新型大鼠重度脑静脉窦血栓形成模型的建立：结合半结扎、氯化铁与凝血酶的方法

摘要

通过半结扎联合氯化铁和凝血酶构建的新型大鼠重度脑静脉窦血栓形成（CVST）模型，能够更有效地模拟人类重度CVST的病理生理机制。

摘要

脑静脉窦血栓形成（CVST）是一种独特的卒中类型，主要影响年轻人，尤其是孕妇。大约60%的CVST患者会发展为静脉性脑梗死或出血，这种情况被定义为重症CVST。目前，国内外已采用多种方法在动物模型中诱导CVST。然而，这些模型未能充分复制重症CVST背后的病理生理机制，从而限制了对该疾病的基础研究。通过部分结扎联合氯化铁和凝血酶处理，可建立一种新型的大鼠重症CVST模型。部分结扎的效果通过灌注散斑成像仪（PSI）在结扎上矢状窦（SSS）前后测量感兴趣区域（ROI）的脑血流量（CBF）来确认。SSS的部分结扎可导致静脉窦内血液淤滞。在SSS表面局部应用氯化铁可引起内皮损伤，而将凝血酶直接注射入窦腔则可产生局部高凝状态。该方法有效模拟了血栓形成的三个关键要素：血流淤滞、内皮损伤和高凝状态。所建立的模型表现出显著的血栓负荷，并同时累及多个静脉窦。所形成的血栓至少在1周内保持稳定。2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色显示，该模型能够稳定地产生大范围的静脉性脑梗死，且病变可持续达7天。该模型甚至可诱发大鼠癫痫发作，这是以往模型无法实现的功能。通过伊文思蓝（EB）染色观察到血脑屏障的破坏。因此，通过部分结扎联合氯化铁与凝血酶给药建立的重症CVST模型，更准确地再现了人类重症CVST的病理生理进程，具有良好的稳定性和可靠性。

引言

脑静脉窦血栓形成（CVST）是一种独特的脑血管疾病，与动脉性卒中不同。该病在年轻个体中更为常见^1,2，尤其是在孕妇中³，近年来其发病率呈持续上升趋势。澳大利亚的一项流行病学研究表明，CVST的年发病率约为每百万人中13.0至15.7例⁴。在美国，CVST的发病率随年龄增长而上升，但女性的发病高峰年龄低于男性⁵。在2021年至2023年期间，美国每百万前往急诊科就诊的患者中有43例被诊断为CVST⁶。在临床实践中，多发性静脉窦血栓最为常见，约占所有病例的57.14%；其次为上矢状窦（SSS；16.19%）、横窦（11.43%）和乙状窦（8.57%）受累⁴。主要临床表现包括头痛，可能伴有癫痫发作、意识障碍和局灶性神经功能缺损症状^7,8,9。然而，这些表现缺乏特异性。约60%的CVST患者会发展为脑静脉梗死或出血，此类情况被归类为重症CVST¹⁰

方案

实验方案已获得中国北京首都医科大学动物实验与实验动物福利委员会（AEEI-2020-119）的批准，并严格按照该机构动物护理与使用委员会的相关规定执行。

1. 动物准备

1. 将体重约为300 ± 10 g的健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分配至实验组或假手术组。所有动物均在12小时光照/12小时黑暗循环条件下饲养，并可自由获取食物和水。 随意摄取.

2. PSI 的应用

1. 使用PSI持续监测大鼠上矢状窦（SSS）在建模过程中脑血流（CBF）的变化。选择SSS内一个固定的圆形区域作为感兴趣区域（ROI）。通过监测手术期间ROI内CBF的变化，判断半结扎操作的完成情况以及血栓诱导是否成功。

3. 建立重度CVST大鼠模型

1. 使用5%安氟醚通过麻醉面罩吸入麻醉，混合气体由70%氧化亚氮和30%氧气组成。在整个手术过程中维持安氟醚浓度在1%–2%之间。将麻醉后的大鼠置于俯卧位，并使用立体定位仪固定头部于正中位置。在整个手术过程中，使用恒温加热垫维持大鼠体温在37 ± 0.5 °C。
2. 沿大鼠颅部正中线做一条1.5 cm的纵向....

结果

建模过程
图1A 显示了大鼠的海绵窦（SSS），箭头所示位置。对 SSS 的头端和尾端进行半结扎（图1B），随后将浸有氯化铁的线置于结扎区域表面（图1C）。接着向结扎节段内注射凝血酶以诱导血栓形成。箭头所指的注射凝血酶部位已变为黑色（图1D）。图1E-H 中的白色圆圈表示感兴趣区域（ROI）。在 图1E 中，暴露 SSS 后，ROI 内可见强烈的红色血流信号。半结扎后（图1F），该区域的血流信号明显减弱。在 图1G 中，应用氯化铁浸渍线后，红色血流信号进一步减弱。值得注意的是，在注射凝血酶后.......

讨论

通过半结扎联合氯化铁和凝血酶构建的一种新型大鼠严重CVST模型，不仅能够模拟血液瘀滞和内皮损伤，还能模拟血液高凝状态，即模拟了血栓形成的三大要素²⁵。更令人振奋的是，采用该方法建立的大鼠模型能够表现出癫痫发作。癫痫发作是CVST患者中一种显著的临床表现，在约12%至31.9%的病例中出现。值得注意的是，伴有皮质静脉血栓和静脉性脑梗死的严重CVST患者发生癫痫发作的风险更高²⁶。因此，该模型更贴近人类CVST的病理生理机制。

在涉及结扎SSS并结合凝血酶注射的模型中，采用Li等描述的方法。¹⁴被认为具有高度代表性。该方法通过永久结扎上矢状窦（SSS）的前段和后段，随后进行窦内凝血酶注射以及短暂的双侧颈动脉阻断，从而诱导 SSS 血栓形成。该模型有效复制了脑静脉窦血栓形成（CVST）的关键病理生理特征，包括血液淤滞和高凝状态，并能够产生皮质静脉血栓及相关的静脉性梗死。然而，由于静脉窦结扎是永久性的，其在评估潜在治疗干预措施方面的适用性受到限制。.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,3,5-三苯基氯化四氮唑	Sigma-Aldrich
40% 氯化铁	天津市致远化学试剂有限公司，中国
伊文思蓝	Sigma-Aldrich
加热垫	Harvard Apparatus，霍尔斯特德，马萨诸塞州，美国	50-7061-f,
高速牙科钻	Saeshin，釜山，韩国	Strong-207B
激光散斑血流仪	PeriCam PSI 系统，瑞典
显微镜	卡尔·蔡司公司，柏林，德国
聚酰胺缝合线	宁波成和微器械厂，中国
立体定位仪	David Kopf 仪器公司，图云加，加利福尼亚州，美国
凝血酶	长春雷允上制药有限公司，中国