本研究旨在提供一份实用指南，帮助研究人员使用溶剂浇铸法（也称为微模塑法）制备自己的 DMAP 装置，并进行基本的表征。
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摘要
摘要
基于微针的技术已彻底改变了皮肤及透皮给药研究领域，目前被认为是最直接的经皮药物递送方法。微针阵列贴片（MAPs）的成功主要归因于其能够通过无痛穿刺破坏皮肤屏障功能，从而克服外用药物经皮吸收的阻碍。 角质层 层。在基于微针阵列（MAPs）的各类器件中，可溶性微针（DMAPs）因其组成材料具有良好的生物相容性、可由患者自行给药，以及使用后不会产生锐器废弃物等优势而备受关注。DMAPs通常由 可在插入皮肤并与组织液接触时重新分散，从而释放其载药成分的聚合物材料。在实验操作层面，DMAPs 通常采用溶剂浇铸法制备，该方法需使用与目标 MAPs 形状和长度相对应的负性主模具，将载药聚合物分散液浇铸于其上。随后通过施加离心力或正压，迫使分散液完全填充模具的腔体。干燥后，DMAPs 形成固体结构，从主模具上剥离下来，并在使用前常规进行多种表征研究。这些检测通常包括对 DMAPs 机械性能的评估、残留水分含量的测定 离体 穿透皮肤结构的能力、药物释放性能，以及 体外 生物相容性评估
引言
尽管通过皮肤局部或透皮给予药理活性物质被认为是口服给药的一种有前景的替代方式，但由于皮肤天然屏障功能的作用，该途径仍面临重大挑战 角质层 层。这一限制尤其影响大分子，特别是分子量较大的分子 >500 Da1此外，具有特定理化性质的其他分子（如显著的亲水性或疏水性）通过皮肤的被动扩散也受到限制。为克服这一屏障，已提出多种技术策略，包括离子导入、声孔效应、电穿孔、化学促渗剂的使用、热疗方法以及纳米级系统。然而，微针阵列贴片（Microneedle Array Patches, MAPs）因其多项优势而尤为突出：在高效消除屏障方面表现卓越 角质层 功能、成本效益、患者无痛体验，以及无需医务人员介入即可自行给药的可能性2.
MAPs 是一类包含微米级针状突起的装置，可刺穿 角质层 层并绕过表皮屏障。文献中已描述了多种微针阵列（MAPs）类型，即：实心型、包衣型、可溶型、溶胀型和中空型微针。可溶型微针（DMAPs）由水溶性聚合物材料制成，并采用一种 "戳刺与释放" 策略，这解释了它们额外的引人注目特性。特别是，当它们插入皮肤结构并与组织间液接触时会溶解，从而释放其内容物。与之相比 "穿刺与膜片钳" 由固体微针阵列贴片（solid MAPs）实施的策略，即利用其在皮肤结构中创建微通道，以促进后续外用制剂的透皮传递3,4，该 "戳刺与释放" 该方法不受微通道保持开放时间的影响。 "穿刺与流动" 策略需要制备中空的微针阵列（MAPs），其结构复杂得多，制造难度也更高。DMAPs 的另一个优势在于不会产生尖锐物 应用后可减少针刺伤和生物污染的风险。此外，其简单的微创给药方式有望实现患者自行给药，有助于在资源有限或地理位置偏远的地区使用，这些地区往往难以获得 trained healthcare personnel、医疗基础设施以及安全的锐器处理系统2科学界在经皮和透皮药物递送领域 increasingly 转向使用微针阵列贴片（MAPs）技术，尤其是可溶性微针阵列贴片（DMAPs），以克服上述策略的局限性。尽管关于 MAPs 的首篇文献可追溯至 1980 年代，但该技术在 21 世纪初迎来了重大发展。自那时起，相关出版物数量呈指数级增长，如今每年已达到约 500 篇文章5.
