利用紫外线固化树脂对合成生物相容性植入物进行冷冻切片，以增强免疫荧光分析

摘要

本研究提出了一种利用紫外线固化树脂稳定的冷冻切割方案，在保持抗原可及性的同时，保持植入物-组织界面的完整性，从而实现合成聚合物植入物的可靠、高分辨率免疫荧光分析。

摘要

合成生物相容性植入物的组织学评估面临重大技术挑战，因为传统组织处理方法与这些材料的物理化学性质不兼容。目前采用完整树脂嵌入的方法虽然结构保存良好，但严重影响表位可及性，从而限制了免疫组化应用，而这些应用对表征宿主免疫反应至关重要。相反，传统的石蜡嵌体对合成底物的附着力较差，限制了抗体的选择以进行全面免疫学分析。标准冷冻切片方案通过改善抗原保存来增强免疫组化相容性;然而，这些方法常导致植入物样本的结构完整性不足，影响形态评估和切片质量。为解决这些限制，开发了一种新型处理方案，结合了可紫外线固化树脂，在冷冻切割前选择性稳定植入组织构体。该方法采用可光聚合树脂提供机械支撑，同时保持表位可及性和抗原决定因子，而这些通常会被全树脂聚合所破坏。该方案能够在免疫荧光评估中实现高质量切片的可重复生成，且相较于标准冷冻切片实现了更优的结构保存，且没有限制传统树脂嵌入标本中抗体穿透性限制的广泛交联。该方法代表了合成植入物组织学处理的实用且经济的解决方案，增强了生物相容性评估的分析能力，并促进了植入-组织界面局部免疫反应的详细表征。

引言

免疫荧光显微镜是再生医学研究中一项重要的分析技术，利用荧光团结合抗体促进组织结构和细胞组成的可视化。该方法结合了免疫化学识别的分子特异性与荧光检测的灵敏性和多样性，使得对细胞在组织微环境中的靶点分布进行了详细观察。免疫荧光方法涵盖直接和间接标记策略，间接免疫荧光方案通过连接可见光和近红^外光谱的多种荧光团的二级抗体系统增强信号放大。该方法固有的通过光谱分离同时检测多靶点的能力，有助于对异质细胞群体及其在复杂组织微环境中的空间关系进行全面表型表征。

免疫荧光显微镜的技术能力超越了传统的蛋白质定位，涵盖定量分析应用，包括荧光强度测量、共定位分析以及空间分布评估，这些对于理解细胞功能和^{组织结构至关重要}。在植入物生物相容性研究的背景下，免疫荧光分析为宿主免疫反应提供了关键见解，包括异物反应、炎症级联反应以及决定植入物在细胞和^分子层面接受或排斥的组织整合过程。

免疫荧光方案的成功实施需要仔细考虑组织处理方法，既保持形态完整性，又保持荧光信号，并最小化背景自发荧光。传统的嵌入培养基选择取决于组织类型、后续分析需求以及特定抗原。对于合成材料和植入物，当前文献主要建议在切片过程中完全嵌入树脂以保持结构^稳定性。然而，由于需要专用的超微口刀和用于切割聚合树脂块的刀片，这种方法存在显著局限，这需要大量设备投资和技术专长。石蜡嵌入在为切片提供足够的结构支撑的同时，通过大量脱水、化学硬化以及有机溶剂渗透（可变性蛋白质和掩盖表位）在固定和加工过程中引入抗原决定因子的构象变化。石蜡加工还会产生固有的自发荧光干扰，影响信号检测和定量分析。这些变化需要抗原提取程序，通常包括热诱导表位提取（HIER）或蛋白水解诱导表位提取（PIER），以恢复抗体可及性⁶。尽管有这些干预措施，许多商业化抗体仍无法与石蜡嵌入标本兼容，且严苛的提取条件可能进一步影响荧光信号质量并引入光漂白伪影。

