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方法文章

从新生小鼠血管纹中分离和培养原代边缘细胞

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DOI：

10.3791/69916

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2026年3月20日

 ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 2Research Institute of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, 3The First Clinical School of Wuhan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种从小鼠血管纹中分离、纯化和培养原代边缘细胞以及建立 体外 氧化应激与细胞衰老模型在耳蜗侧壁疾病研究中的应用

摘要

血管纹是内耳中负责产生和维持耳蜗内电位（EP）的关键结构，其功能障碍与多种类型的听力损失密切相关。血管纹由边缘细胞、中间细胞和基底细胞组成，其中边缘细胞在EP的产生和维持过程中发挥核心作用。因此，建立一种 体外 边缘细胞的原代培养模型对于研究血管纹的生物学特性及其在听力损失相关疾病中的作用至关重要。

本研究成功分离并培养了新生小鼠血管纹边缘带的原代边缘细胞。通过显微解剖获取血管纹组织，使用II型胶原酶消化，并采用差速贴壁法纯化以去除大部分成纤维细胞，培养细胞在第7天达到80%以上的融合度。免疫荧光染色显示细胞稳定表达细胞角蛋白18（CK18）和钾电压门控通道Q族成员1（KCNQ1），证实边缘细胞分离成功、纯度较高且生理功能得以保持。

根据该模型， 体外 使用过氧化氢（H₂O₂）建立了氧化应激和细胞衰老模型。2O2）和D-半乳糖处理。经处理的细胞表现出显著升高的细胞内活性氧（ROS）水平和衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）阳性率，表明原代边缘细胞对氧化应激和诱导衰老的刺激具有高度敏感性。综上所述，本研究建立了一种稳定且可重复的小鼠原代边缘细胞培养与建模体系，提供了一种可靠的 体外 研究血管纹功能障碍及相关机制的平台。

引言

在听觉系统中，耳蜗内的多种组织协同工作，将复杂的声音波转换为电信号1。血管纹负责调节内淋巴的离子成分，并产生耳蜗内电位（EP），从而维持耳蜗的稳态，确保内毛细胞和外毛细胞的正常功能。血管纹由三种不同的细胞类型组成：边缘细胞、中间细胞和基底细胞。边缘细胞形成一层具有极性的上皮单层结构，直接面向内淋巴，并由紧密连接封闭。边缘细胞的基底外侧膜富含两种关键的钾离子转运蛋白：Na⁺/K⁺-ATP酶和NKCC1，它们参与调控血管纹中钠离子和钾离子的转运。研究表明，Na⁺/K⁺-ATP酶的功能与EP直接相关2,3。KCNQ1/KCNE1 K⁺通道位于边缘细胞的顶膜，可产生额外的K⁺扩散电位，有助于EP的形成4。边缘细胞富含多种与钾离子相关的蛋白质，是驱动耳蜗内淋巴中钾离子循环的核心细胞单位。因此，边缘细胞是产生和维持EP的关键细胞。

血管纹（stria vascularis, SV）已被证实在外周性聋（sensorineural hearing loss, SNHL）相关多种疾病的发病机制中发挥关键作用，包括年龄相关性听力下降（age-related hearing loss, ARHL）、噪声性听力损失（noise-induced hearing loss, NIHL）、遗传性听力损失（hereditary hearing loss, HHL）以及药物性听力损失（drug-induced hearing loss, DIHL）。此外，近年来的研究表明，尽管病因不同，其他一些听力障碍如自身免疫性内耳病（autoimmune inner ear disease, AIED）、自身炎症性内耳病（autoinflammatory inner ear disease, AID）和梅尼埃病（Ménière's disease, MD）也在其潜在的致病机制中涉及血管纹的病理改变。5,6因此，建立可靠的细胞模型以研究听力损失的发病机制至关重要。研究表明，边缘细胞密度的降低是耳蜗电位（EP）的有力预测指标 在整个小鼠生命周期中，而血管纹萎缩则是老年性听力损失（ARHL）的早期特征性病变7,8. 体外 边缘细胞的培养可为研究年龄相关性听力损失（ARHL）的发病机制及探索潜在治疗靶点提供可靠的模型。除ARHL外，近期研究揭示了血管纹与其他听觉障碍之间存在高度相关性及可能的内在联系，提示 体外 边缘细胞模型可能具有更广泛的应用5,9,10.

