人体皮肤淋巴管及其结构变化的三维可视化

摘要

在应用三种不同的组织清除技术后，通过共聚焦或光片显微镜实现了人体皮肤淋巴管结构的三维可视化。这些方法与免疫组化染色结合，有助于了解淋巴水肿进展过程中淋巴管的功能变化。

摘要

皮肤的淋巴管，包括毛细血管和聚集血管，在废物清除和免疫反应中起着关键作用，对维持组织稳态至关重要。然而，人体皮肤由表皮、真皮和皮下脂肪组成的三层，含有富含胶原蛋白的致密细胞外基质，因此在三维空间中可视化淋巴网络具有挑战性。为解决这一限制，本文介绍了三种针对特定分子和实验目标量身定制的方法，用于利用组织清除试剂结合共聚焦显微镜或光片显微镜，实现人体皮肤淋巴系统的三维可视化。通过免疫组化方法靶向淋巴内皮细胞中的附着连接分子，评估了具有明确功能意义的结构变化，特别是毛细血管连接处标志性的扣子到拉链状重塑，这些变化源自继发性淋巴水肿患者的皮肤组织。这种三维可视化技术揭示了传统组织学切片分析无法识别的血管结构，从而加深了对淋巴管结构和功能的理解。

引言

自从淋巴管在维持皮肤稳态中的作用被认识到，超越了其在癌症转移中已被广泛认可的作用后，人们对其功能的关注度不断增加^1,2。淋巴管结构分为毛细血管和聚集血管，每种具有不同的特征。淋巴毛细血管由淋巴内皮细胞形成的单层结构组成，作为间质液、废物和免疫细胞的初始收集点。相比之下，收集型淋巴管具有双层结构，平滑肌细胞包围淋巴内皮层，使毛细血管网络收集的淋巴液能够主动向中央循环运输。小鼠模型已被用来阐明结构特征，特别是支气管淋巴管，并揭示了炎症性疾病如何诱导结构重塑^4。先前研究表明，紫外线引起的炎症会导致淋巴毛细血管异常扩张，从而影响其液体收集功能。揭示了该功能障碍背后的分子机制，具体表明VEGF-A表达增加伴随VEGF-C表达下降驱动结构改变（^5,6,7）。

虽然三维可视化技术极大地推动了对小^鼠模型中淋巴网络的^理解，但对人类淋巴管进行类似的结构分析仍具挑战性。这一分析空白源于人体组织工作的困难，包括样本有限以及实现全面三维成像所需的技术难题。尤其是皮肤，具有三层结构，包括表皮、真皮和皮下脂肪，作为与外部环境的屏障，比其他软器官更具挑战性。此外，人类皮肤相较于小鼠模型存在明显的分析挑战，包括更大的组织厚度，阻碍深层成像的穿透。此外，丰富的细胞外基质成分，尤其是胶原蛋白及其与年龄相关的结构变化，形成了光学屏障，降低了新兴组织清除技术的疗效，这些技术彻底改变了小鼠的淋巴成像技术¹⁰。

此前曾测试过多种组织清除剂以观察人体皮肤毛细血管，证明其组织相容性¹¹。随后，组织清除试剂成功用于三维人体皮肤淋巴管可视化¹²。通过聚焦淋巴内皮细胞的附着连接处，发现了与淋巴水肿进展相关的淋巴血管结构变化¹³。本文旨在详细描述结合三种皮肤清除技术、共聚焦显微镜、光片显微镜和免疫组化染色，针对特定研究目标进行人体皮肤淋巴血管三维可视化的程序。本研究虽然仅聚焦于切除当天固定且未经历冻融循环的新鲜人类皮肤组织，但这些技术不仅揭示了淋巴管在疾病和衰老过程中的结构变化，以及相关的功能变化。

方案

人体受试者的皮肤样本从日本千叶大学附属医院采集。所有涉及人体受试者的程序均获得千叶大学附属医院机构审查委员会和资生堂全球创新中心的批准，所有受试者均提供了书面知情同意。试剂和所用设备列于 材料表中。

1. 人体皮肤样本的预处理

1. 采集后切除标本的皮下组织。
   注：皮肤切除与获得之间的间隔约为h。运输过程中，组织浸入DMEM中并保持冰袋保存。
2. 将表皮朝下放在60°C的热板上45秒，以分离表皮和真皮。
3. 立即将标本浸泡在冰冷的PBS中。
4. 用镊子把表皮和真皮分开。
5. 将真皮部分浸泡在4%对甲醛4°C下16小时，使用前用PBS清洗。
   注：固定后，样本被保存在4°C的PBS中，免疫染色步骤在数月内启动。
   注意：PFA溶液有毒。所有准备和作必须在排气罩内进行，并佩戴适当的个人防护装备。

