酿酒酵母新生与成熟转录本的RNA结构比较分析

Summary

RNA二级结构主要通过结构探测方法观察到成熟RNA。共转录结构跟踪测序（CoSTseq）将核运行过程与结构探测结合起来，该方法已被用于研究新生RNA上的聚合酶位置。CoSTseq因此能够观察RNA在活性转录下的RNA二级结构。

Abstract

在转录过程中，新生RNA在脱离RNA聚合酶（Pols）时开始碱基配对。这种碱基配对允许形成对RNA处理、翻译和稳定性层面基因表达产生关键影响的结构。已知研究RNA二级结构的方法仅限于成熟转录本，而对折叠状态知之甚少。此外，新生RNA相对较低的丰度（<1%）且瞬时性较强，使其分离和表征变得复杂。共转录结构跟踪（CoSTseq）利用生物素-NTP和二甲基硫酸盐（DMS）探针的转录运行，同时获取新生转录本的Pol位置和碱基配对状态。在 酿酒 酵母中，CoSTseq提供由任一RNA Pols转录的初始RNA3'端附近的序列和结构信息。在转录运行过程中，活性位点掺入的生物素-NTP有效阻滞Pols。然后，DMS甲基酸处理未配对的A、C和U核苷酸。随后通过富集生物素和用模板切换逆转录酶合成cDNA，实现了配对末端测序和基于Pol位置的DMS反应计算。CoSTseq 可与 DMS 探测（DMS-MaPseq）并行进行，从而能够捕获折叠成熟转录本。这里介绍了并行CoSTseq和DMS-MaPseq的详细协议，包括转录运行、文库制备和数据分析。

Introduction

RNA可以通过RNA分子内的碱基配对折叠成二级和三级结构，这些结构还会受到作为伴护蛋白来引导RNA^折叠的进一步影响。RNA结构可以高度动态化，细胞RNA可以符合热力学景观定义的一系列结构，生成可能的RNA构象^集合。动态构象变化有可能影响基因调控和表达 ^3,4。相反，RNA也可以采用与其功能密切相关的高度偏好结构，如tRNA、小核RNA和rRNA。虽然这些例子突出了具有强烈调控作用的成熟RNA，但真核RNA的加工步骤常与转录同时发生，包括前mRNA剪接、3'端切割和RNA修饰。同样，RNA折叠也可能发生在转录本成熟之前，^{正如其他地方}讨论的5.

虽然RNA序列可以编码二级结构，但准确鉴定通常需要体 外 或 体内的实验验证。结构特异性化学修饰技术如DMS-MaPseq（含测序的二甲基硫酸盐突变剖析）的出现，为从^活细胞中确定细胞RNA二级结构铺平了道路。DMS被引入细胞中，特异性地甲基化腺苷、胞嘧啶及较小程度的尿苷碱基配对面，这些仅在未配对时可被利用。经过DMS修饰后，高保真度和高过程的逆转录酶，如热稳定的II组内含子逆转录酶（TGIRT^）7，可用于将修饰碱基作为最终制备的cDNA文库中的突变重新编码。这些突变随后可用于推断RNA在核苷酸水平的可及性。虽然这是一项强大的技术，DMS-MaPseq及相关方法主要用于研究已经^{完全折叠的}成熟RNA6。

已有多种方法用于研究新生RNA的调控和加工。全局运行测序（GROseq）旨在克服RNA-seq的局限性，使其能够在细胞中稳态测量RNA水平，从而提供在转录、RNA加工和降解过程中进行平均化的信息，这些过程影响了RNA水平。GROseq利用溴尿苷进行核运行，其中RNA聚合酶（Pol）可以以数十碱基的分辨率向新生RNA添加核苷^酸。基于该方法，精确运行测序（PROseq）利用生物素-NTPs，以碱基对分辨率绘制RNA极点。在这里，在Pol最后检测到的3'端新合成RNA⁹处加入生物素化NTP。

最近，Schärfen等人开发并利用了共转录结构追踪（CoSTseq），该技术利用并适应生物素运行和DMS探测，使酿酒酵母¹⁰的RNA结构得以确定。CoSTseq使得在主动转录过程中确定RNA二级结构;该协议详细说明了核运行如何与 DMS 探测在 CoSTseq 实验中结合。鉴于CoSTseq在样本准备过程中需要谨慎处理，并在CoSTseq分析过程中对数据质量进行严格关注，本协议详细介绍了在Illumina平台上生成适合配对测序库的最佳实践。CoSTseq协议同时生成新生RNA，成熟RNA可作为DMS-MaPseq数据集进行分析，从而对新生RNA和成熟RNA进行严格比较（见图1）。实验上，需要获得维持酵母培养和进行核运行和DMS探测所需的试剂，详见下文协议。新生RNA产量对CoSTseq文库制备和数据分析的成功至关重要;因此，由适当的培养箱和培养基所建立的生长条件对于获得足够的起始材料至关重要。最后，为了对CoSTseq数据进行计算分析，理想的访问是访问高性能计算（HPC）集群。