本研究描述了一种从新生小鼠耳蜗中分离和培养血管纹组织，并通过差速贴壁法纯化边缘细胞的实验方案，从而为血管纹相关疾病的研究所提供一种可靠的细胞模型。

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方案

新生小鼠（P0-3）由Biont公司提供。所有实验程序均遵循美国国立卫生研究院（NIH出版物，2011年修订版）发布的《实验动物护理和使用指南》，并经武汉大学人民医院动物伦理委员会批准（编号：WDRM202400019）。

1. 灭菌与材料准备

  1. 准备解剖工具，包括两把显微解剖镊、一把标准镊子、一把手术剪和一把显微解剖剪。使用高压灭菌器对所有工具进行灭菌，并在60 °C烘箱中干燥4小时。
  2. 根据制造商说明配制100 mL上皮细胞培养基-动物源（EpiCM-a培养基）。向基础培养基中加入胎牛血清（FBS）、上皮细胞生长添加剂（EpiCGS-a）和青霉素/链霉素溶液，使终浓度分别为2% FBS、1% EpiCGS-a和1%青霉素/链霉素。
  3. 用75%乙醇对体视显微镜的载物台和外壳进行消毒。然后将经高压灭菌的解剖工具和已消毒的显微镜放入生物安全柜中。在开始解剖操作前，将所有物品暴露于紫外线下30分钟，以确保完全无菌。

2. 听觉上皮采集的解剖与颞骨分离

  1. 根据 "实验动物安乐死指南 GB/T 39760-2021"用4%异氟烷麻醉新生小鼠（p0–3），然后用止血钳夹住后肢脚趾。观察脚趾夹捏反射消失，以确认小鼠已处于深度麻醉状态，随后实施安乐死。之后用75%乙醇消毒，并转移至生物安全柜中。必要时可采用其他经伦理批准的方法。
  2. 固定头部，使用显微解剖剪沿矢状缝切开头皮，向两侧分离并切除头皮。
  3. 沿中线用显微解剖剪将新生小鼠头部切开。用镊子移除脑组织以暴露颞骨。图1A).
  4. 观察颅底双侧颞骨，去除其他不必要的骨骼，保留包含耳蜗的颞骨组织图1B).
  5. 将一个颞骨转移至含有冰上新鲜Hank's平衡盐溶液（HBSS）的35 mm无菌培养皿中。
  6. 将另一侧颞骨置于显微镜下，用一对镊子固定颞骨组织，再用另一对镊子钝性剥离表面肌肉组织，直至可见白色的半规管骨环图1C）。确认耳蜗位置后，继续钝性分离至下方，直至观察到半透明的耳蜗组织（图1D).
    注意：步骤 2.6–2.7 应在冰上进行。
  7. 使用显微解剖镊，小心地去除耳蜗顶回处的一小块骨壁，将镊子的一侧轻轻插入耳蜗内，分离骨壁与膜迷路。移除骨壁后，将膜迷路组织置于新鲜的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中展开图1E).
  8. 用一对镊子固定基底膜，用另一对镊子小心分离血管纹。将其转移至预置于冰上、含有1 mL 1 mg/mL II型胶原酶溶液的1.5 mL微量离心管中（图1F).
  9. 重复上述步骤，以收获另一侧的血管纹。

3. 酶解法解离以获取血管纹边缘细胞

  1. 将含有收获组织的微量离心管在 1 mg/mL II 型胶原酶溶液中于 37 °C 孵育 30 分钟。
    注意：II 型胶原酶溶液是通过将 II 型胶原酶溶于磷酸盐缓冲液（PBS；2.7 mM KCl，2.0 mM KH₂PO₄，137 mM NaCl，10 mM Na2HPO4）中配制而成。
  2. 在 300 × g 条件下离心 8 分钟。
  3. 小心移除上清液。加入 1 mL 培养基以终止消化，轻轻吹打重悬细胞，然后在 300 × g 条件下再次离心 8 分钟。 
  4. 吸除上清液，加入 1 mL 新鲜培养基。吹打以获得单细胞悬液，将悬液转移至 15 mL 锥形管中，并补充培养基使总体积调整至 10 mL。
  5. 通过反复吹打充分混匀细胞悬液，然后将 1 mL 悬液转移至 6 孔板的每个孔中。在含 2% FBS、1% EpiCGS-a 和 1% 青霉素/链霉素溶液的 2 mL DMEM 培养基中，于 37 °C、5% CO2 培养箱中培养细胞。
  6. 每天更换培养基并监测细胞状态。通常在接种后 2 天可观察到边缘细胞呈簇状生长。