冷冻切片为免疫荧光应用提供了另一种处理方法。组织制备可采用两种冷冻保存方法。第一种方法是将新鲜组织样本直接浸入用液氮预冷的异戊烷浴中快速冷冻保存，温度降至–20°C以下，随后使用配备温控切割室的低温切片机切片。第二种方案在对甲醛（PFA）或福马林中进行短时间固定，随后通过分级蔗糖浸润进行冷冻保护，最后进行冷冻。冷冻保存过程形成刚性基质，既保持组织完整性，又保留了对抗体识别至关重要的天然蛋白构象。冷冻切片以最小化学修饰保持组织近天然^状态7，从而减少对严苛抗原提取程序的需求，并允许使用更广泛的原级抗体，包括因表位掩蔽或变性而与石蜡嵌入组织不兼容的抗体⁸。

冷冻切割工艺通常使用最佳切割温度（OCT）化合物，这是一种由聚乙烯醇和聚乙二醇组成的水溶性嵌体介质，在切片过程中提供结构支撑，同时保持透明并兼容荧光检测系统。OCT嵌入有助于生成厚度在5–15微米之间的薄且均匀的切片，具体取决于具体分析需求和^{组织特性。}在冷冻切片中保留天然蛋白构象，保持了对定量免疫荧光分析至关重要的最佳信噪比，同时保留完整的表位，从而允许使用更广泛的初级抗体，包括与石蜡包藏组织不相容的抗体⁸。

然而，冷冻组织切片存在独特的技术挑战，尤其是在处理具有与原生生物组织不同物理化学特性的合成植入材料时。在冷冻过程中，合成聚合物与生物组织界面之间的热膨胀差异可能导致局部机械应力，损害结构完整性并产生截面伪影¹⁰。此外，许多合成材料相较于冷冻生物组织本身的刚性，在切片过程中可能导致刀片挠曲，导致截面厚度不均，并对样品和切割设备造成损害。这些技术限制要求专门的处理协议，既能满足植入物样本的独特需求，又能保持冷冻切片在免疫荧光应用中的优势。

为解决这些限制，本研究开发了一种结合选择性紫外固化树脂稳定与受控低温切片参数的低温切片方案，实现高分辨率、多参数的植入组织构造免疫荧光分析。

方案

本研究遵循梅奥诊所机构动物护理与使用委员会（IACUC）的指导，批准编号A00003765-18-24。所有涉及合成生物相容植入物的手术均在无菌条件下进行，符合适当的生物安全规范。

1. 样品处理与低温保护

注意：只在化学排气柜内处理福马林，并佩戴适当的个人防护装备（PPE），因为福尔马林含有甲醛，这是一种强效刺激物、致敏剂和致癌物。

1. 将固定组织整合生物相容性植入物样本，浸泡在10%中性缓冲福马林中，在4°C下过夜，使用相对于组织体积至少10体积的固定剂，以确保完全浸入和充分穿透。这一有限固定期的目标是在保持组织形态的同时实现最小的交联。（关于议定书中使用的材料，请参见 材料表 。）
2. 将标本转移到15%蔗糖溶液中，以磷酸盐缓冲盐水（PBS）制备，在4°C温和搅拌下过夜孵育。确保蔗糖完全浸润，以组织下沉为例。
3. 将标本转移到PBS中30%蔗糖溶液中，进行第二次4°C隔夜培养。通过组织沉入容器底部确认完全平衡，表明蔗糖浸润和水分置换充足。
4. 准备1：1体积比例的30%蔗糖溶液和OCT化合物。在该过渡培养基中培养标本2小时，温度为4°C，然后转移到100% OCT培养1小时以达到完全平衡，组织呈现均匀不透明的外观。
5. 将样品小心地放置在充满新鲜OCT化合物的标准低温模具中，确保切片平面的最佳方向。保持植入体-组织界面，以便后续操作。用预冷镊子消除气泡。
6. 立即将填充的低温模具放置在干冰平台上，形成温差，促进从底部快速形成冰晶。监测10–15分钟直到完全固化，并由冷冻OCT化合物特有的不透明白色外观确认。将冷冻块转移到-80°C的储存室或直接进入低温室以便立即切片。

