单分子FRET实验可实现对Hfq介导的细菌sRNA与mRNA退火过程的定量分析，从而能够测量相互作用的动力学特征和稳定性。代表性结果展示了种子序列长度、Hfq结合基序以及基序间距如何影响RNA双链的形成。
本文内容
摘要
摘要
确定细菌小RNA（sRNA）与其mRNA靶标之间退火反应所遵循的规则具有挑战性，因为这些RNA在序列和结构上具有高度异质性。为了厘清各个特征的独立作用，我们系统地改变了若干关键决定因素，包括种子区强度、Hfq结合基序以及二者之间的间距。利用单分子Förster共振能量转移（smFRET）技术检测这些特征对sRNA-mRNA双链稳定性的影响，该技术能够在毫秒时间尺度上监测单个RNA分子，从而揭示在群体实验中常被掩盖的动态过程。
我们证明，短的种子区域（4-5 bp）会形成不稳定且寿命较短的复合物，而较长的种子区域（8-10 bp）则可产生稳定的双链结构。延长Hfq结合基序或在mRNA的结合位点之间引入间隔序列，可进一步延长相互作用的持续时间，凸显了基序强度和空间排列在Hfq介导的退火效率中的重要性。此外，该方法为在单分子分辨率下解析RNA-RNA相互作用动力学以及探究RNA分子伴侣机制提供了一个稳健且可重复的框架。
引言
细菌基因表达在转录后水平上受到小RNA的广泛调控。这些短RNA（通常为50-300个核苷酸）通过与靶标mRNA碱基配对发挥作用1。在许多情况下，小RNA会与核糖体结合位点退火，从而抑制翻译，或通过招募核糖核酸酶引发mRNA降解2,3。尽管这些相互作用已通过遗传学和生物化学实验得到广泛研究，但目前大多数可用方法均通过RNA水平或蛋白质输出的稳态效应间接推断调控情况，因此难以解析其潜在的结合动力学。
高效的靶标调控通常需要RNA伴侣蛋白Hfq，这是一种小型六聚体Sm样蛋白4,5。Hfq通过保护sRNA免受核酸酶降解，延长其半衰期6，并促进其与靶mRNA的退火结合7,8。Hfq通过三个具有不同RNA结合偏好的表面实现这些功能：远端面识别通常存在于mRNA中的AAN基序，近端面结合sRNA终止子中典型的富含U序列，而边缘区域则通过静电作用与RNA骨架相互作用9。然而，Hfq的丰度远低于其可相互作用的RNA总量10,11。尽管存在这一明显限制，新合成的sRNA仍能在转录后数分钟内迅速找到其靶标并启动调控12。这一矛盾现象表明，RNA与Hfq的相互作用具有高度动态性，RNA分子持续地结合与解离，而非形成长时间稳定的复合物13,14。要理解此类短暂相互作用如何实现可靠的调控，需要在单个结合事件层面进行实验观测，而非依赖群体平均数据。
sRNA 与 mRNA 之间的相互作用由不完全互补的种子序列介导，这些种子序列必须在通常较长且具有高度结构的 mRNA 中找到其匹配位点。此外，sRNA 种子区域与 mRNA 上 Hfq 结合位点之间的距离可能变化较大15，这进一步增加了退火过程的复杂性。Hfq 通过在靶标 mRNA 的潜在结合位点之间灵活转移 sRNA，帮助克服这些挑战，从而提高遇到正确配对区域的可能性16。 Hfq 介导的配对还可重塑 mRNA 的局部结构，瞬时解开碱基配对区域，暴露出原本无法接近的序列。然而，这种结构重塑也可能导致非 productive 或中止的退火事件。这些瞬时相互作用有时可由位于配对位点附近的强 Hfq 结合基序稳定17。尽管具有这种灵活性，并非所有的 sRNA-mRNA 相遇都会形成稳定的双链结构，决定退火效率的因素仍不清楚。特别是，各个序列决定因素如何定量影响结合寿命和复合物稳定性，仍有待阐明。
在此，我们建立了一个最小化的重建单分子系统，该系统能够通过单分子荧光共振能量转移（smFRET）技术对序列决定因素进行逐步操控，并直接测量退火动力学。在该系统中，我们设计了初始退火效率较低的RNA配对，并系统性地改变了若干关键特征，包括种子区强度、Hfq结合基序强度以及这些位点之间的间隔距离，以解析各个参数如何影响双链的稳定性。通过在受控的体外（in vitro）系统中分离出明确的序列特征，该方法能够对小RNA靶向规则进行机制性解析，而这些规则在体内（in vivo）由于调控网络的复杂性和间接调控效应，难以被清晰区分。
