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方法文章

评估百里醌对大鼠Keap-1/Nrf-2信号通路、氧化应激及行为的影响

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DOI：

10.3791/69924

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2026年3月13日

 , 
1Faculty of Medicine, Department of Physiology, Kirsehir Ahi Evran University, 2Faculty of Medicine, Department of Histology and Embryology, Kirsehir Ahi Evran University

本文内容

摘要

本实验方案演示了如何评估胡椒酮对亚慢性溴氰菊酯暴露大鼠模型中Keap-1/Nrf-2通路、氧化应激生物标志物及行为学结果的影响。

摘要

近年来，农药暴露研究的进展使得基于抗氧化剂的保护策略受到更多关注。百里醌（TQ）是一种来源于植物的生物活性化合物，据报道对多种毒性物质具有保护作用。本研究描述了一种评估TQ对低剂量溴氰菊酯（DTM）暴露大鼠氧化应激指标、Keap-1/Nrf-2信号通路及行为学结果影响的实验方案。实验中，将24只成年雄性Wistar Albino大鼠（250 ± 20 g）随机分为四组（每组n = 6）：对照组、TQ组、DTM组和DTM+TQ组。连续30天通过灌胃方式给予DTM（1.28 mg/kg）和TQ（10 mg/kg）。在整个实验期间监测体重变化。第31天采用旷场实验评估大鼠的运动活性和类似焦虑行为，第32天采用强迫游泳实验评估类似抑郁行为。实验结束后采集血浆和脑组织，用于生化、组织病理学和分子生物学分析。在血浆和大脑皮层样本中检测了包括丙二醛、总一氧化氮、谷胱甘肽和巯基水平在内的氧化应激标志物。采用Western blotting和免疫组织化学方法分析Kelch样ECH相关蛋白1（Keap-1）和核因子红系2相关因子2（Nrf-2）的表达水平。该方案为研究农药诱导的神经毒性及抗氧化化合物的调节作用提供了全面且可重复的方法体系。

引言

杀虫剂广泛应用于农业和家庭环境中以控制害虫；然而，长期暴露于低剂量杀虫剂可能导致环境污染，并对人类和动物健康产生不良影响。这种暴露，特别是通过受污染的食物和水途径，已被认为与神经系统疾病及其他系统性毒性的风险增加相关1。

由于对有机磷杀虫剂的监管日益严格，且拟除虫菊酯类杀虫剂对哺乳动物的毒性相对较低，因此前者已大多被后者取代。DTM 是一种含有 α-氰基的 II 型拟除虫菊酯，是全球最常用的杀虫剂之一，被认为对昆虫具有高效杀灭作用2。尽管如此，实验研究已表明，DTM 暴露可在动物模型中引发氧化应激和神经毒性3,4。

DTM 是一种高度亲脂的化合物，可轻易穿过血脑屏障，并通过延长电压门控钠通道的开放时间来干扰神经元功能。这种效应会导致神经元重复放电、细胞内钠离子内流增加以及活性氧的生成增强，最终导致氧化损伤、炎症反应和行为改变，尤其影响海马体和大脑皮层等脆弱的脑区1。鉴于人们对农药诱导的神经毒性日益关注，越来越多的研究开始聚焦于源自天然物质的抗氧化保护策略。TQ 是Nigella sativa（黑种草）精油中的主要生物活性成分，已被报道具有强大的抗氧化、抗炎和神经保护特性5。多项研究已证实其在对抗化学诱导的氧化应激和神经退行性过程方面具有有益作用5,6,7,8,9。

TQ 保护作用的主要机制之一涉及对 Keap-1/Nrf-2 信号通路的调节。该通路通过调控抗氧化酶和解毒酶的表达，在维持细胞氧化还原稳态中发挥核心作用。在氧化应激条件下，Keap-1 对 Nrf-2 的抑制作用被解除，使 Nrf-2 转位至细胞核，激活抗氧化反应元件依赖性基因的表达9。

由于 DTM 暴露会在分子、生化、组织学和行为水平上引起改变，单一的分析方法不足以全面捕捉其神经毒性效应。因此，本方案整合了行为学评估、氧化应激生物标志物分析、组织病理学评价以及对 Keap-1/Nrf-2 通路的分子研究，为研究农药诱导的神经毒性和抗氧化化合物（如 TQ）的调节作用提供了一个全面且可重复的框架。