2. 低温器设置与初步切片

1. 保持低温恒温室温度控制在-15°C。使用集成数字监测验证温度，并在样品引入前过夜保持平衡。
2. 安装新的一次性叶片。根据制造商的规格，设定合成-生物材料切割的刀片角度。
3. 所需的切片厚度（50–100微米）通过控制面板上的厚度设置，通过方向键调整，并按Set键确认参数，将所需切片厚度编程到低温恒温器中。
4. 穿过嵌入的标本，达到对应植入物-组织界面的预定深度。监测切片表面的推进，以确定紫外线树脂应用的最佳平面，其特征是组织不透明度的细微变化和植入物-周边暴露的细微变化，当这些特征在连续修剪切片中保持一致时，深度得到确认。
   注意：到达关键界面后立即停止分段，以防止推进超出目标区域。

3. 紫外固化树脂应用

注意：在通风良好的环境中处理可UV固化树脂，同时佩戴适当的个人防护装备，保护眼睛和皮肤免受LED-UV固化光照射。这些树脂含有刺激物，可能导致皮肤和眼睛反应，LED-UV暴露可能导致紫外线引起的眼睛损伤。

1. 用剪刀将防腐胶剪成2–3毫米，超过植入物周长。用无菌产钳小心地从保护纸背中分离。
2. 在暴露的对剂膜表面滴注5–10微升紫外线固化树脂（见图1A）。通过进行初步测试应用，逐步分配树脂体积，并通过目视评估结果扩散，确保样品表面均匀覆盖，避免溢出或过度树脂积累，从而干扰切片。
3. 立即更换树脂填充的防腐剂衬底保护纸。用聚氨酯接缝滚轮（2英寸）按均匀压力重叠平行处理，然后垂直穿过，以获得薄且均匀的树脂层（见图1B）。
4. 小心撕下保护纸层，露出均匀分布的树脂膜。将树脂-防腐剂直接覆盖在暴露的植入物表面上，确保与植入物-组织界面的精确对齐（见图1C）。
5. 从植入物中心向外涂抹聚氨酯接缝滚轮，以消除气泡，确保树脂与合成及生物表面的密切接触（见图1D）。
6. 将405纳米波长的紫外线LED光源置于2–3厘米距离，直接对准植入物表面。暴露90秒以确保完全聚合，并通过触觉评估树脂硬度和非粘性特性进行验证（见图1E）。在紫外光光聚合前，将紫外线防护罩覆盖在低温恒温室窗户上，以保护操作员免受树脂固化过程中有害的紫外线暴露。

4. 剖面修复与滑套准备

1. 通过一次连续动作去除防腐剂，以防止树脂-组织界面的机械性破坏。通过在低温恒温器照明下检查暴露表面是否均匀树脂覆盖、组织边缘无浮动以及无可见的防腐剂残留，确认树脂完全附着。
2. 利用校准的切片机将标本切至预定的8微米厚度。监控每个切片厚度是否一致，是否有假象（压缩、撕裂、切片不完全）。将防滚板调整最佳位置以防止卷曲（见图1F）。
   注意：亲水、带正电的粘着玻璃玻片之所以被使用，是因为它们能更好地保留有挑战性试样，从而提高切片转移及后续加工过程中的粘附性。在分段转移前，逐张标注幻灯片。
3. 放置滑套胶面，确保在截面边缘首次接触，然后在整个区域逐步接触。确保紫外固化树脂表面附着在载玻片上，同时保持组织表面向上以便免疫荧光（见图1G）。
4. 轻轻按压切片组件以消除气泡。在低温静室灯光下确认正确定向，确认植入物-组织界面完整。