图1：同一生物样本中CoSTseq和DMS-MaPseq文库合成的概述。（A） 用沙科唑通过酵母细胞壁和核膜渗透，使生物素-NTP在核运行反应中新生RNA的3'端被掺入。 （B） DMS将未配对的A和C残基（有时为U）甲基化于渗透细胞中新生和成熟RNA上，总RNA通过酚/氯仿萃取获得。随后，新生RNA被链霉亲和素共轭的磁珠从整体RNA中纯化;TRIzol萃取释放出珠子中新生的RNA。同时，含有多腺苷酸化mRNA的珠状上清液可以沉淀EtOH;从该材料中，mRNA可以通过寡核苷酸（dT）珠拉下法分离。多聚A+ mRNA在文库制备前被片段化。 （C） 使用模板切换逆转录酶分别从新生或成熟RNA生成cDNA，随后连接5'和3'接头，引入N₇ UMI和条形码（见 图2，CoSTseq 的详细信息）。注意，DMS-MaPseq 和 CoSTseq 逆转录步骤将使用不同的异二链适配器，其突出部分与 CoSTseq 中使用的生物素-NTP 互补，DMS-MaPseq 中使用的 N 个突出。用于扩增采用最小PCR周期以限制文库中的偏置，并采用尺寸选择以去除适配器二聚体。 请点击此处查看该图的放大版本。

Protocol

注意：开始前，请确保表1中列出的所有缓冲区都已准备好。所有试剂应在无核酸酶水中制备。在使用非分子生物学级化学品/试剂制备缓冲液时，建议对缓冲液进行过滤灭菌。对于第1至第4部分，请提前准备以下内容：

1. 材料和试剂的制备

1. 至少提前一天准备10%萨科基（v/v）溶液，以便有足够时间完全溶解。用0.22微米过滤器对均匀溶液进行过滤灭菌。实验当天，用10%的萨科西尔制成0.5%的萨科西尔溶液，然后冰敷保存直到使用。
2. 将超速离心机预冷至4°C。 在抽烟柜内，将热混合器设为30°C，预热2.5倍结构探针缓冲液。该热混合器将用于后续的DMS处理。
3. 在抽烟柜内，将加热块设为65°C，并每次反应加热650微升酸性酚（氯仿）以提取RNA。
4. 将DTT与2.5倍转录缓冲液混合至最终浓度2 mM。在DMS处理后，准备并预冷淬火和洗涤溶液，立即使用（见表1）。
5. 在提取RNA前将40微升20% SDS注入管内进行酵母溶解。准备100 mM氯化锌（ZnCl2）溶液，并在使用前进行过滤消毒。
6. 生成缺失、耗竭或敲入酵母菌株，这些菌株可能用于解决关于新生RNA碱基配对与野生型酵母菌株对比的具体研究问题。每次新鲜复活菌株时，都要用合适的酵母琼脂板（YPD、滴水板或抗生素板）划线。在实验开始前一天，从单个菌落开始液体培养。有关酵母菌株生长和作的更多指导，请参阅Schärfen等人，2025年。

2. 酵母细胞用于CoSTseq的制备

1. 建立预培养 ：在 50毫升YPAD培养基中培养酿酒酵母菌株BY4741，直到细胞达到中间对数阶段（光学密度（OD，600 nm = 0.6），在30°C下摇晃，频率为200转/分钟。如有必要，将培养物稀释至OD 0.2-0.3，并让酵母达到0.6 OD。
2. 酵母采集：收集并以2500 克 在预冷离心机（4摄氏度）中旋转1.8 OD（~3 mL）酵母菌株3分钟。将上清液倒入废物容器中。通过重新悬浮10毫升冷磷缓冲盐水（PBS）清洗沉淀。再次以2500 x g 在4°C下旋转3分钟。 处理掉上清液，并将酵母颗粒冰敷保存。
3. 酵母细胞的渗透化：小心地将酵母沉淀液重新浸泡在10毫升冷的0.5%萨科基中。使用P1000移液器重新浮出细胞，避免产生气泡。在冰上孵育20分钟以促进渗透。将渗透的酵母细胞以400 x g 在4°C下沉浸5分钟。 将渗透化的酵母细胞重新悬浮在100微升无核酸酶水中。

注意：虽然DMS标记不要求细胞壁渗透，但核运行反应需要生物素化核苷酸通过才能到达转录位点。这通过萨科西尔处理实现，该处理使酵母细胞壁及其核膜都具有渗透性。此外，萨科硅处理通过防止新的转录起始事件和剥离Pol II和染色质^11,12的负延长因子，促进了持续检测。温和地处理样本并保持低离心速度（400 x g），以防止细胞破裂并促进生物素成功掺入延长的初生转录本¹³。