4. 边缘细胞的纯化

  1. 培养第3天，观察到大量梭形成纤维细胞围绕在呈鹅卵石样形态的边缘细胞簇周围（图2B）。
  2. 利用细胞贴壁速度的差异，轻柔吹打以部分去除梭形成纤维细胞。使用1 mL移液器，将D-Hanks平衡盐溶液在培养皿的四个象限内大范围轻柔冲洗。在显微镜下监测细胞纯化情况，并相应调整吹打的力度与方向。通常进行两次大范围冲洗。每次冲洗后，在显微镜下观察成纤维细胞的密度；根据观察结果，对成纤维细胞密集区域进行局部轻柔吹打，使其在培养皿中呈稀疏且均匀分布。
    注意：应保留适量密度的成纤维细胞，因完全去除或过度纯化可能限制原代细胞的生长。建议维持边缘细胞与成纤维细胞的比例约为2:1。
  3. 当显微镜下观察到成纤维细胞在边缘细胞簇间呈稀疏分布时，停止纯化操作。吸除上清液，并加入2 mL新鲜培养基继续培养。

5. 免疫荧光染色

  1. 纯化后第2天，在显微镜下观察细胞形态。当观察到细胞聚集体形成良好且密度适当时，吸除培养基，并用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤细胞3次。
  2. 用4%多聚甲醛在室温下固定细胞15分钟。去除固定液后，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。
  3. 用0.5% Triton X-100处理细胞15分钟以进行通透。去除溶液后，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟。
  4. 用含10%山羊血清的PBS在室温下封闭细胞30分钟。
  5. 加入兔抗小鼠CK18单克隆抗体（以含3%山羊血清的PBS按1:300稀释）或KCNQ1抗体（G-8）（以含3%山羊血清的PBS按1:100稀释） ，4 °C孵育过夜。
  6. 用PBS洗涤细胞3次，每次10分钟。加入相应的 二抗（以含3%山羊血清的PBS按1:300稀释），室温孵育1小时。
  7. 去除二抗，用PBS洗涤细胞3次，每次10分钟。
  8. 在载玻片上滴加1-2滴含DAPI的抗荧光淬灭封片剂，加盖盖玻片，使用共聚焦激光扫描系统观察样本。
    注意：除洗涤步骤外，所有孵育溶液（包括抗体）的加入量均应足以完全覆盖细胞。

6. H2O2 处理与活性氧染色

  1. 培养7天后，当边缘细胞形成融合的单层时，通过添加1 mM H2O2诱导氧化应激。将30% H2O2储存液用上皮细胞培养基按1:10000稀释，配制1 mM工作液。实验组使用该工作液处理，对照组仅加入上皮细胞培养基。
  2. 处理16小时后，小心吸除培养基，用PBS洗涤细胞。根据试剂盒说明书，使用活性氧检测试剂盒检测边缘细胞内的活性氧水平。
  3. 吸除培养基后，向细胞中加入稀释的MitoTracker Red CMXRos（一种线粒体特异性染料）和DCFH-DA，于细胞培养箱中37 °C孵育30分钟。
  4. 用PBS洗涤细胞三次（每次5分钟），封片后使用共聚焦激光扫描显微镜观察样品。

7. D-半乳糖处理与SA-β-半乳糖苷酶染色

  1. 培养7天后，当边缘细胞形成融合的单层时，将D-半乳糖粉末溶解于EpiCM-a培养基中，配制40 mg/mL的D-半乳糖工作液。实验组用该溶液处理（每孔2 mL，置于6孔板中，37 °C孵育48 h）以诱导细胞衰老，对照组则仅用等体积的Epi培养基处理。
  2. 处理48 h后，小心吸除培养基，并用PBS洗涤细胞。根据试剂盒说明书，使用SA-β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色试剂盒检测边缘细胞的细胞衰老情况。
  3. 用固定液在室温下固定细胞15 min。去除固定液后，用PBS洗涤细胞三次（每次5 min）。
  4. 将细胞与含有5% X-Gal的SA-β-gal染色工作液（每孔1 mL，置于6孔板中）在37 °C、无CO2的湿化培养箱中避光孵育过夜。
  5. 使用显微镜在明场照明下拍摄SA-β-gal染色结果的图像。

