新型大鼠重度脑静脉窦血栓形成模型的建立：结合半结扎、氯化铁与凝血酶的方法

摘要

通过半结扎联合氯化铁和凝血酶构建的新型大鼠重度脑静脉窦血栓形成（CVST）模型，能够更有效地模拟人类重度CVST的病理生理机制。

摘要

脑静脉窦血栓形成（CVST）是一种独特的卒中类型，主要影响年轻人，尤其是孕妇。大约60%的CVST患者会发展为静脉性脑梗死或出血，这种情况被定义为重症CVST。目前，国内外已采用多种方法在动物模型中诱导CVST。然而，这些模型未能充分复制重症CVST背后的病理生理机制，从而限制了对该疾病的基础研究。通过部分结扎联合氯化铁和凝血酶处理，可建立一种新型的大鼠重症CVST模型。部分结扎的效果通过灌注散斑成像仪（PSI）在结扎上矢状窦（SSS）前后测量感兴趣区域（ROI）的脑血流量（CBF）来确认。SSS的部分结扎可导致静脉窦内血液淤滞。在SSS表面局部应用氯化铁可引起内皮损伤，而将凝血酶直接注射入窦腔则可产生局部高凝状态。该方法有效模拟了血栓形成的三个关键要素：血流淤滞、内皮损伤和高凝状态。所建立的模型表现出显著的血栓负荷，并同时累及多个静脉窦。所形成的血栓至少在1周内保持稳定。2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色显示，该模型能够稳定地产生大范围的静脉性脑梗死，且病变可持续达7天。该模型甚至可诱发大鼠癫痫发作，这是以往模型无法实现的功能。通过伊文思蓝（EB）染色观察到血脑屏障的破坏。因此，通过部分结扎联合氯化铁与凝血酶给药建立的重症CVST模型，更准确地再现了人类重症CVST的病理生理进程，具有良好的稳定性和可靠性。

引言

脑静脉窦血栓形成（CVST）是一种独特的脑血管疾病，与动脉性卒中不同。该病在年轻个体中更为常见^1,2，尤其是在孕妇中³，近年来其发病率呈持续上升趋势。澳大利亚的一项流行病学研究表明，CVST的年发病率约为每百万人中13.0至15.7例⁴。在美国，CVST的发病率随年龄增长而上升，但女性的发病高峰年龄低于男性⁵。在2021年至2023年期间，美国每百万前往急诊科就诊的患者中有43例被诊断为CVST⁶。在临床实践中，多发性静脉窦血栓最为常见，约占所有病例的57.14%；其次为上矢状窦（SSS；16.19%）、横窦（11.43%）和乙状窦（8.57%）受累⁴。主要临床表现包括头痛，可能伴有癫痫发作、意识障碍和局灶性神经功能缺损症状^7,8,9。然而，这些表现缺乏特异性。约60%的CVST患者会发展为脑静脉梗死或出血，此类情况被归类为重症CVST^10,11。尽管CVST的治疗包括抗凝治疗和手术干预，但重症CVST的死亡率仍高达34.2%⁹。这一高死亡率可能源于重症CVST潜在的病理生理机制尚未完全阐明。因此，建立合适的重症CVST动物模型是研究其发病机制、病理生理进展及潜在治疗策略所必需的实验工具¹²。

目前，诱导CVST动物模型的方法大致可分为以下几类：永久性结扎^13,14、化学诱导^15,16,17、介入方法^18,19、自体移植物植入^20,21,22以及双极电凝法^23,24。以往动物模型所诱导的血栓持续时间较短，且无法同时诱导多个静脉窦血栓及大范围静脉性脑梗死。因此，建立一种累及多个静脉窦的重度CVST模型已成为迫切需求。采用半结扎联合氯化铁与凝血酶的方法，可建立一种新型的大鼠重度CVST模型。此外，该新型重度CVST模型通过静脉窦血栓负荷、静脉性脑梗死以及血脑屏障破坏这三个关键方面，更准确地模拟了人类重度CVST的病理生理过程。该模型适用于重度CVST的病理生理机制及治疗策略研究。这一新型大鼠模型未来可用于深入探究重度CVST的病理生理机制。

方案

实验方案已获得中国北京首都医科大学动物实验与实验动物福利委员会（AEEI-2020-119）的批准，并严格按照该机构动物护理与使用委员会的相关规定执行。

1. 动物准备

1. 将体重约为300 ± 10 g的健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分配至实验组或假手术组。所有动物均在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，并可自由获取食物和水。 随意摄取.

2. PSI 的应用

1. 使用PSI持续监测大鼠上矢状窦（SSS）在建模过程中脑血流（CBF）的变化。选择SSS内一个固定的圆形区域作为感兴趣区域（ROI）。通过监测手术期间ROI内CBF的变化，判断半结扎操作的完成情况以及血栓诱导是否成功。