3. 核运行和DMS探测

注意：生物素-NTP的核运行引入了立体障碍，使RNA极体在其活性位点停止，并为选择性富集新生RNA提供了生物素的控制。根据所需分辨率，核运行可能使用一个、两个或全部四个生物素化核糖核苷酸^9。为了降低成本，这里描述的工作流程仅使用一种生物素化核苷酸（即生物素CTP）。

1. 启动核缓冲反应
   1. 准备2.5倍转录缓冲液，配合新加入的5毫毫秒地面地面仪，并将2.5倍结构探测缓冲液预热至30°C（见 表1）。
   2. 在一个干净的2 mL管中，加入120 μL 2.5x转录缓冲液、3.75 μL 10 mM ATP、3.75 μL 10 mM GTP、3.75 μL 10 mM UTP、7.5 μL 1 mM Bio-CTP、15 μL 10% sarkosyl，并加46.25 μL无核酸酶水，体积达到200 μL。
   3. 将100微升细胞加入试管，放入设定在30°C的热混合器中培养2分钟，并以500转/分钟摇晃。
      注意：这一步时间非常紧迫。尽量限制样本数量以产生可靠的数据。为了保持一致，最佳实践是错开采样时间。
2. DMS处理：培养完成后，迅速向管内同时加入200微升预热的2.5倍结构探针缓冲液和25微升DMS试剂。轻柔地分两脉冲旋转，继续在热混合器上以30°C孵化4分钟，同时以500转/分钟摇晃。采样间隔30秒以保持一致性。
   注意：DMS探测是一种瞬时反应，允许RNA碱基配对状态的¹⁴ 高时间分辨率。为防止持续的DMS修饰，必须及时用强还原剂β巰基乙醇淬灭DMS标记。此外，任何残留的DMS都会阻碍提取时RNA的恢复。离心前加入饱和水异戊醇可以去除细胞沉淀^中残留的不溶性DMS。这一步时间非常紧迫。使用有限样本以产生可靠数据至关重要。
   注意：DMS是一种高度有毒、无色的液体，带有轻微的洋葱味。与DMS合作时需采取极其谨慎的措施。直接接触和/或吸入蒸汽可能导致眼睛、口腔和呼吸道坏死，包括器官严重损伤。请佩戴护目镜、实验服和合适的手套。尽可能戴双层手套，接触后或使用后立即更换手套。在排气罩下作DMS的步骤。使用专用的废弃物容器进行DMS处理。
3. 淬火与洗涤
   1. 如 表1 所述，提前准备停止和清洗缓冲液，并冰敷使用。通过添加1毫升停止缓冲液来阻止DMS甲基化。
   2. 将带有DMS标记的样品在预冷离心机中以3,500 x g 旋转5分钟。将废弃物丢弃到合适的废物容器中。
   3. 向沉淀中加入1毫升洗涤缓冲液并重新悬浮。重复步骤3.3.2。立即进行RNA提取。不要把酵母颗粒冷冻。
4. 酚氯仿提取
   1. 将DMS标记的酵母重新悬浮在600微升RNA裂解缓冲液中，然后将悬浮液转移到装有40微升20% SDS的管子中。在65°C下孵育30秒，摇晃速度为950转/分钟。
   2. 将650微升预热的酸性酚氯仿加入酵母裂解液中，继续在热混合器上加热2分钟，温度为65°C，摇晃速度为950转/分钟。让样品冰敷5分钟。
      注意：在此期间，将热块或热混合器切换到室温（RT）。
   3. 离心机在20,000 x g 下离心3分钟，RT。
   4. 将顶层移到新管子中，加入650微升氯仿。漩涡短暂出现。再次离心，并在新管内收集表层，内含700微升异丙醇。
   5. 倒置后混合，并在-20°C冷冻室中孵育30分钟，让RNA沉淀。在20,000 x g 离心机温度下，45分钟，温度为4°C。 丢弃上清液。用750微升75%乙醇（EtOH）清洗沉淀。
      注意：这是协议中的一个停顿/暂停点。样品可在75%乙醇乙醇中，在-80°C下过夜。
   6. 在20,000 x g 下旋转3分钟，然后丢弃上清液。将RNA沉淀风干，并溶解在81微升无核酸酶水中。使用波长为260 nm的分光光度计定量RNA产率。施加1微升上述悬浮液进行测量。如有需要，稀释RNA样本。进入下一步时，应至少有80微克RNA总量。
      注意：如有必要，DMS标记RNA可在-80°C下保存长达2周。

4. 新生RNA（CoSTseq）

注意：从酚类萃取中获得的总RNA包括DMS标记的成熟RNA，以及来自三种聚合酶的DMS标记生物素化新生RNA。为了从总RNA中纯化新生RNA，以下步骤将使用链球亲和素珠来富集生物素化的初生RNA。由于生物素对链霉亲和力强（K_d = ^10-14 - ^10-15 M），需连续两次RNA试剂萃取（见材料表）以洗脱链霉亲和素珠上的RNA。注意，酵母RNA中新生RNA不到1%，具体取决于生长条件¹⁶。