DMAP 通常采用溶剂浇铸法或微模塑法制造6。该制造技术基于使用所需 MAP 形状和长度的负型母模。在浇铸载有药物甚至纳米体系的聚合物分散液后，施加外力以填充母模中的微针形腔体。干燥后，可通过剥离或用化学试剂溶解母模的方式小心脱模获得 DMAP。这些母模由不同材料制成，其中聚二甲基硅氧烷（PDMS）最为常用，因其具有良好的柔韧性和低粘附性，有利于 DMAP 的脱模。母模的制备通常采用光刻方法；然而，目前市场上已有多种形状、长度和微针密度的商用 PDMS 母模可供选择。
在此，提供了使用溶剂浇铸法制备DMAPs的指南。该方法通过离心力或施加正压的方式进行。此技术为基于MAPs的生物医学器件的高成本制造方法提供了一种低成本、高效的替代方案，使更广泛的研究人员能够在皮肤相关研究中引入MAPs。此外，还涵盖了在学术和基础研究目的之前所需的关键表征步骤。 体内 测试包括针头长度和几何形状、抗压机械强度， 离体 插入性能、药物负载与药物释放、残留水分含量、稳定性 离体 药物吸收，以及 体外 安全性特征
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方案
本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 通过离心法制备可溶性微针阵列
- 通过将组分材料溶解于适量水中并剧烈搅拌，制备DMAPs组分材料的水相胶体分散液。根据所选聚合物及其浓度，分散时间可能有所不同。如有需要，可适度加热水分（40–45 °C）以促进聚合物的分散。
注意：制备DMAPs最常用的聚合物包括聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、刺梧桐胶、透明质酸（HA）、聚（甲基乙烯基醚-alt-马来酸）（PMVE-MA）、聚乙烯醇（PVA）、羧甲基纤维素（CMC）、壳聚糖等，但任何具有适宜性能的水溶性材料均可使用。对于大多数配方，典型的工作浓度范围为5%至30%（w/w）。较低浓度通常产生快速溶解的DMAPs，而较高浓度则产生缓慢溶解的贴片。然而，最佳浓度需通过制备不同DMAP原型进行经验性确定，因其取决于聚合物的分子量、黏度以及微针所需的机械性能。 - 使聚合物在室温下最低限度搅拌过夜，以实现完全分散，同时去除气泡。
- 若仍有气泡存在，对聚合物分散液进行离心处理（1000 × g；5 分钟；25 °C）。
- 加入所需浓度的载药物质（药物或纳米颗粒），适度搅拌至均匀，避免引入新的气泡。
- 将PDMS模具置于12孔板中。可使用模型黏土、牙科水泥或任何类似材料将模具固定在孔内。
- 将50 µL载药聚合物混合液浇注至PDMS模具上，并进行离心（3000 × g；5 分钟；25 °C）。随后将孔板翻转180°，重复离心过程，以确保所有针状空腔完全填充。
- 小心去除多余的载药聚合物分散液。若为液体状态，可使用移液器转移；若黏度较高，则使用刮刀处理。
- 重复步骤1.6中的双次离心过程，以将上一步骤中可能溢出的载药聚合物分散液重新压入模具中。
- 将载药聚合物分散液在模具中置于真空条件下干燥（600 mBar；30 分钟；25 °C）。
- 从步骤1.6至1.9至少重复该方案两次，以确保载药聚合物分散液正确填充主模具。
注意：每次重复时，可通过每次降低500 × g（25 °C）的方式逐步减小离心力。 - 制备一种不含药物的高浓度聚合物分散液，用于形成DMAPs装置的基板。这可防止填充在模具空腔中的分散液中的药物回流至基板。