方案
本方案描述了用于监测小RNA与信使RNA退火过程的单分子FRET检测方法。内容包括模型RNA的设计、合成、载玻片的钝化与功能化、单分子成像以及定量数据分析等步骤。
RNA 的制备
在计算机中设计小RNA（sRNA）和信使RNA（mRNA）序列。in silico。每条sRNA序列末端应包含转录终止子，并含有U富集的Hfq结合基序以及一段与目标mRNA互补的种子序列。相应的mRNA应包含作为Hfq结合基序的AAN重复序列，以及一段与sRNA种子区互补的序列。除Hfq结合区域外的其他序列应随机化，同时避免出现AAN基序和U富集片段，以防止发生非预期的Hfq相互作用。在mRNA的3'端添加一段与系链互补的序列，以便在成像过程中将其固定于表面。使用RNAstructure软件（通过网络服务器或本地运行）预测RNA二级结构，但不包含系链互补序列18。对于基于网页的分析，将FASTA格式序列上传至RNAstructure Web Server（https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb），并选择“Predict a Secondary Structure”。采用默认参数（温度37 °C，无折叠约束条件）。计算完成后，检查结构图谱和折叠概率。若种子序列或Hfq结合基序内的核苷酸预测碱基配对概率>60%，则将其定义为被遮蔽区域。超过该阈值的序列需重新设计。
准备DNA模板用于 体外 使用DNA聚合酶按照制造商说明书通过延伸重叠寡核苷酸进行转录。每种引物浓度为3 µM。采用制造商推荐的热循环程序，但将扩增循环次数减少至8次，此次数已足以完成引物延伸。
使用T7 RNA聚合酶，在1×转录缓冲液（80 mM Tris-HCl，pH 8.0，2 mM 亚精胺，10 mM NaCl）中，于37 °C条件下反应3小时至过夜，进行RNA转录，反应体系中需添加每种NTP各1 mM、40 mM DTT和30 mM MgCl2。加入EDTA至终浓度30 mM以终止反应。进行RNA沉淀时，先加入1/10体积的3 M NaOAc（pH 5.4），再加入2.5–3体积的≥99%乙醇。充分混匀后，在-80 °C孵育1小时。在4 °C下以≥20,000 × g离心35分钟，沉淀RNA。弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，并短暂空气干燥。将RNA沉淀溶于20 µL 8 M尿素中，于90 °C加热2分钟。在含有8 M尿素的8%聚丙烯酰胺凝胶上纯化RNA。切下目标条带，并在洗脱缓冲液（0.3 M乙酸钠，pH 5.4，1 mM EDTA）中过夜洗脱RNA。通过乙醇沉淀法回收RNA（参照DNA沉淀操作步骤），并将沉淀溶于无核酸酶的水中。
为制备用于荧光标记的RNA，按所述方法进行体外转录，并在反应中补充32 mM GMP，以生成带有5'单磷酸的转录本。使用1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐19（EDC）和咪唑处理RNA，以在5'端引入氨基。将sRNA在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH 8.5）中与Alexa Fluor 555或Cy3 NHS酯孵育，具体操作遵循制造商说明书。使用层析离心柱纯化修饰后的RNA，乙醇沉淀后将沉淀物溶解于无核酸酶水中。通过Nanodrop或等效分光光度计在260 nm及染料特异性吸收峰波长处测定吸光度，以分光光度法测定标记效率。根据Beer-Lambert定律及荧光染料制造商提供的相应消光系数，计算RNA和染料的浓度。标记效率定义为染料与RNA的摩尔比，通常接近100%。标记后的RNA可在-20 °C下保存。