8. 统计分析

  1. 针对H₂O₂处理组与对照组之间ROS染色平均免疫荧光强度的比较，以及D-半乳糖处理组与对照组之间SA-β-gal阳性细胞比例的比较，在进行正态性和对数正态性评估后，采用t检验。

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结果

培养细胞的生长与形态学特征
采用本方案，我们成功建立了从小鼠耳蜗分离的边缘细胞的原代培养。培养第2天，光学显微镜观察显示细胞已贴附于基质并开始形成簇状集落（图2Aa）。第3天进行细胞纯化（图2B）。随后数日的持续观察表明，原代边缘细胞呈现指数扩增，具有典型的鹅卵石样形态，并在第7天达到约80%的融合度（图2Ab-d）。

细胞纯化后第2天，免疫荧光（IF）染色显示CK18表达（图2C），超过85%的细胞CK18免疫荧光染色呈阳性，证实已获得纯度足够的原代边缘细胞。

培养细胞生理功能的验证
细胞纯化后第2天，通过免疫荧光检测到KCNQ1的表达（

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讨论

几十年来，关于听力损失的研究主要集中在感觉毛细胞及其与螺旋神经节神经元的突触连接作用上11已有大量已发表的研究致力于建立和优化 体外 毛细胞的培养模型，在研究毛细胞损伤、再生以及耳毒性药物效应方面发挥了不可或缺的作用12,13然而，越来越多的研究和综述强调了血管纹在听觉系统中长期被忽视的关键作用6血管纹负责调节内淋巴的离子成分并产生耳蜗内电位（EP），毛细胞依赖该电位维持其正常功能。14病理学研究已证实，血管纹的衰老和退变是老年性听力损失（ARHL）的早期特征性病变。15仅关注毛细胞而忽视血管纹，相当于在观察听力损伤的最终结果时忽略了其根本原因。因此，本研究旨在建立一种从小鼠耳蜗血管纹中分离和培养边缘细胞的方法，这对于研究血管纹在年龄相关性听力损失（ARHL）等疾病中独立作用至关重要。

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披露

作者声明该研究不存在任何商业或财务利益冲突。

致谢

我们衷心感谢中国武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科及武汉大学人民医院耳鼻咽喉头颈外科研究所的大力支持与鼓励。本研究得到中国国家卫生健康委服务中心建设与孵化基金（ZX0000000037）、国家自然科学基金（81700916，82301294）、湖北省自然科学基金（2017CFB242）以及湖北省卫生健康委员会科研项目（WJ2017Q005）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
15 mL 离心管ServicebioEP-1501-J用于培养
35 mm 细胞培养皿NEST706001用于解剖
4% 多聚甲醛ServicebioG1101免疫荧光染色
6 孔板ServicebioCCP-6H用于培养
Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔抗体ProteintechSA00013-2免疫荧光染色
含 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂Absinabs9235免疫荧光染色
细胞计数试剂盒-8BeyotimeC0037用于细胞计数
II 型胶原酶BiosharpBS164用于培养
共聚焦激光扫描系统Olympus FV1200免疫荧光染色
DCFH-DAInvitrogenC2938活性氧染色
D-半乳糖SolarbioD8310用于细胞建模
EpiCM-a 培养基Sciencell4131用于培养
精细镊子RWDF11020-11用于解剖
山羊血清BeyotimeC0265免疫荧光染色
H2O2MkbioMM0707用于细胞建模
Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)BiosharpBL561A用于培养
异氟烷RWDR510-22-10用于解剖
KCNQ1 抗体 (G-8)Santa cruzsc-365186免疫荧光染色
显微镜Olympus SZX7-1063用于解剖
显微镜Olympus IX71用于观察免疫荧光染色结果
MitoTracker Red CMXRosInvitrogenM7512活性氧染色
新生小鼠仔鼠 (P0-P3)由 BIONT 提供
PBSServicebioG4202免疫荧光染色
兔抗小鼠 CK18 单克隆抗体Proteintech10830-1-AP免疫荧光染色
衰老相关 β-半乳糖苷酶染色试剂盒BeyotimeC0602衰老染色
吐温 X-100Sigma-AldrichX100免疫荧光染色

参考文献

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