5. 储存与保存

1. 对于需要在72小时内处理的应用，将完成的玻片放入预先标记的存储箱中，温度为-20°C。
2. 使用80°C的环境，保存时间超过一周。

6. 免疫荧光染色方案

注意：使用适当的个人防护装备处理胃蛋白酶，因为它会刺激皮肤和呼吸道。

1. 从储存中取出载玻片，转移到湿度室中15–20分钟以实现室温平衡。
2. 连续进行三次2分钟PBS洗涤程序。
3. 抗原提取：
   1. 热诱导表位反复（HIER）方法：在微波安全容器中水平滑动，配以1倍靶标反复溶液。微波炉（1000瓦输出）高功率，持续15分钟，然后冷却至室温。
   2. 蛋白酶诱导表位提取法（PIER）：每切片施用100–150微升即用胃蛋白酶溶液。用临时塑料盖套覆盖，并在加湿舱中以37°C孵育10分钟。
4. 连续进行三次PBS洗涤（每次2分钟）。
5. 在PBS中涂抹含有0.1%皂苷和2.5%普通山羊血清的1毫升阻断液。在室温加湿箱中孵育30分钟。
6. 连续进行三次PBS洗涤（每次2分钟）。
7. 以最佳浓度应用100微升初级抗体溶液：
   1. 抗胶原蛋白IV兔多克隆剂，稀释比例为1：100。
   2. 抗Laminin兔子多克隆，稀释比例为1：500。
   3. 抗F4/80兔单克隆抗体，稀释比例为1：500。
8. 用临时塑料盖套覆盖，并在加湿箱中以4°C孵育一夜。
9. 进行三次PBS洗涤（每次2分钟）。
10. 以10 μg/mL浓度施加二级抗体。
    1. 驴抗兔IgG Alexa Fluor Plus 555
    2. 山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488
11. 在室内温度下、阴暗条件下孵育60分钟。
12. 可选小麦胚凝素（WGA）染色：
    1. 将WGA-Alexa Fluor 647以5 μg/mL 浓度在PBS中与2.5%正常山羊血清一起涂抹。
    2. 盖上盖子，在37°C下孵育30分钟。连续进行三次2分钟PBS洗涤程序。
13. 每段使用80微升硬定型安装介质，并加装核性反染剂。
14. 用盖子玻璃覆盖盖子，以消除气泡。
15. 让玻片在室温下水平固化2小时。
16. 在4°C下保存最长一周，以获得最佳成像质量。

7. 荧光显微镜与图像采集

1. 使用倒置荧光显微镜进行成像，配备厂商滤光片组：360/460 nm激发/发射，470/525 nm激发/发射，545/605 nm激发/发射，620/700 nm激发/发射。
2. 图像通过在显微镜软件的 滤光 菜单中选择每个荧光通道来捕捉。在曝光优化之前，通过选择 “调整黑平衡 ”来执行黑平衡程序，以确保每个通道的基线校正准确。然后通过打开 图像捕捉 窗口，启用 实时 模式，调整 曝光 和 光强 控制，直到达到高信噪比且无像素饱和来优化曝光参数。饱和度通过软件的 直方图 显示和 高亮饱和像素 工具进行监测。每个通道在图像采集前都独立调整。
3. 在制造商相邻田间10%的重叠空间中，进行自动化磁砖采集。在整个采集过程中保持自动对焦调整。

结果

剖面质量评估与优化
在8微米厚度的紫外树脂稳定和切片后，收集切片到胶粘载玻片上并评估质量控制。高质量切片显示形态完整，无显著裂纹或断裂伪影，组织结构连续，植入-组织界面保存完整（图2A）。表现出显著结构损伤，包括断裂或组织与树脂稳定植入物表面分离的切片，排除在进一步分析之外（见图2B）。值得注意的是，紫外线固化树脂的应用并未影响OCT块体，因为在整个块体全深范围内都能可靠获得均匀厚度的连续切片，表明树脂穿透和紫外线固化并未对切割质量产生不良影响。保留符合后续免疫荧光染色方案质量标准的切片。

不同标本类型的免疫荧光染色性能
免疫荧光染色已成功应用于多种标本类型，包括含植入物的小鼠皮下组织及仅有的分离植入物材料。简化的福尔马林固定方案（在4°C过夜）需要抗原回收程序，以恢复表位可及性，实现最佳抗体结合。抗原取回后有效应用了...