订购带有3′-生物素基团和5′-氨基己基连接臂的DNA寡核苷酸。按照上述方法，使用乙醇和乙酸钠沉淀DNA。根据生产商说明书，在碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液（pH 8.5）中用Cy5 NHS酯标记氨基。按照上述方法，通过分光光度法测定标记后DNA的浓度。标记后的DNA可保存于-20 °C。
Hfq 蛋白纯化
在含有 Hfq 表达质粒 pET21b-EcHfq 的 Escherichia coli BL21 (DE3) Δhfq::cat-sacB 菌株中进行培养，该质粒中的 E. coli hfq 基因由 IPTG 诱导型启动子驱动表达。Hfq 蛋白无亲和标签表达；其天然蛋白表面暴露的组氨酸残基足以通过 Ni2+ 亲和层析进行纯化。将菌体在 1 L 添加了 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB-Miller 培养基中，于 37 °C 培养至 OD600 达到 0.6。加入 IPTG 至终浓度 1 mM 以诱导 Hfq 表达，并在 37 °C 继续孵育 4 小时。于 5,000 × g 离心 10 分钟收集菌体，随后将沉淀重悬于 50 mL 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，500 mM NH4Cl，250 mM MgCl2，1 mM 2-巯基乙醇；注意：2-巯基乙醇有毒，应在通风橱中操作）。在冰上采用超声破碎法裂解细胞，设置脉冲模式为 50% 占空比，共进行三次，每次 40 秒，脉冲间在冰上冷却 1 分钟。将裂解液于 4 °C、27,000 × g 离心 20 分钟。将上清液在 85 °C 加热 45 分钟，然后在相同条件下再次离心。将所得上清液在室温下轻柔振荡孵育 1 小时，加入 RNase A（30 µg/mL）和 DNase I（5 U/mL），随后通过 0.45 µm 滤膜过滤。将澄清后的裂解液上样至预先用 NiSO4 预装的亲和层析柱。用洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 8.0，500 mM NH4Cl，0.5 mM 2-巯基乙醇）洗涤层析柱。使用相同缓冲液进行洗脱，咪唑浓度采用从 10 mM 到 1 M 的线性梯度。合并含有 Hfq 的洗脱组分，并上样至已用 HB 缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，250 mM NH4Cl，1 mM EDTA，10% 甘油）平衡的 HiLoad 16/600 Superdex 200 凝胶过滤层析柱。按照制造商说明操作层析系统。补充图 1 展示了 Hfq 纯化的代表性 SDS-PAGE 分析结果。如有需要，可使用离心滤膜（3 kDa 截留分子量）浓缩纯化后的蛋白。纯化的 Hfq 分装样品可保存于 -80 °C。
单分子实验
石英载玻片的钝化处理20
准备带有五个平行孔（直径 0.8 mm）的石英载玻片，孔位于每条长边附近。将石英载玻片和盖玻片放入赫伦达尔染色罐（载玻片架）中，用丙酮超声清洗 20 分钟（注意：丙酮易燃且易挥发；应在通风橱中操作）。使用甲醇重复清洗步骤（注意：甲醇有毒且易燃；应在通风橱中操作）。用去离子水彻底冲洗载玻片，并在 1 M KOH 溶液中超声处理 1 小时（注意：KOH 具有强腐蚀性，需佩戴手套和护目设备）。用水冲洗载玻片，然后依次在丙酮和甲醇中各超声 20 分钟。使用 5 M KOH 重复 KOH 清洗步骤 1 小时，随后用去离子水充分冲洗（注意：操作浓 KOH 时应穿戴适当的防护装备）。将载玻片自然晾干。准备一套洁净的赫伦达尔染色罐，用正己烷冲洗（注意：正己烷高度易燃；应在通风橱中操作），然后静置晾干。将载玻片放入载玻片架中，用正己烷冲洗两次。向载玻片架中加入 75 mL 正己烷，并小心地将 50 µL 二氯二甲基硅烷（DMDCS）注入正己烷液面以下（注意：避免 DMDCS 暴露于空气中）。轻轻摇动孵育 1.5 小时。用正己烷冲洗并超声 1 分钟，重复此步骤三次以去除残留的 DMDCS。将载玻片晾干后，真空密封于 50 mL 离心管（如 Falcon 或锥形管）中。制备好的载玻片可于 −20 °C 保存，直至后续使用。