综上所述，上述证据凸显了采用整合性实验方法的必要性，以阐明 DTM 诱导神经毒性的机制，并评估潜在的保护性干预措施。本实验方案通过将行为学评估与 Keap-1/Nrf-2 通路的生化、组织病理学及分子分析相结合，实现了对氧化应激相关神经元损伤的多维度评价。在此机制框架下对实验结果的解读，重点阐述了 TQ 如何调节氧化还原信号通路、减轻组织损伤，并在亚慢性 DTM 暴露条件下改善行为学结局。

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方案

机构动物实验地方伦理委员会已批准本实验方案，注册编号为 68429034/35。本研究总持续时间为 32 天。实验前，动物已在标准实验室条件下适应环境。所有实验操作均严格遵循机构及国际动物伦理指南。本方案中使用的实验材料列于材料表中。

注意：化学和生物废弃物的处理遵循机构的实验室安全和废弃物管理指南。酸、碱和有机溶剂分别收集在贴有标签的容器中，并送至机构的危险废弃物处理部门。生物材料和被污染的耗材收集在生物危害容器中，经灭菌后转移至机构指定设施进行最终处置。

1. 实验设计

  1. 从动物实验实验室获取24只成年雄性Wistar Albino大鼠，体重为250 ± 20 g。将每只大鼠单独饲养于笼中，环境温度为24 ± 2 °C，光照/黑暗周期为12小时/12小时，并提供 随意摄取 可自由获取标准大鼠饲料和自来水。
  2. 将动物随机分为四组（每组 n = 6）：第1组：对照组（C），第2组：TQ组，第3组：DTM组，第4组：DTM + TQ组。
  3. 将纯度为98%的DTM溶解于玉米油中，通过灌胃给予1.28 mg/kg剂量，持续30天。
  4. 将TQ以10 mg/kg的剂量溶于玉米油中，通过灌胃给予，持续30天。所有药物溶液需每日新鲜配制，并以1 mL/kg的总体积给药。
  5. 在联合治疗组中，于DTM给药后立即给予TQ。对照组仅给予玉米油，以排除灌胃操作相关应激的影响。
    注意：DTM 剂量的选择基于既往文献，旨在诱导氧化应激而不引起发病，相当于约 1/100 的 LD501.

2. 体重测量

  1. 在研究的第1、10、20和30天测量体重（图1）。

3. 行为参数

  1. 在标准化条件下进行所有行为学测试，以确保结果的一致性。使用 overhead 摄像机记录强迫游泳实验（FST）和开放旷场实验（OFT），确保完整视野覆盖测试装置。保持光照强度在约 100–150 lux。将“不动”定义为无主动运动状态，仅允许维持姿势和呼吸所必需的微小动作。每次测试不同动物之间，需用 70% 乙醇彻底清洁所有测试区域，以避免嗅觉干扰。
  2. FST
    1. 在第 32 天进行 FST，以评估类抑郁行为。在 5 分钟正式测试前 24 小时进行一次 15 分钟的预测试，使动物适应水环境，减少由新奇环境引起的应激反应。预测试期间不进行行为评分。
    2. 将大鼠单独放入圆柱形容器（直径：35 cm，高度：50 cm）中，容器内盛有 30 cm 深的水，水温维持在 25 ± 1 °C，持续 5 分钟。
    3. 使用视频摄像机记录游泳、攀爬和不动的时间。从视频记录中量化各项行为参数，单位为秒10。
    4. 行为定义如下：
      不动：当动物漂浮且无主动运动，仅进行必要微小动作以保持头部露出水面时，视为不动状态。
      游泳：定义为动物在圆柱形容器内进行主动的水平移动，四肢协调运动。
      攀爬：定义为动物保持直立姿势时，前肢用力向上抓挠容器壁的动作。
    5. 若动物完全静止不动，则根据预设标准将其行为记为不动。
    6. 测试期间不得施加外部刺激或人为纠正其运动轨迹。允许动物在完整的 5 分钟内自由活动，除非出于安全考虑必须干预（例如溺水风险）。
  3. OFT
    1. 在第 31 天进行 OFT，以评估运动活性和类焦虑行为11。在尺寸为 90 × 35 cm 的测试区域中记录个体动物 5 分钟内的活动，该区域由黑色线条划分为 24 个相等单元。
    2. 由对分组信息设盲的研究人员根据视频记录量化以下行为参数：
      四肢全部跨过格线的次数（运动活性）
      在中央区域和周边区域停留的时间（类焦虑行为）
    3. 若动物完全静止不动，则将该行为记录为不动，并将该时间段内的跨格次数记为零。
    4. 测试期间不得施加外部刺激、重新放置动物或进行路径纠正。
    5. 允许动物在完整的 5 分钟内自由活动，除非出于安全原因需要干预。
    6. 每次测试不同动物之间，需用 70% 乙醇清洁测试区域，以消除嗅觉线索。