讨论

这种紫外线固化树脂稳定方法为含有合成材料的OCT嵌入组织样本提供了另一种冷断方法，这些样本在标准冷冻切片技术下难以处理。虽然市面上有多种粘着剂选项，如带电载玻片、组织粘结胶带及其他粘贴支撑，有助于防止组织切片或脆弱样本在搬运过程中脱落，但这些产品提供载玻片粘附，且在切割时植入物与组织界面未能提供所需的机械加固。此外，目前尚无可涂抹紫外线固化树脂，专门设计用于薄均匀地直接涂抹在生物样品上，以提升冷冻切割期间的结构稳定性。在此背景下，本文介绍的紫外固化树脂方案填补了方法学上的空白，通过提供有针对性机械支持的同时，保持需要冷冻处理抗体的表位可及性，从而实现对含有合成高分子成分样品的可靠切片¹¹。

若干程序性要素需要仔细注意才能成功实施。树脂选择必须优先考虑最小的自发荧光和适当的粘度，以在切片过程中保持结构支撑，同时避免脆性或固化不完全。该方案所选高粘度配方在多个荧光通道上显示出极小的背景干扰。截面厚度需要针对特定材料进行优化。在6–10微米厚度范围内的测试显示，8微米的结构...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5W 鹅颈紫外线灯 395及无短线;树脂固化时405纳米	亚马逊	UPC & lrm;603335835561
抗体 - 抗F4/80（单克隆抗体）	阿布卡姆	AB300421	1:500
抗体 - 胶原蛋白IV（多克隆）	阿布卡姆	AB6586	1:100
抗体——驴抗兔IgG AlexaFluor Plus 555	Invitrogen	A32794	10微克/毫升
抗体——山羊抗兔IgG AlexaFluor 488	Invitrogen	A-11008	10微克/毫升
抗体 - 层叠蛋白（多克隆抗体）	Invitrogen	PA1-16730	1:500
生物医学清除	Formlabs	FLBMCL01	生物相容性材料#1
BioMed 耐用	Formlabs	FLBMDU01	生物相容性材料#2
缓冲10%福马林	卡迪纳尔健康	C4320-101
BZ-X 滤波器 Cy5	钥匙	OP-87766	滤波器集
BZ-X 滤波器 DAPI	钥匙	OP-87762	滤波器集
BZ-X 滤波器 GFP	钥匙	OP-87763	滤波器集
BZ-X 滤波器 TRITC	钥匙	OP-87764	滤波器集
BZ-X800分析仪软件	钥匙	BZ-X800	集成软件
Fisherbrand Premium Coverglass 50 x 24毫米	费舍尔科学	12-544-14
Form4B 3D 打印机	FormLabs	F4B打印机
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MX35 超大切片刀	埃普雷迪亚	3053835
Parafilm M实验室胶片	副胶片	P7543-1EA
胃脯蛋白酶	西格玛	R2283-15ML
磷酸盐缓冲盐水pH 7.4	Sigma	P3813
计划Apo和lambda;40倍	钥匙	BZ-PA40	物镜
计划Apo和lambda;4X	钥匙	BZ-PA04	物镜
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皂苷	米利波尔	558255-100GM
污渍托	进口	M920-2
无菌硅胶片	本特克	PR72034-51N
靶标提取溶液，柠檬酸盐pH6	安捷伦	S236984-2
组织技术O.C.T化合物	樱花	4583
小麦胚芽凝集素 AlexaFluor 647	Invitrogen	W32466	5微克/毫升