1. 生物素下拉
   1. 链亲亲胺磁珠的制备
      1. 按照表1 所示，准备预洗缓冲液A和预洗缓冲液B进行配方。通过涡旋均匀化链滴亲和素磁珠。每样品中均含有80微克RNA的均质磁珠，共获得44微升。
         注意：通过将体积乘以采样数来扩大规模。
      2. 将磁珠放在磁性机架上，取出储存溶液。将磁珠重新悬浮在1毫升预洗缓冲液A中。
      3. 在室温下孵育2分钟。磁化并去除上清液。重复洗涤。用1毫升预洗缓冲液B洗涤1次。磁化并去除上清液，然后迅速进入结合和清洗步骤。
   2. 装订与洗涤
      1. 准备2x结合缓冲液、1x结合缓冲液、高盐和低盐洗涤缓冲液，如 表1所示。
      2. 通过加入两倍原始体积（88微升）的2倍结合缓冲液，重新悬浮预洗的珠子。将80微升珠转移到无菌的1.5毫升管内，内含80微升生物素化RNA样本。
      3. 将珠状样品混合物在室温下旋转20分钟。通过磁性阶段收集含有成熟RNA的流经RNA（进入沉淀步骤）。
      4. 用500微升高盐缓冲液冲洗珠状RNA复合物两次。先用500微升1x结合液冲洗一次，然后用500微升低盐缓冲液冲洗一次。
2. 通过RNA试剂提取洗脱
   1. 预热热搅拌器至60°C。 冷却一个能达到20,000 x g 到4 °C速度的离心机。
   2. 向初生RNA复合物中加入300微升RNA试剂（见材料表），并重新休眠。在热搅拌器上孵育5分钟，温度设定在60°C。
   3. 加入60微升氯仿，涡旋，在RT下孵育3分钟。在预冷离心机中以14,000 x g 旋转5分钟。
   4. 将上层水相移至新的收集管（~180微升）。丢弃有机相，留下珠子和剩余的水相。
   5. 重复提取，以获得收集管中360微升水相的最终体积。
   6. 向收集管中加入360微升氯仿，并短暂地进行漩涡处理。在预冷离心机中以14,000 x g 旋转5分钟。
   7. 将表层（约350微升）转移到新管子中。通过加入900微升绝对乙醇和1微升共沉淀剂来沉淀RNA。
   8. 短暂产生涡旋，使降水在-20°C下持续20分钟，或在夜间-80°C。
   9. 在预冷离心机中，以20,000 x g 离心机20分钟。小心地丢弃上清液。
   10. 用750微升75%乙醇溶液清洗沉淀，然后以20,000 x g 冷离心5分钟。
   11. 将颗粒晾干10分钟，去除残留的乙醇。将RNA沉淀溶解在3.75微升氢_2氧中。
       注意：对洗脱RNA进行点印迹，随后用链霉亲和蛋白HRP结合物探测，是评估生物素下拉效果最有效的方法。然而，这种方法消耗大量样本材料，导致材料不足以制备文库。
3. 上清液沉淀
   1. 通过加入2.5-3体积的乙醇沉淀含有成熟RNA的上清液。降水温度为-20°C，持续1小时。
   2. 在预冷离心机中，以20,000 x g旋转45分钟。小心抽取上清液。
   3. 用0.5毫升75%乙醇醇溶液清洗RNA沉淀。将沉淀干燥并溶解于50微升无核酸酶水中。将管子置于65°C的加热块上，以促进RNA沉淀的溶解。
   4. 后续步骤使用分光光度计测量RNA浓度。