4. 氧化应激标志物的评估

  1. 在第32天进行所有操作。通过肌肉注射给予赛拉嗪（5 mg/kg）和氯胺酮（45 mg/kg）对大鼠进行深度麻醉。通过检查足底回缩反射消失来确认深度麻醉状态。使用EDTA包被的采血管经心脏穿刺采集约3–5 mL血液。
  2. 在深度麻醉下通过放血法完成安乐死，并在组织采集前确认动物死亡。将血液样本在4 °C条件下以3,000 × g离心10–15分钟。小心收集血浆，避免扰动白膜层，并将等分试样储存于−80 °C。将脑组织迅速置于冰上解剖。分离左侧大脑半球和海马用于生化分析，并在液氮中速冻（储存于−80 °C）。将右侧大脑半球固定于10%中性缓冲甲醛溶液中，用于组织学评估。
  3. 血浆氧化应激分析
    1. 血浆脂质过氧化（TBARS法）
      1. 将血浆样本在4 °C条件下以3,000 × g离心10分钟。取0.5 mL血浆与1 mL TCA–TBA–HCl试剂（15%三氯乙酸（TCA）、0.375%硫代巴比妥酸（TBA）、0.25 N盐酸（HCl））混合。在1,000 × g下离心10分钟，将上清液转移至玻璃试管中。加入50 µL 0.02%丁基化羟基甲苯（BHT）以防止人工氧化。
      2. 在100 °C加热15分钟，冷却至室温，在1,000 × g下离心10分钟，于532 nm处测定上清液吸光度10。利用比尔-朗伯定律计算MDA浓度：
        ε = 1.56 × 105 M⁻1 cm⁻1，l = 1 cm，结果以nmol/mL血浆表示。
    2. 血浆巯基（RSH）水平
      1. 将0.5 mL血浆与含1%十二烷基硫酸钠（SDS）和2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的Tris-HCl缓冲液（100 mM，pH 8.2）混合。在25 °C孵育5分钟，在4 °C条件下以3,000 × g离心10分钟。使用上清液进行分析。
      2. 加入0.3 mM 5,5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB），在37 °C孵育15分钟。在412 nm处测定吸光度10。利用ε = 13,600 M⁻1 cm⁻1计算RSH浓度，结果以µmol/L血浆表示。
    3. 血浆NOx水平（Griess反应）
      1. 使用0.3 M氢氧化钠（NaOH）和5%硫酸锌（ZnSO₄）对血浆进行去蛋白处理。在20,000 × g下离心5分钟，收集上清液。
      2. 配制硝酸盐标准溶液（100、10和1 mmol/L），并绘制标准曲线（1–100 µmol/L）。取100 µL上清液（设复孔）加入微孔板中。
      3. 加入100 µL三氯化钒（VCl₃），随后加入50 µL磺胺和50 µL N-(1-萘基)乙二胺。在室温孵育30–45分钟，在540 nm处测定吸光度10。根据标准曲线确定NOx浓度，结果以µmol/L血浆表示。
  4. 组织氧化应激分析
    1. 使用约100 mg左侧大脑半球组织进行所有生化分析。
    2. 组织脂质过氧化（TBARS法）
      1. 将组织以1:10（w/v）比例在冰上用10% TCA匀浆。加入等体积0.67% TBA，在100 °C加热15分钟。冷却后在4 °C条件下以3,000 × g离心10分钟10。在535 nm处测定上清液吸光度。利用ε = 1.56 × 105 M⁻1 cm⁻1计算MDA含量，结果以nmol/g湿组织表示。
    3. 组织谷胱甘肽（GSH）水平
      1. 将组织以1:10（w/v）比例用10% TCA匀浆，并在4 °C条件下以3,000 × g离心10分钟。取0.5 mL上清液与2 mL DTNB溶液（0.4 mg/mL，溶于1%柠檬酸钠）混合10。立即在412 nm处测定吸光度。利用ε = 13,600 M⁻1 cm⁻1计算GSH含量，结果以µmol/g湿组织表示。
    4. 组织NOx水平（Griess反应）
      1. 将组织以1:5（w/v）比例在磷酸盐缓冲液（PBS）中匀浆，并以2,000 × g离心5分钟。使用0.3 M NaOH和5% ZnSO₄对上清液进行去蛋白处理。以3,000 × g离心20分钟，收集澄清上清液。
      2. 配制硝酸盐标准品（1–100 µmol/L）。取100 µL上清液（设复孔）加入微孔板中。按上述方法加入VCl₃和Griess试剂。在37 °C孵育45分钟，在540 nm处测定吸光度10。根据标准曲线确定浓度，结果以µmol/g组织表示。
        注意：涉及危险化学品（包括TCA、HCl、NaOH和有机溶剂）的操作均在认证的化学通风橱中进行。所有实验过程中均使用适当个人防护装备（PPE），如实验服、耐化学腐蚀手套、护目镜，必要时佩戴面罩。所有化学品的使用均遵循机构安全指南及相关材料安全数据表（MSDS）的要求。