- 将50 µL无药聚合物分散液浇注至PDMS模具上，并通过两次离心进行铺展，包括在中途翻转孔板180°（500 × g；5 分钟；25 °C；2次）。离心后，向每个模具中加入100 µL分散液，并在12小时后向基板额外添加50 µL分散液。
- 将DMAPs保留在PDMS模具中，在干燥密封的干燥器内于室温下干燥3至5天。
- 使用镊子小心地从PDMS模具中脱模，或使用透明纤维素胶带剥离DMAPs（图1）。
- 对制得的DMAPs进行表征（见步骤3）。
2. 通过施加正压法制备可溶性微针阵列
- 按照前一节所述步骤操作，直至步骤 1.5。
- 将 150 µL 载药聚合物混合物浇注到 PDMS 模具中，并将其放入压力罐内。
- 向压力罐中充入空气，直至压力达到 3–4 bar，并维持至少 15 分钟。
- 小心去除多余的载药聚合物分散液。若聚合物分散液呈液态，可使用移液器去除；若其黏度较高，则使用刮刀去除。
- 重复加压操作（步骤 2.2–2.3），以将上一步骤中可能溢出的载药聚合物分散液重新压入模具腔内。
- 将模具中的载药聚合物分散液在真空条件下干燥（600 mbar；30 分钟；25 °C）。
- 制备一种高浓度且不含药物的聚合物分散液，用于形成 DMAPs 装置的基板。该基板可防止填充在模具腔内的药物分散液回流至基板中。
- 将 0.2 g 不含药物的聚合物分散液浇注到 PDMS 模具上，并按照步骤 2.3 所述施加正压。
- 按照前一节中从步骤 1.13 开始所述方法继续操作。
3. DMAPs 的表征
注意：本步骤中涉及使用人类和/或动物皮肤组织的方法均按照机构指南进行。此外，涉及使用动物皮肤样本的方法均遵循动物实验的3Rs原则。
- 使用配备适当放大倍数的微型相机观察 DMAPs，以区分其针状突起7.
注意：如果已加载有色药物或染料，则尖端与底板之间必须观察到不同的颜色。 - 将DMAPs固定在支撑装置上，通过光学显微镜观察类微针突起的形态和长度。应观察到尖锐的顶端结构。使用与光学显微镜配套的适当软件记录类微针突起的长度。
注意：通过光学显微镜测量微针长度时，微针贴片（MAPs）必须垂直于物镜放置。微针状突起的长度测量和形态需通过扫描电子显微镜确认。 - 评估 DMAPs 在受压至固体表面后对微针变形的力学性能。为此，将 DMAPs 装置置入市售的 DMAPs 施用器中，将其压在不锈钢平面表面持续 30 秒。压缩后，记录微针状突起的长度，并根据以下公式将其与初始长度进行比较，计算变形百分比7:
其中，ho 和 hf 分别代表微针在压缩前和压缩后的长度。
注意：如果条件允许，使用质构分析仪可标准化压缩力。在此情况下，32 N/阵列的力可模拟患者自行使用DMAPs装置时拇指施加的平均压力。 - 基于烯烃类材料制成的热塑性板材，采用替代性人工皮肤方法测定DMAPs的初步插入能力8将DMAPs装置按照步骤3.4所述条件压紧在八张装订好的纸张上。通过光学显微镜或显微镜相机观察各层中形成的孔洞数量，并计算在不同深度的穿透百分比。
注意：市售热塑性塑料片的厚度通常为 127 µm。 - 确定 离体 使用先前切除并仔细修剪的人类、猪或啮齿类动物皮肤外植体，检测DMAPs的插入能力。用大量水浸泡皮肤外植体1–2分钟以清洗干净，随后将其放置于铝箔包裹的泡沫材料上，皮肤侧朝上 角质层 朝上的一面
- 在步骤3.4所述条件下进行插入操作。将DMAPs保留在皮肤中，直至微针尖端完全溶解。若DMAPs负载有染料或有色药物，皮肤内外侧出现着色即表明DMAPs插入成功9此外，可通过皮肤切片的组织学分析观察微通道。7.
