使用紫外光固化树脂对合成生物相容性植入物进行冷冻切片以增强免疫荧光分析

摘要

本研究介绍了一种冷冻切片技术方案，该方案采用紫外光固化树脂稳定化方法，在保持植入物-组织界面完整性的同时保留抗原可及性，从而实现对合成聚合物植入物进行可靠且高分辨率的免疫荧光分析。

摘要

由于传统组织处理方法与这些材料的理化特性不相容，对合成性、生物相容性植入物进行组织学评估面临重大的技术挑战。目前采用完全树脂包埋的方法虽能提供足够的结构保存效果，但会严重损害表位的可及性，从而限制了用于表征宿主免疫反应所必需的免疫组织化学应用。相反，传统的石蜡包埋对合成基质的黏附性较差，并限制了抗体的选择，难以实现全面的免疫学分析。标准的冷冻切片方案通过改善抗原保存而提高了免疫组织化学的兼容性；然而，这些方法常导致含植入物样本的结构完整性不足，影响形态学评估和切片质量。为克服这些局限，本研究开发了一种新型处理方案，在冷冻切片前使用紫外光固化树脂对植入物-组织复合体进行选择性稳定。该方法采用光聚合树脂提供机械支撑，同时保留表位可及性和抗原决定簇——这些通常在完全树脂聚合过程中受到破坏。本方案能够稳定地制备出适用于免疫荧光分析的最佳厚度高质量切片，在结构保存方面优于标准冷冻切片，且避免了传统树脂包埋样本中因广泛交联而导致的抗体穿透受限问题。该方法为合成植入物的组织学处理提供了一种实用且成本效益高的解决方案，增强了生物相容性评估的分析能力，并有助于深入表征植入物-组织界面处的局部免疫反应。

引言

免疫荧光显微技术是再生医学研究中一项关键的分析方法，通过使用荧光素标记的抗体，可实现对组织结构和细胞组成的可视化观察。该方法结合了免疫化学识别的分子特异性与荧光检测的高灵敏度和多功能性，能够在组织微环境中详细观察特定细胞靶标的分布情况。免疫荧光技术包括直接和间接标记策略，其中间接免疫荧光方案利用与多种荧光素（覆盖可见光至近红外光谱范围）偶联的二抗系统，实现更强的信号放大¹。该方法通过光谱分离实现多靶标同时检测的固有优势，有助于对复杂组织微环境中的异质性细胞群体及其空间关系进行全面的表型表征²。

免疫荧光显微镜的技术能力已超越传统的蛋白质定位，拓展至多种定量分析应用，包括荧光强度测量、共定位分析以及对理解细胞功能和组织结构至关重要的空间分布评估³。在植入物生物相容性研究中，免疫荧光分析可提供关于宿主免疫反应的关键信息，包括异物反应、炎症级联反应以及决定植入物在细胞和分子水平上被接受或排斥的组织整合过程⁴。

成功实施免疫荧光实验方案需要仔细考虑组织处理方法，以在保持荧光信号并尽量减少背景自发荧光的同时，维持组织形态的完整性。传统包埋介质的选择取决于组织类型、后续分析需求以及特定目标抗原的性质。对于合成材料和植入物，现有文献主要推荐完全树....

方案

本研究严格按照梅奥诊所机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指南进行，批准编号为 A00003765-18-24。所有涉及合成生物相容性植入物的操作均在无菌条件下进行，并遵循适当的生物安全规程。

1. 样本处理与冷冻保护

注意：福尔马林含有甲醛，是一种强效刺激物、致敏剂和致癌物，因此必须在化学通风橱中操作，并穿戴适当的个人防护装备（PPE）。

1. 将组织整合的生物相容性合成植入物样本置于10%中性缓冲福尔马林中，在4°C下固定过夜，固定液体积至少为组织体积的10倍，以确保样本完全浸没并充分渗透。此有限固定时间的目的是在保持组织形态的同时实现最小程度的交联。（有关本方案所用材料，请参见材料表。）
2. 将样本转移至用磷酸盐缓冲液（PBS）配制的15%蔗糖溶液中，在4°C下轻轻振荡孵育过夜。通过观察组织沉降确认蔗糖完全渗透。
3. 将样本转移至PBS中的30%蔗糖溶液中，再次在4°C下孵育过夜。通过组织沉降至容器底部的现象确认达到充分平衡，表明蔗糖已充分渗透并完全置换出水分。
4. 按体积比1:1配制30%蔗糖溶液与OCT包埋剂的混合液。将样本在此过渡介质中于4°C孵育2小时，随后转移至100% OCT中孵育1小时，直至组织呈现均匀不透明外观，表明已完全平衡。
5. 将样本小心置于....

