通过溶剂铸造技术制造的溶解微针阵列贴片及基于微针的生物医学设备的基本表征

摘要

本研究旨在作为实用指南，使研究人员能够利用溶剂铸造法（也称为微成型）制备自己的DMAP器件，并进行基本表征。

摘要

基于微针的技术彻底改变了皮肤和经皮递送研究领域，如今被认为是通过皮肤给药最直接的方法。微针阵列贴片（MAP）的成功主要归功于其能够通过无痛穿透 角膜层 ，消除皮肤屏障阻碍外用药物进入的屏障功能。溶解型MAP（DMAPs）因其成分的生物相容性、患者可自行给药的可能性以及使用后不会产生锐利废物而在其他基于MAPs的设备类型中脱颖而出。DMAP通常由聚合物材料制成，当接触间质液时，插入皮肤时会重新扩散，释放其货物。在实验台层面，DMAP通常采用溶剂铸造法制造，即使用所需MAP形状和长度的负模，然后铸造含药物的高分子分散液。随后，它们通过施加离心力或正压强制填满模具腔体。干燥后，DMAP变为固态，从主模上剥离，使用前通常会进行各种特性分析。这些检测通常包括DMAP的机械性能研究、残余水分含量的测定、体 外 穿透皮肤结构的能力、药物释放性能以及体 外 生物相容性评估。

引言

尽管药理活性物质的局部和经皮给药被视为口服药物的有前景替代方案，但由于角 质层 自然发挥的皮肤屏障功能，这也带来了重大挑战。这一限制尤其影响大分子，尤其是分子量为>500 Da¹的分子。此外，具有特定物理化学性质的其他分子（如显著的亲水性或脂溶性）通过皮肤的被动扩散也受到限制。为克服这一障碍，提出了多种技术策略，包括离子推导、声波推测、电穿孔、化学增强剂、热方法和纳米系统等。然而，微针阵列贴片（MAP）因其多项优势而脱颖而出：极高效率地消除 角质层 功能、成本效益高、患者无痛使用体验，以及无需医护人员自行施药^{的可能性2}。

MAP是含有微型针状突起的装置，能穿透角质层并绕过表皮屏障。文献中描述了几种MAPs类型，分别是：固体型、涂层型、溶解型、膨胀型和空心型MAPs。溶解型MAPs（DMAPs）由水溶性聚合物材料组成，采用“戳释”策略，这也解释了它们额外的有趣特性。特别是，当它们进入皮肤结构时，接触间质液时会溶解，释放其内容物。与固体MAPs的“戳与贴片”策略不同，后者用于在皮肤结构内创建微通道，允许随后局部涂抹的配方^3,4通过，“戳出释放”方法不会受微通道保持开放时间的影响。“戳出流动”策略需要准备空心MAPs，其结构更复杂且制造困难。DMAP的另一个优点是施用后不会产生尖锐废物，从而降低针刺伤和生物污染的风险。此外，其简单且微创的应用使患者能够自行管理，支持在资源有限或地理偏远环境中使用，尤其是在缺乏训练有素的医护人员、医疗基础设施和安全锐器处理系统^{的情况下。}专注于皮肤和经皮药物递送的科学界越来越多地转向MAPs技术，尤其是DMAPs，以克服上述策略的局限性。尽管关于MAPs的最早发表可追溯到20世纪80年代，但该技术在2000年代初经历了一次重大发展。自那以后，出版物数量呈指数增长，如今每年约有500篇^文章。

DMAP通常通过溶剂铸造法或微成型6^制造。这种制造技术基于使用所需MAP形状和长度的负主模。在铸造装载药物或纳米级系统的高分子分散剂后，施加外力以填充主模的微针状空腔。干燥后，DMAP可以通过剥离或用化学剂溶解主模具来小心脱模。这些主模由不同材料制成，其中聚二甲基硅氧烷（PDMS）最为常见，因其柔韧性和低附着性，便于DMAP的脱模。主模具的制备通常采用平版印刷方法;但现在市面上已有各种形状、长度和密度的商用PDMS微针模具。

这里提供了使用溶剂铸造技术制备DMAP的指导原则。在这种情况下，工艺通过离心力或施加正压来完成。这为基于MAPs的生物医学设备提供了一种高效且成本高昂的生产方法替代方案，使更广泛的研究人员能够将MAP应用于皮肤相关研究工作。此外，在 体内 测试之前，学术和基础研究所需的关键特征还包括针长和几何形状、机械抗压性、体 外 插入性能、药物负载与释放、残余水分含量、稳定性、 体外 药物吸收以及体 外 安全性。