注意：此步骤涉及 离体 人体或动物皮肤的研究均依照瓦伦西亚大学人类与动物研究伦理委员会的指南并经其批准进行。适用情况下均获得了知情同意，所有实验均遵守机构及欧洲关于生物医学研究中使用人体和动物组织的伦理标准。
- 在步骤3.4所述条件下进行插入操作。将DMAPs保留在皮肤中，直至微针尖端完全溶解。若DMAPs负载有染料或有色药物，皮肤内外侧出现着色即表明DMAPs插入成功9此外，可通过皮肤切片的组织学分析观察微通道。7.
- 通过热重分析测定残留水分含量。在100–110 °C之前观察到的重量损失归因于残留水分。10.
注：根据文献来源的不同，为确保 DMAP 的最佳干燥效果，允许的最大残留水分含量为总重量的 5%–10%。 - 在32–37 °C条件下，将DMAPs浸入5–10 mL水（或针对待分析药物选择合适的水性释放介质）中，采用最佳分析方法定量测定载荷物的含量。
注意：紫外-可见光分光光度法（UV-Vis）常用于小分子的分析。对于检测限和定量限较低的化合物，强烈推荐采用高效液相色谱法（HPLC）联用紫外-可见光、荧光或电化学检测器进行分析。当需要极高灵敏度和特异性时，可采用联用质谱的高效液相色谱法（HPLC-MS）。蛋白质和抗体类载荷的分析通常分别采用双辛可宁酸（BCA）法以及免疫分析法，如酶联免疫吸附测定（ELISA）或蛋白质印迹（Western blotting）。药物释放曲线通过在预定时间点从释放介质中取样（0.2–1 mL）获得11每次取样后，需用等体积的恒温释放介质补充所移除的体积，以避免因样品自动浓缩而产生的误差。 - 通过重复上述表征检测方法评估DMAPs的稳定性，以确保在设计的储存条件下储存期间DMAPs的特性保持不变。
注意：若载荷物具有热稳定性，干燥微粒制剂（DMAPs）通常在室温（25 °C）下储存；对于热敏感活性成分，DMAPs 应储存于 4 °C。相对湿度应维持在 30% 以下。DMAPs 的稳定性需在六个月内定期监测。 - 确定 离体 使用Franz扩散池（FDC）装置测定药物在皮肤中的沉积及其经皮吸收。具体操作为：按前述方法制备皮肤，并按照步骤3.6所述，将DMAPs插入皮肤结构中持续30秒。
- 随后，使用适量氰基丙烯酸酯将FDC的供体室粘附到皮肤上。待干燥后，用适当的夹具将皮肤-供体室复合物固定到接收室上。12最后，按照第3.5小节所述的采样方案进行操作。
注意：此步骤涉及 离体 人体或动物皮肤实验均依照瓦伦西亚大学人类与动物研究伦理委员会的指南并获得其批准。适用情况下均获取了知情同意，所有实验均遵守机构及欧洲关于在生物医学研究中使用人体和动物组织的伦理标准。若DMAPs溶解缓慢，可使用外科粘合带将其固定于皮肤，以防止其从皮肤结构中自行排出。
- 随后，使用适量氰基丙烯酸酯将FDC的供体室粘附到皮肤上。待干燥后，用适当的夹具将皮肤-供体室复合物固定到接收室上。12最后，按照第3.5小节所述的采样方案进行操作。
- 评估 体外 使用基于四唑盐和刃天青的代谢活性检测法，或增殖检测法（包括5-溴-2'-脱氧尿苷溴脱氧尿苷（BrdU）检测法），按照制造商说明书进行生物相容性评估。
注意：推荐使用的细胞系为角质形成细胞、成纤维细胞或黑色素细胞。未暴露于透皮微针阵列贴片（DMAPs）的细胞通常作为阴性对照，而经1%十二烷基硫酸钠（SDS）处理的细胞则作为阳性对照。生物相容性评估取决于DMAPs的溶出特性。对于快速溶解型DMAPs（24小时内溶解），采用浸提液法，即在细胞暴露前先将装置溶解；对于缓慢溶解型DMAPs，则采用直接接触法，即将装置直接添加至接种细胞的孔中。根据国际标准ISO 10993规定，细胞活力结果 >70% 被认为是无毒的。
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结果
制备的 DMAP 应呈现均一的外观，并成功形成微针状突起，如图 2A所示。当仅将有色载药物质加载至微针结构时，由于药物从针尖溢出或在浇铸无药聚合物分散液之前清洗不完全，少量药物可能污染 DMAP 的基板。然而，两种结构之间仍可观察到明显差异。通过光学显微镜观察时，微针状突起应具有尖锐的针尖，且无变形现象（图 2B）。尽管长度测量的差异通常可忽略不计，但仍强烈建议通过扫描电子显微镜（SEM）成像来验证上述观察结果。