5. 通过蛋白质印迹分析测定 Keap-1 和 Nrf-2 水平

  1. 将海马组织切成50 mg的组织块，放入含有500 µL RIPA裂解缓冲液（添加蛋白酶抑制剂混合物）的匀浆管中。
  2. 加入适量磁珠，在1,000 × g 条件下匀浆两个循环。于4 °C下以14,000 × g 离心10分钟。
  3. 将上清液转移至洁净的微量离心管中，在相同条件下再次离心。样品置于冰上保存，并测定蛋白浓度。
  4. 使用荧光计配合Protein BR Assay试剂盒测定蛋白浓度，操作步骤遵循制造商说明书。
  5. 制备10% SDS–PAGE凝胶用于电泳。将蛋白浓度调整至30 µg/µL。
  6. 按3:1比例加入4× Laemmli上样缓冲液，并补充10% β-巯基乙醇。95 °C加热样品5分钟，然后短暂离心。
  7. 每条泳道上样5 µL蛋白Marker和30 µg蛋白样品。以110 V电压运行60–90分钟。
  8. 将PVDF膜在100%甲醇中活化3–5分钟，随后在1×转移缓冲液中室温平衡10分钟，再进行转膜。
  9. 用转移缓冲液浸湿滤纸和海绵，小心组装转膜“三明治”结构，确保完全排除气泡。使用湿法转膜系统在4 °C、100 V恒压条件下转膜90分钟。
  10. 将膜置于3%牛血清白蛋白（BSA）溶液中，在室温摇床上封闭1小时。随后在4 °C用3% BSA稀释的一抗抗体（Keap-1和Nrf-2，1:3,000；β-actin，1:1,000）孵育过夜。
  11. 用含0.1% Tween 20的1× Tris缓冲盐水（TBS-T）洗涤膜5次，每次5分钟。在避光条件下，室温孵育二抗（1:15,000）1小时。
  12. 按上述方法洗涤膜，然后根据制造商说明书加入增强型化学发光（ECL）底物（如基于鲁米诺的HRP底物）（使用前立即等体积混合试剂A和B）。加入足量底物以完全覆盖膜表面（约每张膜1 mL），室温孵育1–2分钟。
  13. 使用配备化学发光检测功能的数字成像系统检测化学发光信号（无需特定激发波长，因光信号来自HRP–鲁米诺反应）。采用自动曝光设置采集图像，确保条带未饱和。同一印迹中所有样品的曝光参数应保持一致。
  14. 使用图像分析软件进行密度分析，ROI选择、背景扣除和归一化参数需保持一致。将Keap-1和Nrf-2条带强度归一化至内参蛋白β-actin。将归一化后的数值导出为.csv文件用于统计分析。

6. 组织病理学分析

  1. 将右侧大脑半球置于10%中性福尔马林中固定72小时。通过梯度乙醇系列（70%–100%）脱水，石蜡包埋，并切成5 µm厚切片。
    根据Paxinos & Watson《大鼠脑立体定位图谱》（学术出版社）中定义的立体定位坐标，在海马和内嗅皮层水平获取冠状脑切片。使用交互式大鼠脑图谱查看器（https://labs.gaidi.ca/rat-brain-atlas）验证并优化解剖定位11。
  2. 采用标准组织学方法，从石蜡包埋的脑组织中制备连续冠状切片四张（每张厚5 µm）。按照常规方案对切片进行苏木精-伊红（H&E）染色12。在光学显微镜下以200×放大倍数观察所有切片。确保由不知分组情况的研究人员进行组织学评估，以尽量减少观察者偏倚13。
    注：该步骤可确保各组间解剖结构比较的一致性。
  3. 对每张切片的10个随机视野中的神经元丢失、细胞水肿、核固缩、炎性细胞浸润和血管充血进行半定量评估。
  4. 计算每组各参数的平均评分。评分标准如下：0分（无，<5%）、1分（轻度，<33%）、2分（中度，33–66%）、3分（重度，>66%；表1）。

