梅克尔软骨、完整的下颌联合以及双侧的牙齿和肌肉组织。

因此，本文详细描述了对A. mexicanum进行完全横断性下颌截肢的逐步操作流程，该方法可使接受手术的动物截肢组织的再生反应以100%的存活率被持续监测。此外，鉴于目前尚缺乏关于如何实施此类截肢手术的详细说明，本手术指南旨在确保任何计划在形态学、组织学、细胞学及分子水平上对本物种及其他接受相同或类似手术方式（包括下颌骨侧向截肢）的物种开展比较分析的研究人员，均能实现此类手术方法的可重复性。最终，本研究为发现未来可促进这些结构再生反应的关键分子奠定了基础，具有在颅面组织再生医学领域中的潜在应用价值。

方案

本项目使用的模式生物是墨西哥钝口螈A. mexicanum，该物种原产于墨西哥的霍奇米尔科。该动物种群于2014年通过从肯塔基大学的钝口螈遗传资源中心引进亲代个体而合法建立，目前拥有32只亲代个体和超过200只幼体动物。所有实验程序均经安蒂奥基亚大学（UdeA）动物实验伦理委员会批准，批准文号为2023年3月27日第151号决议，并遵循了国家和国际动物实验伦理标准，包括1989年第84号法律第六章以及哥伦比亚卫生部1993年第8430号决议第五章的规定^32,33。

1. 动物操作

注意：本实验方案的标准化使用了体长约为 12 至 15 cm、具有野生表型的动物。然而，并不排除使用体型较小或其他表型的动物。

1. 选择长度约为 12–15 cm（从吻端到尾部）的墨西哥钝口螈。
2. 将每只墨西哥钝口螈单独放入一个足够大的容器中，以使其能够自由活动，容器最好为透明且呈长方形。
3. 操作前将动物置于 19 °C 至 21 °C 的环境中，并使用 20% Holtfreter 溶液饲养，光照与黑暗周期为 12 小时:12 小时。
   注意：在操作前 24 小时内，应尽可能避免过度喂食，以防发生呕吐。

2. 下颌骨远端三分之一处完全横断截骨术

1. 动物麻醉及术前准备
   1. 配制0.1%的三卡因甲磺酸盐麻醉液：取1 g三卡因甲磺酸盐、100 µL 1 M pH 7.5的乙二胺四乙酸（EDTA）、50 µL 0.5%酚红，用40% Holtfreter溶液定容至1 L，用NaOH调节pH至7.5。
   2. 准备好所有已灭菌的显微外科器械（剪刀、镊子、尖头镊、7A刮匙、1.5 mL离心管、牙科测径器、巴斯德移液管、培养皿以及用于手术的塑料托盘）。在接触器械和动物前佩戴新的一次性丁腈手套。
   3. 用70%消毒酒精清洁工作区域，适当调节并定位直射光源，使其对准手术区域。
2. 麻醉
   1. 将墨西哥钝口螈放入盛有约500 mL 0.1%三卡因甲磺酸盐麻醉液的容器中，持续20–30分钟，以确保达到深度麻醉状态。
      注意：确保动物完全浸没在麻醉液中。
   2. 通过检查鳃部运动是否完全停止以及对触觉刺激是否无反应，来确认全身麻醉的迹象。
      注意：若需监测下颌再生情况，在动物麻醉后，应按照第4节的步骤使用体视显微镜拍摄术前照片。
3. 下颌完全横断截肢
   注意：截肢操作应尽可能小心且迅速地采用四手操作技术（即两名外科医生协作）进行。
   1. 将动物小心地以仰卧位（面部朝上）放置在塑料托盘上。
   2. 使用游标卡尺（牙科测量仪）从下颌外缘向该结构近端方向测量待截肢区域，在颏部/联合区域约为2.5 mm（图1A）。
      注意：游标卡尺测量应在动物皮肤表面进行（口外测量）。
   3. 使用红色蜡笔做标记，以确定截肢平面的走向及手术缺损的范围。
   4. 小心抬起墨西哥钝口螈，并用一只手牢固握住，防止动物从操作者手中滑脱。
      注意：此操作应由其中一名操作者（操作者1）完成，另一名操作者（操作者2）负责使用手术器械并进行切口。
   5. 将直射光源对准墨西哥钝口螈的头部区域，特别是待手术的解剖部位。
   6. 用另一只手使用7A刮匙较宽的圆头侧，将舌体与口腔底部及待手术的下颌区域分开（图1B）。
      注意：确保舌体轻微覆盖在上颌之上。
   7. 首先，由操作者2使用手术镊进行初步切割，从下颌外缘开始，穿过皮肤及硬组织（齿骨和梅克尔软骨）（图1C）。
      注意：确保器械锋利，以便在切割和操作组织时获得更好的控制。
   8. 随后使用精细手术剪继续横向剪切，使切口从初始切口位置横跨整个下颌至对侧，直至远端下颌组织被完全移除，沿预定截肢平面完成完全横断截肢（图1D）。
      注意：对于下颌更为粗壮的较大个体，建议使用手术镊完成截肢平面，以获得更干净且创伤更小的骨骼结构切割效果（图1E）。
   9. 观察残余软组织的即时回缩现象（图1F）。
   10. 使用解剖镊收集截下的组织，并将其浸入装有适当溶液的1.5 mL离心管中，根据后续实验需求选择：如4%多聚甲醛（PFA）用于固定及后续组织学或免疫荧光分析，或Trizol或RNA later用于RNA、DNA或蛋白质提取等其他技术（图1F）。
       注意：该组织可作为非再生对照，用于与再生组织在组织学层面、基础基因表达水平或终末组织分化标志物检测方面进行比较。
   11. 将墨西哥钝口螈置于培养皿中，在体视显微镜下观察，并使用镊子修整暴露的骨和软骨组织边缘。
   12. 小心地将墨西哥钝口螈放回塑料托盘，并进行0.5%磺胺嘧啶抗生素浴处理12小时。