结果

切片质量评估与优化
在紫外光固化树脂稳定化处理并以8 µm厚度切片后，将切片收集至防脱载玻片上，并进行质量控制评估。高质量切片应呈现完整的形态结构，无明显裂纹或断裂伪影，组织架构连续，且植入物-组织界面保持完好（图2A）。若切片出现严重结构损伤，包括断裂或组织从树脂稳定的植入物表面分离，则排除于后续分析之外（图2B）。值得注意的是，紫外光固化树脂的应用并未影响OCT包埋块的质量，因为在整个包埋块的全深度范围内均能稳定获得厚度均一的连续切片，表明树脂渗透与紫外光固化过程未对切片质量产生不利影响。保留符合质量标准的切片，用于后续免疫荧光染色实验。

不同样本类型中的免疫荧光染色效果
免疫荧光染色在多种样本类型中均成功实现，包括含有植入物的小鼠皮下组织以及仅含分离植入物材料的样本。由于采用了简化的甲醛固定程序（4°C 过夜），需进行抗原修复以恢复表位的可及性，从而实现抗体的最佳结合。在完成.......

讨论

这种紫外光固化树脂稳定化方法为含有合成材料的OCT包埋组织样本提供了一种冷冻切片的替代处理方案，这类样本通常难以通过标准冷冻切片技术进行处理。尽管已有多种粘附选择，例如带电荷载玻片、组织结合胶带及其他贴附式支撑材料，可用于防止组织切片或脆弱样本在操作过程中脱落，但这些产品仅提供载玻片粘附功能，无法在切割过程中为植入物-组织界面提供所需的机械增强支持。此外，目前尚无适用于生物样本表面、可均匀涂布且通过紫外光固化的树脂产品，以增强冷冻切片过程中的结构稳定性。在此背景下，本文所介绍的紫外光固化树脂方案填补了方法学上的空白，能够在保持抗原表位可及性的同时，为需要冷冻处理的抗体检测提供靶向机械支撑，从而实现对含有合成聚合物组分样本的可靠切片¹¹。

成功实施该操作流程需特别注意若干步骤。树脂的选择必须优先考虑其自体荧光尽可能低，并具有适当的黏度，以在切片过程中提供足够的结构支撑，同时避免脆裂或固化不完全。本方案所选用的高黏度树脂在多个荧光通道中均表现出极低的背景干扰。切片厚度需根据材料特性进行优化。在6–10 µm范围内的测试表明，8 µm厚度可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于树脂固化的 5W 鹅颈式紫外灯，波长 395–405 nm	Amazon	UPC ‎603335835561
抗体 - 抗 F4/80（单克隆）	Abcam	ab300421	1:500
抗体 - IV 型胶原蛋白（多克隆）	Abcam	ab6586	1:100
抗体 - 驴抗兔 IgG AlexaFluor Plus 555	Invitrogen	A32794	10 ug/mL
抗体 - 羊抗兔 IgG AlexaFluor 488	Invitrogen	A-11008	10 ug/mL
抗体 - 层粘连蛋白（多克隆）	Invitrogen	PA1-16730	1:500
BioMed Clear	Formlabs	FLBMCL01	生物相容性材料 #1
BioMed Durable	Formlabs	FLBMDU01	生物相容性材料 #2
缓冲 10% 甲醛	Cardinal Health	C4320-101
BZ-X 滤光片 Cy5	Keyence	OP-87766	滤光片组
BZ-X 滤光片 DAPI	Keyence	OP-87762	滤光片组
BZ-X 滤光片 GFP	Keyence	OP-87763	滤光片组
BZ-X 滤光片 TRITC	Keyence	OP-87764	滤光片组
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胃蛋白酶	Sigma	R2283-15ML
磷酸盐缓冲液，pH 7.4	Sigma	P3813
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含 NucBlue 染色剂的 ProLong Glass 抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36985	Hoechst 33342 复染剂
皂苷	Millipore	558255-100GM
染色盘（StainTray）	Simport	M920-2
无菌硅胶片	Bentec	PR72034-51N
靶修复溶液，柠檬酸 pH6	Agilent	S236984-2
Tissue-Tek O.C.T. 包埋剂	Sakura	4583
麦胚凝集素 AlexaFluor 647	Invitrogen	W32466	5 ug/mL