流动通道的组装与功能化
可使用石英载玻片、玻璃盖玻片、双面胶带、移液枪头和环氧树脂组装一个简单的流动通道。在石英载玻片的孔洞之间贴上细条状双面胶带，并将盖玻片置于其上。用环氧树脂密封较长的两侧边缘。从移液枪头上截取约5 mm长的两段（一段取自较细的尖端，另一段取自较宽的套管部分），将其中一段插入一个孔中作为出口，另一段插入相邻的平行孔中作为进样储液池。用环氧树脂固定两者。进样储液池应在注入前能够保持液体不泄漏。为使溶液流经通道，将1 mL注射器的管路连接至出口端。
依次用以下试剂预处理通道，以实现表面功能化：生物素化BSA（0.2 mg/mL）处理5分钟，Tween-20（0.2%）处理10分钟，NeutrAvidin（0.1 mg/mL）处理1分钟。每个通道每步使用约100 µL溶液即可。操作时避免抽取超过入口储液池中所含液体的体积，否则会将空气引入通道并产生气泡。各步骤之间在储液池中保留少量溶液，以防止通道干燥。每步之间用1× TNK缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，50 mM NaCl，50 mM KCl）充分冲洗。该处理可建立生物素-NeutrAvidin表面，用于RNA的固定。
在固定前立即制备mRNA-接头双链体，将40 nM mRNA与20 nM生物素标记的Cy5荧光标记DNA接头混合。在1× TNK缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，50 mM NaCl，50 mM KCl）中于75 °C变性5分钟，随后在37 °C复性15分钟，最后在20 °C平衡。
将样品用成像缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，50 mM NaCl，50 mM KCl，4 mM 6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸，0.01% 八乙二醇单十二烷基醚，0.8% 葡萄糖，2 U/mL RNase 抑制剂）稀释50倍，注入流动通道以固定mRNA。孵育1分钟，然后用添加了除氧系统的成像缓冲液（165 U/mL 葡萄糖氧化酶和2170 U/mL 过氧化氢酶）洗涤，以减少光漂白。
通过将组分以1:1比例混合，在1× TNK缓冲液中制备终浓度为250 nM的sRNA-Hfq复合物，并在室温下孵育5-15分钟。在含有氧气清除系统的成像缓冲液中将复合物稀释50倍，并在成像前立即注入流动通道中。
单分子数据采集
开启EMCCD相机和激光器，搭建基于棱镜的全内反射荧光（TIRF）显微镜系统。将已制备好并装配了流动通道的载玻片安装在显微镜载物台上，并将棱镜置于其上。使用Single软件（https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab）进行数据采集。在软件中，通过选择AutoScale确定背景强度，并将获得的数值填入Background字段。设置采集帧速率为100 ms。使用532 nm激光激发Alexa Fluor 555或Cy3，使用633 nm激光激发Cy5。通过60×水浸物镜同时采集两个通道的发射荧光信号。 每段录像开始时，先用633 nm激光激发采集10帧，以定位视野中Cy5标记的mRNA。随后使用532 nm激光持续记录5分钟。最后用633 nm激光激发1秒，确认Cy5已光漂白。此过程将生成.pma格式的录像文件，可用于后续分析。
单分子数据分析