5. 成熟RNA（DMS-MaPseq）

1. Poly A选拔
   注意：多腺苷酸化成熟RNA通过寡核苷酸（dT）珠状亲和力捕捉纯化。该协议优化为使用Dynabeads mRNA DIRECT纯化套件（见 材料表）。作为初步制备，预热1毫升无核酸酶水至80°C进行洗脱，并将热块设为70°C。
   1. 为聚氨酯A拉下作用的RNA制备：转移50微克沉淀RNA，并用无核酸酶水将其提升至最终体积300微升。将RNA加热至70°C2分钟，破坏二级结构，并立即放入冰块。将RNA与300微升裂解/结合缓冲液混合，短暂地进行漩涡处理。
   2. 磁珠的制备：通过旋转使磁珠悬浮至少30秒。将每个样品100微升的悬浮珠转移到无菌的1.5毫升管上。磁化以丢弃存储缓冲区。将磁珠浸泡在等量的溶解/结合缓冲液中，磁化后丢弃上清液。
   3. 装订与洗涤
      1. 将100微升预洗珠子加入600微升的样品RNA中。在室温下连续旋转5分钟。
      2. 将珠子放在磁性架上收集，并丢弃流珠。用600微升洗涤缓冲液A清洗微珠。用移液器搅拌。
      3. 再次收集珠子，丢弃洗涤剂。用300微升洗涤缓冲液B清洗微珠。移液器混合。
      4. 再次收集珠子，丢弃洗涤剂。将珠子与90微升温水（80°C）混合，加入90微升裂解/结合缓冲液以实现结合。重复步骤5.1.3.1-5.1.3.3。
   4. 洗脱：将珠子重新悬浮于30微升温水（80°C）无核酸酶水中。在75°C至80°C下孵育2分钟。将珠子快速施加磁场，将洗脱液收集到无RNase的管中。重复洗脱过程，收集洗脱后的RNA。
2. 破碎化
   注意：mRNA的断片可以通过酶促或化学方式实现。这里使用氯化锌和加热进行碎裂。与需要特定序列或结构元素的酶不同，锌离子作为路易斯酸激活2'氧（亲核剂），切断磷酸二酯骨架。这导致产物RNA链¹⁷上形成5' OH和2'，3'环磷酸酯。
   1. 预热热循环器时，阀体温度设为94°C，盖子温度设为105°C。 将54微升洗脱的mRNA放入PCR管中。
   2. 加入6微升100 mM氯化锌溶液（最终浓度10 mM），涡旋2秒，立即在预热热循环器上以94°C培养55秒。
   3. 培养结束后，用6.6微升0.5 M EDTA（最终浓度50 mM）灭绝碎裂反应，上下移液器混合，然后迅速将试管冰敷。将内容物转移到无菌的1.5毫升管中。
   4. 加入150微升异丙醇、15微升3M醋酸钠、pH值5.2和1微升共沉淀剂，允许沉淀片段mRNA。
   5. 置于-20°C下30分钟。在预冷离心机中以20,000 x g 旋转45分钟。用75%乙醇溶液清洗沉淀，并溶解在15微升无核酸酶水中。
3. PNK治疗
   注意：与ZnCl₂ 的化学断裂会产生不适合连接¹⁷的5'和3'端。因此，在化学断裂后，RNA会接受多核苷酸激酶（PNK）处理，磷酸化5' OH，去磷酸化3'磷酸端，然后这些末端可连接至接头¹⁸。
   1. 添加1微升核糖核酸酶抑制剂、2微升10xPNK缓冲液和2微升T4 PNK。在37°C下孵育60分钟。通过添加30微升无核酸酶水、50微升RNA结合缓冲液和50微升乙醇来停止反应。
   2. 使用基于自旋柱的RNA纯化方法去除污染物并浓缩RNA。这可以通过使用市面上可获得的试剂盒（如RNA净化与浓缩试剂试剂盒，详见 材料表）来实现。简而言之，将两体积的RNA结合缓冲液与1体积的样品混合，将等量的该混合物与100%乙醇混合，并用新的采集管装入自旋柱。旋转这个采样，丢弃流通。用700微升RNA洗涤缓冲液清洗离心柱，再用400微升RNA洗涤缓冲液清洗一次。抛弃流畅。旋转空柱1分钟，确保洗涤缓冲液完全清除。
   3. 将RNA用10微升温的无核酸酶水洗脱。
      注意：在10,000至16,000 g x RT压力下完成所有离心步骤，持续30秒。

6. 模板切换逆转录反应

注意：生物素下调（步骤4.2）和PNK处理后片段化mRNA（步骤5.3）需进行以下文库制备步骤（见 图1 和 图2）。简而言之，将准备一种合成RNA模板/DNA引物启动双链（R2 RNA/DNA异二链适配器），用于进行模板切换。该异二链提供了一条短互补序列，使逆转录酶（RT）能够切换模板以切换链，即RT将RNA链切换到DNA引物，从而实现RNA与接头序列的无缝cDNA合成。这里使用的是经过测试和优化的Induro逆转录酶。其他模板切换逆转录酶也可用于CoSTseq文库的制备，但需要用户进行优化。