7. 海马和内嗅皮层中 Nrf-2 和 Keap-1 反应性的免疫组织化学分析

  1. 从海马体和内嗅皮层制备5 µm厚的切片，并将其贴附于载玻片上。
  2. 脱蜡并水化切片，然后在室温下用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。
  3. 将切片与3%过氧化氢孵育5分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。用PBS洗涤切片。
  4. 通过将载玻片在柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中加热10–15分钟进行抗原修复。让载玻片冷却30分钟，然后用PBS洗涤。
  5. 再次将切片与3%过氧化氢孵育15分钟，以确保完全抑制过氧化物酶活性。用PBS洗涤切片。
  6. 加入封闭液孵育10分钟，以减少非特异性结合。随后在4 °C下与Nrf-2（1:100稀释）和Keap-1（1:200稀释）的一抗抗体孵育过夜。孵育后用PBS洗涤切片。
  7. 在室温下用合适的二抗抗体孵育切片30分钟。用PBS洗涤切片。
  8. 向切片上加链霉亲和素-过氧化物酶，在湿盒中室温孵育20分钟（使用含有湿润滤纸的密封孵育盒，维持相对湿度在95–100%）。孵育后用PBS洗涤切片。
  9. 加入DAB显色剂，并在光学显微镜下以100×放大倍数观察显色情况。通过用自来水冲洗载玻片终止反应。
  10. 用稀释1:9的苏木精在室温下复染切片5分钟。用PBS和蒸馏水充分冲洗。使用永久性封片剂封片。
  11. 在光学显微镜下观察染色切片。从每张切片的16个代表性视野中以×400放大倍数拍摄显微照片。
  12. 使用图像分析软件对Nrf-2和Keap-1的免疫反应性进行定量。记录并分析定量数据，用于进一步的统计学评估。
  13. 进行免疫组织化学分析时，在ImageJ中打开图像，并使用“设定标尺”工具进行校准。将所有图像转换为8位灰度图像，以标准化强度测量。手动定义阳性染色区域及相邻背景区域的兴趣区（ROI），并保存至ROI管理器中。
  14. 采用一致的H-DAB颜色去卷积方法，随后对所有样本使用相同的阈值参数进行染色强度定量。测量平均灰度值、光密度和阳性区域百分比。
  15. 对于基于细胞的分析，使用Watershed工具对阈值化图像进行分割，并利用Analyze Particles功能定量阳性细胞。所有数据均导出为.csv文件用于统计分析。

8. 统计分析

  1. 使用 SPSS 29.0 版本进行统计分析。在“数据视图”选项卡中输入原始数据，每一行代表一只单独的动物，变量在“变量视图”选项卡中定义；实验组编码为分类变量（对照组、TQ、DTM 和 DTM+TQ）。
  2. 通过选择 分析 > 描述统计 > 探索，使用 Shapiro–Wilk 检验评估数据正态性，将结果变量分配至“因变量列表”，组别分配至“因子列表”，并启用“带检验的正态图”。对于符合正态分布的变量，通过 分析 > 比较均值 > 单因素方差分析 进行组间比较，并在“选项”中启用描述性统计和 Levene 方差齐性检验。
  3. 当检测到显著主效应时，通过“事后比较”菜单应用 Tukey 事后检验，以识别成对组间差异。使用 Levene 检验结果确认方差齐性（p > 0.05）。
  4. 对于不满足参数检验假设的组织病理学评分数据，选择 分析 > 非参数检验 > 旧对话框 > K 个独立样本，使用 Kruskal–Wallis 检验进行非参数分析，随后使用“独立样本非参数检验”模块进行 Bonferroni 校正的 Dunn 事后检验。
  5. 将统计输出结果和汇总表格导出为 .xls 或 .csv 文件，结果以均值 ± 标准差（SD）表示，p 值 < 0.05 被认为具有统计学显著性。

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结果

体重测量
在第1、10、20和30天记录体重。C组和TQ组大鼠在整个实验期间体重呈进行性增加，第30天时两组之间无显著差异。相比之下，暴露于DTM的大鼠体重较对照组显著降低。联合给予TQ可减轻DTM相关的体重减轻。研究期间未观察到死亡情况（图1）。

行为学评估
运动活动
通过旷场实验中的格线穿越次数评估运动活动能力。C组和TQ组的运动活动能力相似。DTM暴露显著减少了穿越次数，而与DTM组相比，TQ联合给药部分恢复了运动活动能力（图2）。

OFT
通过测量动物在旷场中心区域和周边区域停留的时间来评估其探索行为。C组和TQ组在中心–周边区域的分布情况相似。DTM暴露导致动物在中心区域停留时间减少，而在周边区域停留时间增加。DTM+TQ组的数值介于对照组与DTM处理组动物之间（图3）...