3. A. mexicanum 术后恢复

注意：未给予术后镇痛药物，因为目前尚无针对墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）建立的经过验证的术后镇痛方案。在蝾螈中评估阿片类镇痛药的实验研究尚未证明其镇痛效果具有一致性。因此，所有操作均在深麻醉状态下的MS-222麻醉中进行，并根据批准的机构动物护理和使用方案，在术后恢复期间对动物进行密切监测。

1. 手术后，将墨西哥钝口螈置于含有40% Holtfreter溶液的透明塑料容器中，并通过观察鳃部运动、翻正反射以及对触觉刺激的反应来监测其从全身麻醉中的恢复情况。完全恢复通常在30–60分钟内发生。继续进行每日术后观察，特别注意游泳行为、下颌运动、重新喂食后的进食情况（术后24–48小时恢复喂食），以及任何恢复不良或痛苦的迹象。
   注意：保持40% Holtfreter溶液处于低温状态，温度控制在约4 °C至8 °C之间。
2. 每24小时更换一次低温的40% Holtfreter溶液，持续至少8天。
   注意：术后前48小时是动物恢复最关键的时期，必须进行每日观察。
3. 术后24–48小时后，给予墨西哥钝口螈质地柔软的食物，这类食物更易捕捉且对动物造成的创伤更小。
   注意：手术后最初24小时内不得喂食墨西哥钝口螈。

4. 图像采集与再生反应的监测

注意：所有图像应尽快拍摄，以避免长时间接触刚接受手术的动物。

1. 按照第2.2节所述步骤操作。待动物完全麻醉后，小心将其拿起，放入培养皿中，并转移至体视显微镜和数码相机下，以获取截肢前和截肢后的图像。
   注意：事先使用70%酒精清洁并消毒体视显微镜。
2. 使用照射到蝾螈头部的入射光源，以更清晰地观察下颌区域。
3. 用一只手稳固握住蝾螈身体，防止其滑出图像采集视野。
   注意：避免在液体环境中拍照，以防实际尺寸发生畸变；应使用无液体的培养皿。可间歇性地用40% Holtfreter溶液轻轻润湿蝾螈体表。
4. 准确定位下颌区域，并进行适当对焦。
   注意：在术后各观察时间点（随访期间），需注意保持良好对焦，因为再生组织在早期阶段通常非常微弱，某些情况下甚至难以察觉。
5. 通过调整软件工具（对比度、亮度、曝光、增益、白平衡等）优化图像采集参数。
6. 使用体视显微镜（0.7倍）获取图像，用于测量并监测结构的再生过程。
7. 待再生过程完成后，根据先前报道的方案³⁴，使用阿利新蓝（alcian blue）和茜素红（alizarin red）对再生组织进行染色。