1. DNA/RNA异双链接头序列
   注意：用于DMS-MaPseq样本逆转录的DNA/RNA异双链适配器与Xu等人7中列出的适配器^相同，并由Schärfen等人引用。
   1. 对于用于CoSTseq样本逆转录的DNA/RNA异双链适配器，请使用悬垂区域带有“G”的适配器。这将使G能够在RNA的3'端捕获生物素C。如果使用不同的生物素化NTP，则编辑异二链DNA引物，使其突出的配对核苷酸为适当（见 表2）。
   2. 对于DMS-MaPseq适配器，确保有一个N个悬挂，因为分片后3'端是随机的。关于以下图书馆准备步骤的概述，请见 图2。
2. 用于模板交换的DNA/RNA杂交制备：在由10 mM Tris-HCl、pH 7.5和1 mM EDTA组成的缓冲液中制备1 μM R2 RNA和R2R DNA引物。将引子混合物在82°C下孵育2分钟，然后以0.1°C/s的速度冷却至25°C。将混合物分成一块，冷冻保存以备后用。
3. 模板切换逆转录
   1. 加入以下试剂并在室温下培养30分钟：2微升5x反应缓冲液，1微升1微升DNA/RNA异二链（CoSTseq样本使用含单G悬垂的杂二链样品;DMS-MaPseq样本使用含随机N上悬的杂二链样品），0.5微升酶，0.5微升RNase抑制剂，3.75微升RNA样品（或加水达到7.75微升总体积）。
   2. 将该混合物（不含dNTPs）在RT下孵育30分钟。然后将1.25微升10 mM dNTPs加入反应，并在热循环器中应用以下循环条件：25°C10分钟，42°C10分钟，50°C10分钟，55°C10分钟，60°C30分钟，65°C20分钟，75°C15分钟。
   3. 加入1微升RNase H，在37°C下培养20分钟。使用基于柱的DNA纯化方法纯化PCR反应，去除剩余引物、核苷酸和酶。最终体积为20微升洗脱。

图2：CoSTseq文库准备的详细示意图。携带生物素化3'端的幼生RNA与含有G突出的模板切换适配器孵育，该G突出与生物素CTP互补。对于断裂成熟RNA（DMS-MaPseq），使用带有N-悬挂的转接器（见图1）。cDNA合成通过高度过程化的逆转录酶进行，如热稳定的II组内含子逆转录酶（TGIRT），随后通过RNase H处理以降解RNA链。随后，5' App DNA/RNA连接酶将N₇ UMI连接子中核糖腺苷酸化的5'端（rA^pp）与单链cDNA的3' OH连接起来。N₇ UMI适配器包含阻挡的3英尺端，防止适配器间的自连接。最后，PCR扩增使用包含重叠区域和5′突出的引物进行，这些引物为每个样品分配了独特的Illumina i5和i7条码。请点击此处查看该图的放大版本。

7. 5'接头连接用于制备最终cDNA文库以实现配对末端标签测序

1. 5英尺端适配器的准备
   1. 使用基于RNA连接酶的反应（例如Mth RNA连接酶，见 材料表）对5'端接头进行腺苷酸化处理，反应组分包括：8微升10×5'-DNA腺苷酸化反应缓冲液，8微升1 mM ATP，100微米R1R DNA（这是含有唯一分子标识符或UMI的TruSeq引子），8微升Mth RNA连接酶， 52微升无核酸酶水。
      注意：有关N₇ UMI适配器设计的详细信息，请参见 表2 和 图2。
   2. 在65°C下孵育该反应1小时，然后在85°C孵育5分钟。根据制造商说明，使用乙醇沉淀或基于硅膜自旋柱的DNA净化方法进行纯化，以分离cDNA。
   3. 对于EtOH沉淀，DNA可在-20°C（至少20分钟）下使用醋酸钠（pH 5.2），最终浓度为0.3 M，冷乙醇浓度为2x-2.5倍，浓度为95%-100%。在预冷（4°C）离心机中以最大速度离心15分钟，使用70%乙醇清洗沉淀颗粒，再离心，然后自然风干。将沉淀重新悬浮（如果使用旋转柱，则洗脱）沉淀于40微升无核酸酶水中。长期保存温度为-20°C。
2. 5'适配器连接
   1. 对于单个20微升反应体积，向10微升cDNA中加入以下组分：2微升10xNE缓冲液，2微升50 mM_MnCl2,2 微升5' AppDNA/RNA连接酶，4微升10微米（100 ng/μL）步骤7.1的腺苷化转接器。
   2. 在65°C下孵育1小时，然后在90°C孵育3分钟。 使用minElute PCR纯化试剂盒清洗反应，并以20微升无核酸酶水的最终体积洗脱。
3. 通过试点测试实现cDNA文库的最小PCR扩增
   1. 在进行之前，准备一份10微米的索引引信，包含唯一条形码。每个独特的CoSTseq或DMS-MaPseq样本应配有唯一的条码，以便顺畅的下游分析。参见 表2中的引子序列。正向和反向的单个含条码引子可以以1：1混合混合形式存储，作为条码预混合。
   2. 使用第7.2步的2微升PCR产物，加入2.5微升高保真PCR缓冲液（例如商用HiFi缓冲液）、0.375微升dNTP（10 mM）、0.75微升条码预混剂（或0.375微升独立i5和i7独特条码引子）、0.25微升高精度热启动DNA聚合酶（例如商业高保真热启动酶）， 6.625微升无核酸酶水。
   3. 在95°C下孵育该反应，重复[15秒98°C，30秒62°C，30秒72°C]，共23个循环，最后在72°C孵育1分钟。 使用1%琼脂糖凝胶，以确定最佳循环次数。
      注意：为了测试较低循环条件，可以在较低周期结束时（例如15或16周期结束）准备样本，并在琼脂糖凝胶上运行，以比较不同循环长度中琼脂糖胶上cDNA文库抹片的强度。
4. 文库扩增的最终PCR
   1. 使用第7.2步的18微升PCR产物，加入来自KAPA HiFi PCR套件的以下材料：22.5微升高保真PCR缓冲液，3.375微升dNTP（10 mM），6.75微升条码预混剂（或3.375微升独立i5和i7独特条码引物），2.25微升高精度热启动DNA聚合酶，以及59.625微升无核酸酶水。
   2. 在95°C孵育该反应，重复[15秒98°C，30秒62°C，30秒72°C]，完成步骤7.3中确定的循环次数。以72°C潜伏1分钟结束。
5. 尺寸选择
   1. 使用顺磁性珠纯化（如AMPure XP或同等品）对PCR产物进行粒径选择。使用体积为1.3倍的珠子（例如，50微升PCR反应使用65微升珠浆），并充分混合至均匀。让这些微珠在室温下结合样品10分钟。
      注意：此1：1.3的样品与珠子比例可去除引子适配器二聚体，确保保留的DNA片段不小于150碱基对，不大于800碱基对。
   2. 在不扰动珠子的情况下去除上清液，然后按照制造商的规范用80%乙醇清洗珠子。
   3. 在11微升中洗脱最终产物。在琼脂糖凝胶上运行1微升以验证文库。提交最终产品进行测序。