3. 建立重度CVST大鼠模型

1. 使用5%安氟醚通过麻醉面罩吸入麻醉，混合气体由70%氧化亚氮和30%氧气组成。在整个手术过程中维持安氟醚浓度在1%–2%之间。将麻醉后的大鼠置于俯卧位，并使用立体定位仪固定头部于正中位置。在整个手术过程中，使用恒温加热垫维持大鼠体温在37 ± 0.5 °C。
2. 沿大鼠颅部正中线做一条1.5 cm的纵向切口，分离皮下组织以暴露颅骨。
3. 在显微镜下，使用高速牙科钻在前囟与后囟之间制作一个纵向颅窗（10 × 4 mm）。暴露上矢状窦（SSS）及双侧大脑皮层，同时保持硬脑膜的完整性。在颅骨钻孔过程中，持续用生理盐水冷却钻头，以防止硬脑膜和皮层受到热损伤。
4. 暴露上矢状窦后，使用PSI评估SSS感兴趣区域（ROI）的脑血流（CBF），并记录相应数据。在显微镜下使用8-0聚酰胺缝线对SSS进行头端和尾端的半结扎。
   注意：结扎SSS时力度应适中，不可过大，否则无法实现半结扎效果。理想情况下应一次性连续完成结扎操作。反复尝试结扎可能导致SSS穿孔，从而影响模型制备的成功率。
5. 使用PSI评估位于SSS结扎段的感兴趣区域（ROI）的脑血流，确认脑血流已下降至半结扎前约50%的水平。系统性记录结果。
6. 在避光条件下，将一段7 mm长的3-0丝线浸入40%氯化铁溶液中，覆盖于SSS结扎部位表面，持续5分钟。移除丝线后用生理盐水冲洗术区。
7. 使用微量注射器在1分钟内向结扎段的窦腔内注射0.1 mL凝血酶溶液（500 U/mL）。连续重复注射两次，总凝血酶剂量为150 U。凝血酶反流至硬膜外腔不会影响血栓形成效果。
   1. 为便于将凝血酶注入SSS，可在插入前轻微弯曲微量注射针头。此调整有助于更好地控制穿刺角度，防止针头意外穿透SSS。
8. 注射凝血酶后，再次使用PSI评估ROI的脑血流。确保结果显示脑血流较半结扎后显著下降，表明血栓形成成功。系统性记录数据以供后续分析。
9. 用骨蜡封闭颅窗，随后缝合切口。术后每只大鼠皮下注射酮洛芬（5 mg/kg）以缓解术后疼痛。
10. 假手术组仅实施开颅手术，不进行任何其他手术干预。

4. 静脉窦血栓负荷与 脑梗死

1. 在建模后1天、2天和7天三个时间点评估静脉窦血栓形成的负担。在不同时间点处死大鼠，并用生理盐水进行心脏灌注。
2. 实施开颅手术，直观评估静脉窦血栓累及范围。分离血栓并进行定量分析。切除脑组织，将其切成2 mm厚的冠状切片。
3. 将切片浸入2% TTC溶液中，在37 °C水浴中孵育20分钟以促进染色。随后，肉眼评估脑静脉梗死情况，并使用ImageJ软件测量梗死体积，用于后续统计分析。
   梗死体积 = 梗死面积（平方毫米）× 厚度 [2 mm]

5. 血脑屏障（BBB）通透性的破坏

1. 术后第二天，从模型组和假手术组中随机选取大鼠，通过尾静脉注射2%伊文思蓝（Evans blue, EB）。
2. 成功注射2小时后，处死大鼠，经左心室用磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，取脑组织并切成2 mm厚的脑片，以评估伊文思蓝渗透程度。

6. 统计学分析

1. 使用 SPSS 17.0 软件进行统计分析。计量数据以均值 ± 标准差表示。组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）或独立样本 t 检验。
2. 对于同一组内多个时间点测量的连续变量分析，采用重复测量方差分析（ANOVA）评估不同时间点间的组间差异。以 p 值小于 0.05 为具有统计学意义。

结果

建模过程
图1A 显示了大鼠的海绵窦（SSS），箭头所示位置。对 SSS 的头端和尾端进行半结扎（图1B），随后将浸有氯化铁的线置于结扎区域表面（图1C）。接着向结扎节段内注射凝血酶以诱导血栓形成。箭头所指的注射凝血酶部位已变为黑色（图1D）。图1E-H 中的白色圆圈表示感兴趣区域（ROI）。在 图1E 中，暴露 SSS 后，ROI 内可见强烈的红色血流信号。半结扎后（图1F），该区域的血流信号明显减弱。在 图1G 中，应用氯化铁浸渍线后，红色血流信号进一步减弱。值得注意的是，在注射凝血酶后...

讨论

通过半结扎联合氯化铁和凝血酶构建的一种新型大鼠严重CVST模型，不仅能够模拟血液瘀滞和内皮损伤，还能模拟血液高凝状态，即模拟了血栓形成的三大要素²⁵。更令人振奋的是，采用该方法建立的大鼠模型能够表现出癫痫发作。癫痫发作是CVST患者中一种显著的临床表现，在约12%至31.9%的病例中出现。值得注意的是，伴有皮质静脉血栓和静脉性脑梗死的严重CVST患者发生癫痫发作的风险更高²⁶。因此，该模型更贴近人类CVST的病理生理机制。

在涉及结扎SSS并结合凝血酶注射的模型中，采用Li等描述的方法。¹⁴被认为具有高度代表性。该方法通过永久结扎上矢状窦（SSS）的前段和后段，随后进行窦内凝血酶注射以及短暂的双侧颈动脉阻断，从而诱导 SSS 血栓形成。该模型有效复制了脑静脉窦血栓形成（CVST）的关键病理生理特征，包括血液淤滞和高凝状态，并能够产生皮质静脉血栓及相关的静脉性梗死。然而，由于静脉窦结扎是永久性的，其在评估潜在治疗干预措施方面的适用性受到限制。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	Sigma-Aldrich
40% 氯化铁	天津市致远化学试剂有限公司，中国
伊文思蓝	Sigma-Aldrich
加热垫	Harvard Apparatus，霍尔斯特德，马萨诸塞州，美国	50-7061-f,
高速牙科钻	Saeshin，釜山，韩国	Strong-207B
激光散斑血流仪	PeriCam PSI 系统，瑞典
显微镜	卡尔·蔡司公司，柏林，德国
聚酰胺缝合线	宁波成和微器械厂，中国
立体定位仪	David Kopf 仪器公司，图云加，加利福尼亚州，美国
凝血酶	长春雷允上制药有限公司，中国