DMAPs 的压缩会形成针状结构，如图 2C所示。变形程度取决于聚合物的种类和浓度，材料浓度越高，机械阻力越大，因而可压缩性越低。例如，PVA 和 PVP 是制备 DMAPs 最常用的两种聚合物，其在水溶液中的浓度范围通常为 5% 至 30%（w/w）。使用不同聚合物组合（如 PVA-PVP）或它们之间的交联反应，可能有助于提高 DMAPs 的机械性能。
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讨论
本文所述方案可用于制备可溶性微针阵列（DMAPs）。然而，由于可用于制造DMAPs的聚合物材料具有高度的多样性和广泛的选择范围，因此能够生产出具备不同特性的可溶性微针装置。文中展示的结果对应于快速溶解型DMAPs，因其采用聚乙烯吡咯烷酮（PVP）制备，该聚合物在低浓度下即具有高度水分散性。通过更换所用聚合物或调节其浓度，可简便地调控DMAPs的溶解时间。因此，材料的选择是制造过程中的关键步骤，使用者必须根据所开发装置的设计原理和目标合理地进行选材。
此外，本文所述的 DMAP 仅在微针状突起内部载有药物，这限制了系统递送的药物量。值得注意的是，活性成分的含量最高可达 5% 浓度；然而，根据其分子量、结构和性质的不同，这些成分可能与聚合物材料产生不同的相互作用，并在干燥后改变其机械性能。因此，这类 DMAP 主要设计用于局部皮肤疾病的治疗，因为实现全身性药物浓度较为困难。值得注意的是，疫苗接种是一种可通过尖端载药 DMAP 实现的全身性应用，因为触发免疫反应所需的抗原量非常低。13此外，已有报道称皮肤和黏膜组织富含朗格汉斯细胞，这类细胞...
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披露
作者声明不存在利益冲突或相关财务利益。
致谢
本出版物属于由 MCIN/AEI/10.13039/501100011033 资助的项目 PID2020-114530GA-I00 的一部分。图1中的示意图是通过 Biorender.com 在有效许可证下创建的。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养12孔板 | N/A | N/A | 无特殊规格要求，任何市售的细胞培养12孔板均可使用 |
| 离心机 | Eppendorf | Centrifuge 5810 G | 可替换为任何可适配细胞培养板的其他离心机 |
| 亚甲蓝 | Sigma Aldrich | 66720 | CAS 122965-43-9。可替换为其他染料或品牌 |
| 油泥 | N/A | N/A | 无特殊规格要求，任何市售油泥均可使用 |
| 烯烃类热塑性薄膜 | Amcor | PM996 | Parafilm M |
| 聚乙烯醇（PVA）分子量：9–10 kDa | Sigma Aldrich | 363146 | CAS 9002-89-5。可替换为其他品牌的同类产品 |
| 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）分子量：40 kDa | Sigma Aldrich | PVP40 | CAS 9003-39-8。可替换为其他品牌的同类产品 |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具 | Micropoint Technologies | ST-06 | 针阵列分布 15 × 15；高度 600 µm；基底 200 µm；针间距 500 µm。可替换为具有其他腔体形状和长度的PDMS模具 |
| 压力罐 | Protrima | AT-10HT | 可替换为任何可承受4 bar压力的其他压力罐 |
参考文献
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