8. 数据分析

注意：完整的CoSTseq包和分析代码可在GitHub（https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq 年）获取，分析工作流程如图3所示。该流水线设计用于处理CoSTseq和DMS-MaPseq测序数据。CoSTseq 使用 Snakemake，一种生物信息学工作流程，通过优化可用 CPU 核心数¹⁹ 来轻松并行化分析。工作流程由Snakefile定义，Snakefile包含一套规则，确定将要执行的分析内容。安装 GitHub 包后无需更改可用的 Snakefile 文件。

1. 调整配置文件（.yaml文件）中的正确路径，以匹配原始数据存储的位置。这些设置中应包含指向适配器序列及相关采样名称的路径。修改配置文件以运行Snakefile中定义的特定分析。
2. 要开始分析，请下载fastq.gz格式的原始配对末读段。使用fastp²⁰ 处理读段以修剪适配器序列，并对Phred评分至少20的读段进行质量过滤器。使用STAR²¹ 将这些读序列比对到参考基因组以生成BAM文件。
3. 作为进一步确认，请可视化在集成基因组查看器（IGV）浏览器中运行CoSTseq分析流程后生成的BAM文件。使用IGV时，BAM文件应易于解释，显示所有感兴趣基因部分的读段，表明读段代表新生RNA。如预期，成熟RNA读段在内含子区覆盖率应极低，因为这些读段预计来自成熟且很可能高效剪接的转录本。
4. 使用fastp输出（可在浏览器中打开的.html文件）来估算重读的百分比。注意，CoSTseq读段可能高度重复，凸显下一步的重要性。
5. 使用UMICollapse²²，将重复读段合并为具有相同UMI和比对的读段，从而仅保留唯一读段并减少PCR偏置。最终的文件应避免重复读段，采用BAM格式，其中与rRNA对齐的读段与非rRNA基因相关的读段将被区分开。
6. 对于模块化CoSTseq流水线的最后一个主要组件，使用自定义的Python实现来计算突变计数和每个核苷酸的读数覆盖率。描述该实现的函数可在 GitHub 的源代码中找到，Snakefile 详细说明了输入、输出、参数以及生成这些数据的函数，这些函数以 .pkl 格式存储。
   注意：CoSTseq分析流程还可进行多种其他分析，尽管参数可能需要针对个性化分析需求进行优化。一种适用于CoSTseq的有用方法是HDProbe，这是一个R软件包，支持全基因组突变率比较¹⁰。简而言之，HDProbe需要所有复制体的数据，并能系统地分类与对照组在突变率上的显著差异。还可以进行基于实验DMS反应性的结构预测等分析。这可以通过RNA结构包²³来实现。

图3：模块化CoSTseq分析流程的分析步骤及预期输出。 分析步骤，指示除了现成的CoSTseq分析流程外，推荐使用现有工具，并包含预期的输出文件和内容。 请点击此处查看该图的放大版本。

Results

本节展示了通过实施CoSTseq工作流程和分析所生成的实际结果，如本协议所述。首先，本节描述了在测序前后对成功图书馆准备进行质量评估后的预期结果。测序前，研究人员可使用测试PCR和TapeStation分析确认生物素富集后RNA的存在。这表明在CoSTseq文库制备过程中成功分离了新生RNA。测序后的数据质量评估，例如通过目视检查读段覆盖率，随后使用基于Python的定制分析，确保有足够且丰富的数据供后续分析使用。此阶段评估的一些关键特征包括内含子区域覆盖率、重复读段比例、每核苷酸测序深度以及平均读长。这些指标划定了数据集的分析边界，降低了过度解读结果的风险。其次，本节描述了几种潜在的分析方法。例如，DMS反应性谱也可以在特定基因区域内新生RNA和成熟RNA之间进行比较，前提是DMS-MaPseq与CoSTseq的直接应用。动态RNA二级结构可沿RNA POL以单核苷酸分辨率观察。此类分析对细胞RNA数量丰富的物种尤其有效，这些物种具有较大测序深度，如核糖体RNA。