方案

本研究中使用的试剂和设备列于 材料表中。

1. 通过离心制造溶解微针阵列

1. 通过将DMAP组成材料溶解于适当量的水中并用力搅拌，制备DMAP组成材料的水性胶体分散。根据所选聚合物和浓度，分散时间可能有所不同。如有需要，适度加热水温（40-45°C），以促进聚合物的扩散。
   注意：用于制备DMAP的最常用聚合物有聚乙烯吡咯酮（PVP）、卡拉亚胶、透明质酸（HA）、聚氨基乙烯基醚alt-maleic acid（PMVE-MA）、聚乙烯醇（PVA）、羧甲基纤维素（CMC）、几胞桑等，但任何其他具有最佳性能的水溶性材料都可以使用。大多数配方中，典型的工作浓度范围为5%至30%的w/w。低浓度通常产生快速溶解的DMAPs，而高浓度则产生慢溶解器件。然而，最佳浓度必须通过制作不同的DMAP原型来实证确定，因为这取决于聚合物的分子量、粘度以及微针所需的机械性能。
2. 让聚合物在夜间微微搅拌，以达到完全分散，同时让气泡被清除。
3. 如果气泡持续存在，则离心聚合物分散（1000 x g;5分钟;25°C）。
4. 将货物（药物或纳米颗粒）按所需浓度加入，适度搅拌直到均匀且不加入新的气泡。
5. 将PDMS模具处理到12孔板中。为此，可以用塑形粘土、牙科胶水或类似材料将模具嵌入井中。
6. 将50微升药物装载聚合物混合物铸造到PDMS模具和离心机上（3000 x g;5分钟;25°C）。之后，将板子旋转180°，重复离心过程，确保所有针状腔体都能被填满。
7. 小心去除多余的药物载聚合物分散。如果聚合物分散液是液体，使用移液器转移;如果粘度很高，就用刮刀。
8. 重复双重离心过程（步骤1.6），将可能溢出的药物载聚合物分散液重新注入模具。
9. 在真空（600 mBar;30分钟;25°C）下干燥含药聚合物分散液的模具。
10. 从步骤1.6到1.9重复该方案至少两次，以确保主模正确填充药物载荷聚合物分散剂。
    注意：离心力可通过每次重复逐步降低500 x g （25°C）。
11. 制备无药物的高浓度聚合物分散液，以制作DMAP器件的底板。它能确保填充在模具腔内的分散剂中的药物不会流回底板。
12. 将50微升游离药物聚合物分散液铸造到PDMS模具上，并通过离心两次（包括中间点板）以180°（500 x g;5分钟;25°C;2x）的速度扩散。离心后，向每个模具加入100微升分散液，12小时后再向底板添加50微升。
13. 将DMAP放入PDMS模具中，在室温下用干封干燥器干燥3-5天。
14. 用镊子小心地将DMAP从PDMS中取模，或用透明纤维素胶带撕下（见图1）。
15. 对制造的DMAP进行表征（见步骤3）。

2. 通过施加正压制造溶解微针阵列

1. 按前一节描述的步骤进行，直到步骤1.5。
2. 将150微升的药物加注聚合物混合物铸造到PDMS模具上，并将其放入压力罐中。
3. 将压力罐充满空气，直到压力达到3-4巴，持续至少15分钟。
4. 小心去除多余的药物载聚合物分散。如果聚合物分散液是液体，使用移液器;如果较粘稠，则用刮刀取出。
5. 重复施加压力（步骤2.2-2.3），将可能溢出的含药聚合物分散剂重新注入模具。
6. 在真空（600毫巴;30分钟;25摄氏度）下干燥装载药物的聚合物分散液。
7. 制备无药物的高浓度聚合物分散液，以制作DMAP器件的底板。它能确保填充在模具腔内的分散剂中的药物不会流回底板。
8. 将0.2克游离药物聚合物分散液浇注到PDMS模具上，并施加正压，步骤2.3中描述。
9. 按照前一节步骤1.13的步骤进行。