2. 全装免疫染色结合清除试剂

1. iDISCO 技术
   1. 将标本修剪至约5毫米×5毫米×5毫米。
   2. 将样品转移到5%的Triton X-100和2.5%的Tween 20 PBS中，在设定为50转/分钟、24摄氏度、16小时的轨道震动器中进行渗透。
   3. 用PBS在24°C下洗涤标本1小时，重复三次。
   4. 将样品浸泡在新制备的阻断缓冲液A中（1% BSA，0.1% Tween 20,0.03% 叠氮化钠，PBS中），置于设定为50转/分钟、24°C的轨道摇动器上，浸泡72小时。
   5. 将标本与针对波多普拉宁的原级抗体（1：100）一起在轨道震动器上，以阻断缓冲器A（50转/分钟、37°C）孵育72小时。
   6. 用洗涤缓冲液A（0.1% Tween-20 in PBS）在24°C下洗涤标本1小时，重复三次。然后，将试样置于轨道摇滚器上，以50转/分、4°C，保持72小时。
   7. 将标本与Alexa Fluor 647结合的小鼠IgG（1：1000）在轨道震动器上，设置在50转/分钟、37°C的阻断缓冲器A中，培养72小时。
   8. 重复步骤1.6。
   9. 将标本与50%甲氧水混合，在24°C下孵育3小时。
   10. 将标本与70%的甲氧水混合，在24°C下孵育3小时。
   11. 将标本与100%氧化氢氧化氢在24°C下孵育16小时。
   12. 将标本与二氯甲烷在24°C下孵育15分钟，重复两次。
   13. 用二苄醚在24°C下清除标本16小时。
       注意：如果此时组织尚未透明，继续等待不会有显著改善。
   14. 用光片显微镜拍摄标本图像。
       注意：使用带有EC Plan-Neofluar 5×/0.16目标的Lightsheet;照明（激发）设为63纳米，探测为648纳米;获得一个步长为5.8微米的Z栈。
       注意：甲醇、二氯甲烷和二苯乙醚是有害的。所有准备和作必须在排气罩内进行，并佩戴适当的个人防护装备。
2. Rapiclear 1.52试剂
   1. 将标本修剪至大约5毫米×5毫米×2毫米大小。
   2. 将样品转移到轨道震动器中，使用设定为50转/分钟、24摄氏度，进行16小时的渗透。
   3. 将样本浸泡在新鲜制备的阻断缓冲液B中（5%驴血清和1%Triton-X 100 PBS），在设定为50转/分钟、4°C的轨道震动器上浸泡16小时。
   4. 将标本与针对podoplanin和VE-cadherin的原版抗体（均为1：100）在轨道振荡器上，以50转/分、4°C的轨道摇滚器上孵育72小时。
   5. 用洗涤缓冲液B（3% NaCl和0.2% Triton-X 100 in PBS）在24°C下洗涤标本1小时，重复三次。然后将样品置于轨道振荡器B洗涤中，调速50转/分、4°C，持续16小时。
   6. 用PBS在24°C下清洗标本1小时。
   7. 将样本与针对小鼠IgG和兔子IgG的二级抗体一起孵育，分别结合Alexa Fluor 647和568（均为1：1000），在设定为50转/分钟、4°C的轨道摇动器阻断缓冲器B中孵育16小时。
   8. 重复步骤1.5。以及1.6。
   9. 在24°C下，用至少5倍于Rapiclear 1.52样本体积的样品清除标本，浸泡16小时。
      注：观察到组织周围区域的清除在不到1小时内。
   10. 将清除的样品嵌入置于带有新鲜Rapiclear 1.52试剂的盖层上的高聚二甲基硅氧烷凝胶腔中。
   11. 用共軛焦显微镜成像标本。
       注意：使用配备Plan-Apochromat 10×/0.45 M27物镜的共軛焦显微镜;激发波长设为633纳米和561纳米，探测范围为641-754纳米和566-628纳米，使用GaAsP探测器;获得一个步长为3.15微米的Z栈。
3. 立方体技术
   1. 将标本修剪至大约5毫米×5毫米×3毫米大小。
   2. 将样本浸泡在50%立方L中，24°C，作为脱脂的预处理。
   3. 将样品转移到100%立方L中，置于设定为50转/分钟、37摄氏度的轨道震动器中，进行7天的脱脂。
   4. 用PBS在室温下清洗标本24小时。
   5. 将样品浸泡在新制备的阻断缓冲液A中，轨道震动器设置为50转/分钟、24摄氏度，浸泡72小时。
   6. 将标本与针对VE-cadherin、podoplanin和CD31的初级抗体（分别为1：100、1：100和1：200）一起在轨道振荡器上，以50转/分、37°C的阻断缓冲器A中孵育72小时。
   7. 用洗涤缓冲液A在24°C下清洗标本1小时。重复三次，然后将试样置于轨道震动器上，温度设定为50转/分钟、4°C，保持72小时。
   8. 将标本与针对小鼠IgG、兔子IgG和绵羊IgG的二级抗体一起孵育，分别与Alexa Fluor 647、568和488结合（均为1：1000），置于轨道摇滚器中阻断缓冲器中，置于设置为50转/分钟、37°C的阻断缓冲器中，培养72小时。
   9. 重复步骤3.7。
   10. 用50% CUBIC-R+（M）在24°C下预先清透标本，浸泡16小时。
   11. 用100% CUBIC-R+（M）在24°C下清除标本，浸泡16小时。
       注意：如果此时组织尚未透明，继续等待不会有显著改善。
   12. 用共軛焦显微镜成像标本。
       注意：使用配备Plan-Apochromat 20×/0.8 M27物镜的共軛焦显微镜;将激发波长设为633 nm、561 nm和488 nm，探测范围为641-754 nm、566-628 nm和479-550 nm，使用GaAsP探测器;获得一个步长为0.78微米的Z栈。