结果

考虑到研究某些物种颅面结构在截肢后潜在再生反应的重要性与相关性 A. mexicanum²⁹因此，必须具备一种安全且可重复的手术技术，该技术不仅能够评估组织的再生反应，还能使接受手术的动物死亡率保持在较低水平或为零。因此，本研究介绍了一种成功的手术方法的标准化操作，涉及完全横断性截除，切除两侧下颌骨最远端区域（包括双侧联合部及旁联合部区域） A. mexicanum

为标准化完整的横断式下颌截骨术，选取了37只体型和体重特征相似的野生型动物进行实验（图2A）。在实施截骨手术并严格遵循本方法部分所述指南及各项建议后，首次接受手术的动物术后存活率达到100%（图2B，C）。值得注意的是，动物在游泳、觅食以及进食时开闭下颌的行为均未出现明显异常，表明该技术具有良好的安全性和可行性。然而，在饮食习惯方面，术后前48小时内需改为较软的食物（见...

讨论

本文介绍了在 A. mexicanum 动物模型中成功实施下颌骨完全横断截骨术的外科手术方法，并提供了若干必要建议，以重现该手术模型，用于监测这些结构的再生反应，以及潜在调控该再生过程的因素的鉴定。

在本研究中，对A. mexicanum下颌远端三分之一处进行了完全横断性截除，涉及双侧结构，包括皮肤、真皮、齿骨、牙齿、梅克尔软骨以及后部间下颌肌、前部间下颌肌和颏舌骨肌等肌肉组织。类似地，尽管存在一些根本性差异，该物种也曾接受过其他类型的手术操作。例如Kramer等人的研究.，他们采用了下颌侧方截肢的手术设计²⁸。在该研究中，截肢始于下颌联合内侧区域，仅涉及一侧的梅克尔软骨、周围骨组织（齿骨）、表皮、疏松结缔组织及肌肉组织²⁸。尽管该手术方案与我们所采用的方法在设计及截除组织范围上存在差异，但两种方案均观察到被切除组织的再生反应，表明完全横断性和单侧性截肢均可作为研究A. mexicanum模型下颌再生的合适模型。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
墨西哥钝口螈（Ambystoma mexicanum）	Ambystoma遗传资源中心	不适用	15-18 cm，16 g - 22 g野生型
二水氯化钙	Duksan	1098	CaCl2 2H2O
数码相机 MotiCAM 5	MotiCAM	https://www.motic.com/upload/File/201407/2014071115335993.pdf
EDTA 二钠盐，二水合物	Biobasic	EB0185	C10H14N2O8Na2 · H2O
玻璃培养皿	任意厂家	不适用	硼硅酸盐玻璃
七水硫酸镁	ITW Reagents	131404.1211	MgSO4 7H2O
显微外科器械	不适用	不适用	镊子、夹子、7A刮匙、牙科测量尺和剪刀
巴斯德吸管	任意厂家	不适用	低密度聚乙烯
氯化钾	Duksan	372	KCl
红色蜡笔	任意厂家	不适用
氯化钠	Merk	K48297604 717	NaCl
软件 Motic Images Plus-Versión 2.0	Motic	https://www.motic.com/As_Support_Download/d42.html
体视显微镜	Olympus SZX16	不适用
磺胺二甲嘧啶钠盐	Sigma- Aldrich	S0800	4-氨基-N-(4-甲基-2-嘧啶基)苯磺酰胺
三卡因甲磺酸盐	Sigma- Aldrich	E10521	氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐
1.5 mL离心管	Axygen	MCT150C	纯聚丙烯