3. DMAP的特征描述

注意：在这一步中，使用人类和/或动物皮肤组织的方法，是按照机构指南进行的。此外，使用动物皮肤样本的方法也遵循了动物实验的3Rs原则。

1. 使用微型相机并以适当放大倍数对DMAP进行可视化，以区分针状突起^7.
   注意：如果装载了有色药物或染料，必须观察弹头与底板之间的颜色不同。
2. 将DMAP连接到支撑装置上，通过光学显微镜观察微针状突起的形态和长度。必须观察到尖锐的尖端结构。用相应的光学显微镜软件记录微针状投影的长度。
   注意：要通过光学显微镜测量微针长度，MAP必须垂直于物镜展示。长度测量和微针状突起形状必须通过扫描电子显微镜确认。
3. 评估DMAP在微针压缩至固体表面后变形中的机械性能。为此，将DMAPs的设备放入市售的DMAP施用器中，并压压在不锈钢平面上，持续30秒。压缩后，记录微针状突起的长度，并根据以下方程7与初始长度进行比较，计算变形^百分比：
   
   其中，h_o 和 h_f 分别代表压缩前和压缩后的微针长度。
   注意：如果有纹理分析仪，使用纹理分析仪可以标准化压缩力。在这种情况下，32 N/阵列的力模拟了患者在自我施用DMAP设备时所施加的平均拇指力。
4. 通过基于烯^烃类材料制成的热塑性片材替代人工皮肤方法，确定DMAP的初步插入能力8。为此，按照步骤3.4描述的条件，将DMAP设备压缩到八张装订的纸张上。每层中产生的孔洞数量通过光学显微镜或显微相机观察，并计算不同深度的穿透百分比。
   注意：市售热塑性塑料片通常厚度为127微米。
5. 利用先切除并仔细修剪的人类、猪或啮齿动物皮肤移植，确定DMAPs的 体外 插入能力。用充足的水清洗皮肤，浸泡1-2分钟后，将皮肤覆盖在包有铝箔的泡沫材料上，角 质层 朝上。
   1. 按照步骤3.4描述的条件进行插入。将DMAP插入皮肤，直到微针尖端溶解。如果DMAPs中含有染料或有色药物，皮肤内外的颜色显示DMAPs插入成功。此外，可以通过对皮肤切片的组织学分析观察到微^通道7。
      注：此步骤涉及人体或动物皮肤，依据瓦伦西亚大学人类与动物研究伦理委员会的指导方针和批准进行。在适用的情况下，已获得知情同意，所有实验均遵循机构及欧洲关于人类和动物组织在生物医学研究中使用的伦理标准。
6. 通过热重分析确定残余水分含量。观察到的体重下降直到100-110°C，归因于残留水分¹⁰。
   注意：根据文献来源不同，最大允许的残留水分为总重量的5%-10%，以确保DMAP的最佳干燥。
7. 通过将DMAP浸入5-10毫升水（或适用于分析药物的适当水释介质）中，温度为32-37°C，并采用最佳分析方法定量货物量，以量化货物负载。
   注意：紫外-可见光谱光度法常用于小分子分析。对于检测和定量极限较低的化合物，强烈建议使用高性能液相色谱（HPLC）结合紫外线、荧光或电化学检测。当需要极高的灵敏度和特异性时，可以结合HPLC配合质谱分析。蛋白质和抗体货物的分析测定通常通过双链甲酸（BCA）测定和免疫测定，分别如酶联免疫吸附测定（ELISA）或西部印迹法。药物释放谱通过在预定时间点从释放^水溶液中取样（0.2-1毫升）获得。每取样一次后，减去的体积会被相同体积的回火释放介质替换，以避免样品自动浓缩相关的误差。
8. 通过重复上述表征测试来评估DMAP的稳定性，确保DMAP的特征在设计存储条件下的存储期间保持恒定。
   注意：如果货物具有耐热性，DMAP通常会在室温（25°C）下储存。对于热敏活性成分，DMAPs储存在4°C。 相对湿度应保持在30%以下。DMAPs的稳定性会在六个月内定期监测。
9. 利用弗朗茨扩散细胞（FDC）装置测定体 外 药物皮肤沉积和皮肤吸收情况。为此，按照步骤3.6的步骤准备皮肤，并将DMAPs插入皮肤结构30秒。
   1. 之后，用适量的氰基丙烯酸酯将FDC供体腔体粘贴皮肤。干燥后，使用适当的夹具将皮肤供体腔复合物连接到受体腔^体。最后，按照第3.5节所述的采样协议进行。
      注：此步骤涉及 人体 或动物皮肤，是根据瓦伦西亚大学人类与动物研究伦理委员会的指导方针和批准进行的。在适用的情况下，已获得知情同意，所有实验均遵循机构及欧洲关于人类和动物组织在生物医学研究中使用的伦理标准。如果DMAP溶解缓慢，应使用外科用粘贴带将其固定在皮肤上，以防止其自脱离皮肤结构。
10. 根据制造商说明，使用代谢活性检测（如基于四唑铵和瑞沙祖林）或增殖试验（包括5-溴-2'-脱氧尿苷溴代氧尿苷（BrdU）等检测法，评估体 外 生物相容性。
    注意：首选细胞系为角质细胞、成纤维细胞或黑色素细胞。未暴露于DMAP的细胞通常作为阴性对照，而处理1%十二烷基硫酸钠（SDS）的细胞则作为阳性对照。生物相容性评估依赖于DMAP的溶解特征。对于快速溶解的DMAPs（24小时内溶解），采用提取物法，即在暴露细胞前将器件溶解。对于慢溶DMAP，采用直接接触法，装置直接加入播种井中。根据国际标准ISO 10993法规，细胞存活率结果>70%被视为无毒。

