机器学习辅助的拉曼谱分析对血清素响应的单核碳纳米神经管（SSDN）纳米传感器，以提升对多巴胺的选择性

Summary

该协议描述了对ssDNA包裹的单壁碳纳米管纳米传感器进行拉曼光谱分析，借助机器学习模型，改进了对血清素多巴胺的选择性测量。

Abstract

血清素（5-羟色胺，5-HT）在神经调节中起关键作用，但目前的检测方法难以实现高灵敏度和选择性的实时感测。我们此前开发了近红外血清素纳米传感器（nIRHT），由包裹单壁单壁碳纳米管组成，能灵敏检测5-HT。然而，nIRHT的荧光反应无法区分5HT和多巴胺（DA），限制了其实际应用。本研究结合拉曼光谱与机器学习克服了选择性挑战。G波段光谱特征显示5HT与DA结合nIRHT的特征明显不同，DA导致G波段抑制更强。我们采用微分拉曼（ΔRaman）分离分析物特异性光谱变化，并训练了三个机器学习模型进行分类。采用ΔRaman的随机森林模型实现了95.8%的最佳性能，显著优于使用原始拉曼光谱的模型。该方法特异性提升，对乙酰胆碱、GABA和谷氨酸的反应极小，且检测限为0.1微米，适合生理应用。这种基于拉曼的方法将非选择性的nIRHT荧光传感器转变为能够稳健神经递质辨别的平台，克服了单壁碳纳米管（SWCNT）分子传感中的选择性问题。

Introduction

血清素（5-羟色胺，5-羟色胺，5-HT）是一种调节情绪、认知、睡眠和食欲的关键神经递质，功能障碍与抑郁、焦虑及其他神经精神疾病^有关。由于突触传递的时间尺度为毫秒级，以及神经组织复杂的化学环境，实时监测生物系统中血清素动态仍具挑战性².尽管神经递质检测技术取得了重大进展，但实现血清素的高灵敏度和分子选择性仍面临重大分析挑战。

当前的血清素检测方法涵盖了从传统分析技术到新兴纳米传感器平台的范围。高性能液相色谱带电化学检测（HPLC-ED）仍是金标准，实现0.056 nM的检测限，且具有优异的复现性³。然而，HPLC需要大量样品制备和15-30分钟的分析时间，无法实现^{实时监测。}快速扫描循环伏安法（FSCV）实现碳纤维微电极的亚秒时间分辨率，但存在电极结垢和结构相似神经递质间选择性有限的问题 ^5,6。近期基因编码荧光传感器的发展，包括iSeroSnFR⁷和GRAB-5HT⁸，具有显著的灵敏度和动态范围，但需要对目标组织进行基因修饰，从而限制临床翻译。

单壁碳纳米管（SWCNT）光学传感器已成为无^{标记神经递}质检测的有前景平台9。DNA功能化单壁碳纳米管在分析物结合时表现出近红外（nIR）荧光调制，使得在组织透明窗口（900-1400 nm）内进行检测^10,11。Landry团队通过指数富集（SELEC）系统进化配体，筛选了~¹⁰个独特的ssDNA序列，以识别对血清素有反应的构造体，开发了nIRHT传感器¹²。该传感器在血清素结合时实现微摩尔灵敏度，荧光增强达到200%，且可独立于多巴胺或血清素氧化。为排除氧化干扰，我们之前的研究确认了这些神经递质溶液的稳定性;紫外可见和核磁共振分析显示，与纯5HT¹²相比，没有氧化变化或新的峰值形成。此外，该系统采用的短孵育时间和中性pH条件旨在防止显著的醌类生成。同样，Strano团队开创了日冕相分子识别（CoPhMoRe），证明包裹（GT）₁₅₅的单壁碳纳米管能检测到11 nM浓度的多巴胺¹³。我们团队最近通过机器学习引导优化推进了该领域，通过对系统性突变序列进行高通量筛选，灵敏度提升了2.5^倍。

尽管取得了这些进展，但血清素与多巴胺之间的选择性不足仍是一个根本性的限制。这两种神经递质都含有芳香环和乙胺链，仅差一个羟基¹⁵。目前基于荧光的单壁碳纳米管传感器通常选择性比低于5：1，无法区分突触环境中共释放的神经递质¹⁶。这种选择性挑战尤为关键，因为血清素和多巴胺常常共定位于控制奖励和动机的大脑区域（¹⁷）。

拉曼光谱通过对SWCNT-分析物¹⁸的振动模态分析，提供了互补的化学信息。单壁碳纳米管的G波段（~1580 cm⁻¹）分为G⁺和G⁻组分，频率对分子吸附和电子掺杂敏感¹⁹。先前的一项研究表明，单碳碳纳米管上的非共价界面活性剂会在G波段区域²⁰引发明显的拉曼谱变化。

本研究展示了机器学习辅助的拉曼谱分析，用于增强血清素与多巴胺之间的选择性。我们系统地表征了0.01至100 μM的浓度依赖性拉曼反应，揭示了每种神经递质的独特光谱指纹。三种机器学习模型——卷积神经网络（CNN）、支持向量机（SVM）和随机森林（RF）——在谱数据集上训练以分类分析物身份。关键是引入差分拉曼处理，去除基线信号以分离分析物特异性特征。经过DR处理的优化射频模型实现了95.8%的分类准确率，代表了分子辨别技术的重大进展。这种结合nIR荧光敏感性和拉曼化学特异性的多模态方法，为在复杂生物环境中实现实时选择性血清素监测提供了途径。