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讨论

本研究表明，大鼠经口亚慢性暴露于DTM可引发持续的行为学、生物化学、分子水平及组织病理学改变，而同时给予TQ可有效减轻这些效应。通过将标准化行为学检测、氧化应激谱分析、Keap-1/Nrf-2信号通路水平的分子分析以及组织病理学评估相结合，该实验方案为评估农药诱导的神经毒性及基于抗氧化剂的神经保护作用提供了可靠且可重复的研究框架。

所选DTM剂量（1.28 mg/kg/天，经口灌胃，持续30天）基于已建立的亚慢性暴露模型，可产生可测量的神经行为学和生物化学效应，且不引起死亡或急性全身毒性14。与既往采用相似给药方案和暴露途径的研究一致，DTM处理的大鼠表现出体重减轻、活动能力下降、强迫游泳实验（FST）中不动时间增加，以及开放场实验（OFT）中中心区域探索减少1,15,16,17<...

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披露

作者不存在任何利益冲突或竞争性经济利益。

致谢

本研究未获得外部资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)Thermo Scientific  69-78-3 
台式离心机 NF048Nüve43560
Beta_Actin ThermoFisher Scientific, 美国7D2C10
BSA 溶液  Proteintech, 美国66201-1-Ig
丁基化羟基甲苯Sigma Aldrich128-37-0
数字式匀浆器ör Daihan Scientifichttps://www.artlaboratuv
arcihazlari.com/urun/dai
han-hg-15d-dijital-homoje
nizator-set-a?srsltid=Afm
BOorx_az06ulcHpSzKZs
uP8-47Za4BkvLOM22Xh
p00tgwWhJ-86Vc
DTM  Bayer TR01426058O
苏木精-伊红–染色 Bio OpticaW01030708
盐酸Merck7647-01-0
Image J 软件程序 NIH；美国华盛顿https://imagej.net/ij/
免疫组织化学染色试剂盒 Lab VisionTM UltraVisionTM 大容量检测系统：抗多价抗体HRP, TA-125-HL
Leica Autocut 14051956472德国https://www.leicabiosystems
.com/histology-equipment/mi
crotomes/histocore-autocut/
光学显微镜 Nikon, Eclipse Ni-U, 940728
N-(1-萘基)乙二胺Thermo Scientific 1465-25-4
纳米微孔板读板仪BMG LABTECHSPECTROstar Nano
磷酸盐缓冲液 MerckP4417
一抗 Keap-1 Proteintech货号 10503-2-AP, 1:200
一抗 Nrf-2 Proteintech货号 16396-1-AP, 1/100
Qubit Protein BR 检测试剂盒 ThermoFisher Scientific-INVITROGENQ33211
柠檬酸钠Merck03-04-6132
十二烷基硫酸钠Thermo Scientific 151-21-3
氢氧化钠Merck1310-73-2
硝酸钠Merck7631-99-4
链霉亲和素过氧化物酶 Thermo Scientific SHRP248-B
磺胺嘧啶Thermo Scientific  63-74-1 
硫代巴比妥酸 Merck504-17-6
TQ CAYMAN 490-91-5
三羧基丙酸，99%Thermo Scientific Chemicals 139360500
三氯乙酸Thermo Scientific Chemicals76-03-9
Tris-HClThermo Scientific  1185-53-1 
三氯化钒Sigma Aldrich7718-98-1
West Pico PLUS 化学发光底物及 iBright 750 Thermo Fisher Scientific 系统https://www.clinxsci.com/product
/mini_chemiluminescence_imagi
ng_system?gad_source=1&gad
_campaignid=16224184202&gbr
aid=0AAAAAoN6UOOtoB8UD0d
eumBAMD8Xi-1l-&gclid=CjwKCAj
wgeLHBhBuEiwAL5gNEXtK2CNS
LS1GqllMuNgkrFYDaW7yK585njQ
jFja485Fkwj9lRUEKDBoCgLoQA
vD_BwE
硫酸锌溶液Merck7733-02-0

参考文献

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