结果

制造的DMAP必须表示外观均匀，并成功形成微针状突起，如 图2A所示。当仅将有色货物装入微针结构时，少量药物可能因尖端溢出或在铸造游离药物聚合物分散物前清洁不彻底而污染DMAP底板。然而，两者结构之间存在明显差异。通过光学显微镜观察时，微针状突起必须表现出锋利的尖端且无变形（图2B）。强烈建议通过扫描电子显微镜（SEM）成像来确认这些观察结果，尽管长度测量的差异通常可以忽略不计。

DMAP的压缩导致针状结构，如 图2C所示。变形程度取决于聚合物的类型和浓度，材料浓度越高，机械阻力越大，从而可压缩性越低。例如，PVA或PVP是生产DMAP最常用的两种聚合物，其浓度在水溶液中可从5%到30%（w/w）不等。使用不同聚合物组合，如PVA-PVP，或它们之间的交联反应，可能有助于提升DMAP的机械性能。

讨论

这里描述的协议允许制备DMAP。然而，DMAP的多功能性和广泛聚合物材料的制造，使得能够生产具有不同特性的溶解器件。结果对应快速溶解的DMAPs，因为它们是用PVP（一种低浓度且高度易水分散的聚合物）制备。DMAP的溶解时间可以通过简单地替换成分聚合物或改变其浓度来轻松调节。因此，材料选择是制造过程中的关键步骤，用户必须根据所开发器件的理由和目标明智地选择材料。

此外，这里展示的DMAP仅装载货物在微针状突起内，限制了系统递送的药物量。值得注意的是，活性成分的浓度可达5%;然而，根据分子量、结构和性质的不同，它们可能与聚合物材料有不同的相互作用，并在干燥时改变其机械性能。因此，这类DMAPs主要用于治疗局部皮肤病，因为实现全身性药物水平相当具有挑战性。值得注意的是，疫苗接种是一个系统性目的，可以通过含货物的DMAPs来实现，因为触发免疫反应所需的抗原量^非常低。此外，有报道指出皮肤和黏膜组织富含朗格汉斯细胞，这些细胞在免疫反应的发展中起关键作用。如果装置的目的是实现全身...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细胞培养12孔板	无	无	没有具体规格。任何商业12孔细胞培养板均适用
离心机	埃彭多夫	离心机 5810 G	可被任何可适应细胞培养板的离心机替代
亚甲蓝	西格玛·奥尔德里奇	66720	CAS 122965-43-9。可以被任何其他染料或品牌替代
塑形粘土	无	无	没有具体规格。任何商业模型粘土都适用
烯烃型热塑性塑料片	Amcor	PM996	Parafilm M
聚（乙烯醇）（PVA）MW：9-10千达	西格玛·奥尔德里奇	363146	CAS 9002-89-5。可被任何其他品牌替换
聚（乙烯吡咯利酮）（PVP）MW：40千道尔	西格玛·奥尔德里奇	PVP40	CAS 9003-39-8。可被任何其他品牌替换
聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具	微点技术	ST-06	阵列针分布 15 x 15;高度600 &微距;m;基数200和微轴;m;针距500 & micro;m。可被任何其他具有不同腔体形状和长度的PDMS模具替换
压力罐	普罗特里玛	AT-10HT	可更换为支持4巴压力的其他压力罐