结果

带表皮与无表皮的透明人体皮肤组织光线透光率差异
图1展示了带表皮和无表皮的人类皮肤标本代表性照片，经过透水化和用Rapiclear 1.52试剂清除后。表皮切除通过去除黑色素（一种强效的光吸收剂）来增强组织透明度，这一点通过样本下方黑线的清晰度得到验证。

人体皮肤淋巴管的三维宏观可视化
通过结合iDISCO技术的组织清除与光片显微镜，通过对主要淋巴血管标志物Podoplanin进行免疫染色，实现了人皮肤组织淋巴管的三维宏观可视化（见图2^）。该方法提供关于整体淋巴网络结构的全面信息，而非详细的结构特征。图像显示表皮下方有密集的淋巴毛细血管网络，这些网络汇聚成更深层真皮层更大的预聚集淋巴管，符合已建立的解剖描述¹⁵。

...

讨论

对生物组织中淋巴网络的三维可视化对于理解其结构特征、生理功能以及病理变化至关重要。该方案提供了三种针对人体皮肤组织优化的组织清除方法，每种方法均针对特定的观察目标量身定制。

表皮切除被认为是消除黑色素的关键步骤，黑色素降低了组织透明度并干扰组织学评估¹⁹。与此相符的是，使用iDISCO方法对表皮完整人体皮肤样本进行免疫染色，显示信号较弱，尤其是在表皮下方，表明抗体穿透和激光从表皮侧的传输受阻。此外，该方案还使用了短暂的热刺激来去除表皮。这种方法被认为比使用dispase²⁰等酶促方法对皮肤组织结构和细胞膜蛋白的损伤更小。

本研究采用了三种不同的组织清除技术，包括Rapiclear、CUBIC和iDISCO。关于Rapiclear试剂的使用，该方案主要基于制造商的建议;但实施了以下改进：（1）组织厚度减少至约2毫米以确保试剂渗透效率，（2）省略脱水和再水化步骤，（3...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗CD31抗体	R&D系统	AF806	1：200时的稀释
抗波多普拉宁抗体	达科	M3619	1：100时的稀释
抗VE-钙粘蛋白抗体	细胞信号传导技术	#2500	1：100时的稀释
立方-L	东京化学工业	T3740
立方-R+（M）	东京化学工业	T3741
DMEM，低血糖，丙酮酸	赛莫飞世尔科学	11885084
驴类抗小鼠IgG（H+L）高度交叉吸附的二级抗体，Alexa Fluor 647	赛莫飞世尔科学	A-31571	1：1000时的稀释
驴子抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附的二级抗体，Alexa Fluor 568	赛莫飞世尔科学	A10042	1：1000时的稀释
驴子抗绵羊IgG（H+L）交叉吸附二级抗体，Alexa Fluor 488	赛莫飞世尔科学	A-11015	1：1000时的稀释
Rapiclear 1.52	顺珍实验室	RC152001
蔡司光图 Z.1 显微镜	卡尔·蔡司
蔡司LSM 880共焦点激光扫描显微镜	卡尔·蔡司