Discussion

由于碱基配对的动力学速度快于合成速率24,25,26,27，RNA开始共转录折叠。我们目前对新生RNA折叠的了解来自对原核生物RNA的单分子研究、体外探测或计算机实验。在该协议中，呈现了CoSTseq的详细工作流程;该技术允许在体内检测新生转录本相对于酿酒酵母¹⁰中RNA聚合酶位置的共转录折叠。这里的协议概述了数据分析，重点关注质量控制步骤。

在应用CoSTseq及相关方法时，应遵循一般实验室安全措施，包括但不限于佩戴1-2副手套，尤其是在处理DMS等有害化学品时，以及穿实验服以保护用户并减少可能的RNA污染/降解风险。在处理RNA时，必须使用...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10米 ATP	Invitrogen	18330019
10mM 生物素-11-CTP	耶拿生物科学	NU-831-BIOX
10英里越野GTP	Invitrogen	18332015
10毫秒UTP	Invitrogen	18333013
10X NEBuffer 1	新英格兰生物实验室	B7001S	用于步骤7.2.1
10倍磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）	吉布科	70011-044
20% SDS	RPI	L23100-500
酸性酚：氯仿及nbsp;	安比恩	AM9722
AMPure XP珠用于尺寸选择	贝克曼·考尔特等;	A63880	用于步骤7.5.1中的尺寸选择
巴克托·佩普通	吉布科	211677
巴克托酵母提取物	吉布科	212750
比辛	西格玛·奥尔德里奇	B3876-100G
氯仿	西格玛·奥尔德里奇	319988
D-（+）-葡萄糖	西格玛·奥尔德里奇	G5767-500G
DIFCO 琼脂	BD DIFCO	214010
硫酸二甲酯	西格玛·奥尔德里奇	D186309-5ML
Dynabeads & Trade;MyOne 链替亲和芬 C1 颗粒 & nbsp;	Invitrogen	65001	用于4.1节生物素拉拔
Dynabeads & Trade;mRNA DIRECT™净化套件	Invitrogen	61011	用于第5.1节Poly A的选择
EDTA，pH 8,0.5M	西格玛·奥尔德里奇	03690-100ML
乙醇	西格玛·奥尔德里奇	E7023-500ML
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516	步骤4.2.7和5.2.4中使用的共沉淀剂
Induro® 逆转录酶	新英格兰生物实验室	M0681S	步骤6.3.1中使用的RT酶
异戊醇	西格玛·奥尔德里奇	W205710-1KG-K
异丙醇	JT-贝克	9084-05-01
KAPA HiFi HotStart PCR 套件及nbsp;	罗什	07958889001	7.3.2和7.4.1用于PCR反应的高保真DNA Pol
氯化镁	西格玛·奥尔德里奇	SLCM2154
MinElute PCR纯化套件	奇根	28004	用于第6.3.3步和7.2.2步的DNA清理
Mth RNA 连结酶	新英格兰生物实验室	M2611A
Oligo 清洁与集中炉	Zymo研究	D4060	建议在7.1.2步中进行DNA寡核酸清理
醋酸钾	西格玛·奥尔德里奇	236497-500G
氯化钾	JT·贝克	3040-01
氢氧化钾	前卫	6984-04-01
RNA清洁与5号选光机	Zymo研究	R1014	PNK治疗后第5.3.2步使用的RNA清理套件
RNaseOUT™重组核糖核酸酶抑制剂	赛莫飞世尔科学	10777019	PNK治疗步骤5.3.1中使用的RNase抑制剂
萨科西尔	IBI科学	IB07080
醋酸钠	优质生物	351-035-721
氯化钠	西格玛·奥尔德里奇	S5150-1L
氢氧化钠	马克龙	7708-10
SUPERase·In™RNase抑制剂（20 U/μL)	赛莫飞世尔科学	AM2696	步骤6.3.1中使用的RNase抑制剂
T4多核苷酸激酶	新英格兰生物实验室	M0201S
5英尺的热稳定性应用DNA/RNA连结酶	新英格兰生物实验室	M0319L
三盐酸，pH 7.4,1M	热力科学	J60202。K2
特里顿 X-100	TEKNOVA	T1105
TRIzol™试剂	Invitrogen	15596-026	关于第4.2节的初生RNA洗脱;在第4节中也称为“RNA试剂”
β-巰基乙醇	西格玛·奥尔德里奇	M6250-1L