Protocol

1. ssDNA功能化单碳纳米管nIRHT纳米传感器制造

1. 将1毫克单壁碳纳米管（SWCNTs）、100微升1毫米E6#9超脱离性DNA和900微升1x磷酸缓冲生理盐水（PBS）混合在1.5毫升的管内。
   注意：干燥的单碳纳米管粉末存在潜在吸入危险。将粉末放入认证的化学排气罩内，并佩戴适当的个人防护装备，包括口罩和手套。
2. 用浴式超声波器将混合物分散5分钟。用配备3毫米探头的尖端超声器，以50%振幅在冰浴中进行30分钟的超声处理。
3. 将超声处理溶液以21,500 x g 离心1小时，沉淀出非分散的单壁碳纳米管。仔细收集850微升上清液并转移到新管子中。
4. 测量收集的单壁碳纳米管悬浮液在632纳米波长下的吸收率。使用单壁碳纳米管消光系数0.036（mg/L）⁻¹ 厘米⁻¹计算浓度。将最终的nIRHT传感器溶液存放在4°C，等待进一步使用。

2. 拉曼光谱测量

1. 将10 mg/L nIRHT中的90微升装入96孔板中。使用532纳米激光激发源在PBS缓冲器中测量传感器的拉曼光谱。将这个记录的频谱设为基线。
   注意：在研究活体生物样本时，严格保持激光功率为10毫瓦，波长为532纳米至关重要。更高的激光功率可能引发严重的光毒性，并影响细胞的存活能力。该方案中使用的532纳米、10毫瓦激光已被充分证实为安全且无损的活细胞分析，既能保护敏感细胞^器21 ，也能保持原级神经元²² 的电生理活性，同时确保拉曼信号采集稳健。
2. 将每个90微升传感器溶液（10mg/L）与10微升分析物溶液混合，达到0.01、0.1、1、5、10、50和100微米的最终浓度。分析物加入后等待5分钟，以便培养足够的时间。
3. 测量孵育样品的拉曼光谱。将样品为每种浓度三份，重复步骤2.1至2.2以确保可重复性。

3. 基于机器学习的数据分析

1. 从共208个拉曼谱构建数据集，包括77个多巴胺（DA）反应、76个血清素（5HT）反应和47个对照组（PBS）反应。
2. 对光谱数据的G波段区域进行背景减法。根据G+频段峰值对背景减去数据进行归一化。
3. 应用中位滤波器以减少归一化光谱中的噪声。通过从每个分析物处理的谱中减去归一化控制谱，隔离谱变（ΔRaman）。
4. 开发卷积神经网络（CNN）、随机森林（RF）和支持向量机（SVM）模型，用于5HT、DA或对照组的三元分类。
5. 将整个数据集按6：2：2的比例拆分为训练、验证和测试集。
6. 将CNN架构配置为三个一维卷积层，利用ReLU激活函数，最大池大小为2，然后是两个完全连接的层。
7. 使用径向基函数（RBF）核配置SVM以实现非线性分类。
8. 使用默认超参数配置射频模型。
9. 使用五重交叉验证训练构造模型。计算所有5个折点的平均绩效指标，以确保统计上的稳健性。
10. 选择验证数据中准确率最高的模型进行最终分析。
11. 在测试集中评估所选模型，以验证其泛化能力。
12. 通过顺序排除训练集中值低于0.1微米的数据，确定间接检测极限（LOD）。
13. 对训练好的模型在整个浓度范围（包括低于标准的浓度）进行测试，以确定最终LOD。

Results

E6#9 ssDNA功能化单碳纳米奈米传感器（nIRHT），此前通过SELEC方法开发，在5HT结合时展现出可逆的nIR荧光增强，实现体外及体外实时5HT^成像。E6#9序列（5'-CCCCACCACCACAGACACACACCCCCCC-3'）包裹单薄碳纳米管，形成5HT的结合位点。然而，该传感器缺乏特异性：5-HT和DA的强度提升相当（见图1B），限制了其区分DA和5-HT的实用性。

为克服这一限制，我们利用拉曼光谱研究神经化学物质与nIRHT纳米传感器之间的分子级相互作用。对nIRHT纳米传感器溶液的拉曼分析揭示了G波段区域（~1580 ^cm-1，源自单壁碳纳米管石墨烯状结构中的面内碳振动（见图1C）。G波段可分为两个部分：锐利的G+波段（1580 ^cm-1）对应纳米...

Discussion

拉曼光谱分析显著提升了nIRHT传感器的特异性，而传统荧光响应无法实现这一能力。我们观察到，DA相比5HT对G⁻波段（1570 ^cm-1）的抑制更为明显。这些差异特征很可能源于单壁碳纳米管表面分子取向和结合几何形状的不同。具体来说，DA的儿茶酚基体可能与单壁碳纳米管表面形成更强的π-π相互作用，从而诱导更强的电子扰动，表现为增强的G⁻抑制。相比之下，5HT的吲哚环系统似乎产生较弱的电子耦合，保留了更多内在的拉曼特征。这种差异性相互作用为区分这两种结构相似的神经递质提供了清晰的光谱学基础。

为了评估纳米传感器在持续监测中的实用性，我们使用固定在APTES涂层玻璃基板上的纳米传感器进行了洗净实验。加入5-HT和DA后，拉曼光谱表现出明显的峰值变化，并在后续洗涤步骤后成功恢复到初始基线（补充图6）。这清楚地表明传感器响应的可逆性。有趣的是，这些谱位移在基板固定装置中的具体趋势与溶液状态中通常观察到的行为相反。虽然这种差异的根本机制值得进一步研究，但已确认的可逆性强烈...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HiPCo raw	纳米整合
iDus1.7 InGaAs	安多尔	DU490A-1,9
拉曼图克	纳米光子
振动细胞130	音速