使用自定义的 IDL 脚本分析原始 .pma 文件，进行供体-受体通道映射并提取荧光强度轨迹。首先，使用可在 532 nm 或 633 nm 激光激发下于供体和受体通道中均被检测到的多色荧光微球记录校准影片。利用该校准影片生成用于对齐供体与受体通道的映射文件。将生成的映射文件应用于所有实验记录，以识别对应的供体-受体对、检测荧光斑点，并导出用于后续 FRET 分析的强度时间轨迹。详细的分步操作说明随脚本一并提供（https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab）。
使用脚本 s_tr_E.m 在 MATLAB 中处理强度轨迹。启动脚本后，输入包含 .traces 和 .pks 文件的目录，接着输入文件索引和时间分辨率。当系统提示时，选择用于斑点识别的帧窗口。脚本随后将显示每个单个斑点的供体和受体强度。使用键盘命令浏览分子（按 b 返回，按 g 跳转到指定分子）。根据需要点击图表以定义供体和受体基线（k）并校正串扰（l）。按 s 键将接受的轨迹单独保存为包含时间、供体和受体强度的 .dat 文件。使用导出的文件进行后续定量分析。
使用峰检测程序分析单个单分子FRET轨迹，提取结合事件以进行定量分析，包括停留时间分析和FRET状态分布。启动程序后，通过“文件”菜单打开包含导出的.dat轨迹文件的文件夹。设置先前通过MATLAB脚本确定的基线值以及供体到受体的信号串扰值。接下来，设定强度阈值以指导自动峰检测，确保所有经视觉确认的结合事件均高于所选阈值。如果噪声导致单个事件被分割为多个峰，可使用内置的合并功能手动合并。点击“保存峰”以将检测到的事件导出为.csv文件，其中包含每个事件的起始时间、结束时间和平均FRET效率。输出文件保存在peaks目录中，而每个事件的帧分辨率FRET值则写入peak-fret目录。FRET效率通过将受体荧光强度除以供体与受体荧光强度之和来计算，所用数值已校正背景信号及供体在受体通道中的串扰。手动检查轨迹中Cy5的光漂白现象，其特征为FRET效率突然下降并伴随Cy3荧光强度上升。当发生光漂白时，只要Cy3荧光仍可检测，即认为结合持续存在，并通过编辑相应的.csv文件校正峰持续时间。
从 peak-fret 文件中将逐帧的 FRET 效率值导入 GraphPad Prism。使用频率分布函数生成 FRET 直方图，并用高斯模型拟合分布，以确定主要的 FRET 群体。
通过电子表格将解离时间点减去结合时间点，确定单个结合事件的停留时间。计算每次实验重复中瞬时事件（<10 s）所占的比例。统计分析在 GraphPad Prism 中进行。两个条件之间的比较采用非配对 t 检验，三个或以上条件之间的比较采用单因素方差分析（ANOVA）结合 Tukey 事后检验。
结果
种子序列长度决定了小RNA与信使RNA配对的动力学模式
我们建立了一种简化的单分子实验体系，用于研究序列特征如何调控Hfq介导的RNA退火过程。所设计的模型RNA基于先前报道的Hfq依赖性小RNA-信使RNA配对结构16,17，其中信使RNA上含有富含腺苷酸的Hfq结合基序，小RNA上则含有富含尿苷酸的边缘结合位点（图1A）。小RNA的5ʹ端标记了Alexa Fluor 555（供体），信使RNA-DNA连接链上标记了Cy5（受体），从而可通过FRET信号检测碱基配对引起的分子间接近。
将种子互补序列长度从4、5、8到10 bp进行变化，产生了不同的动态行为。当种子序列为4 bp时，相互作用主要为瞬时性的，并表现出异质性的FRET效率，提示碱基配对不完全（图1B-D）。相比之下，8 bp和10 bp的种子序列形成了稳定的双链结构，通常在整个观察窗口内持续存在（图1C）。这些相互作用产生了预期的高FRET状态（EFRET ≈ 0.79–0.80，图1D），与RNA之间完全碱基配对的结果一致。5 bp的种子序列则产生寿命较短但特征明确的结合事件（EFRET ≈ 0.66），为后续RNA序列的修饰提供了可用的动态范围（图1B-D）。因此，我们在所有后续实验中均采用5 bp的互补序列。
更强的 Hfq 结合基序可增加 sRNA-mRNA 复合物的稳定性
接下来，我们研究了在固定 5 个碱基互补配对的情况下，Hfq 结合强度如何调节结合寿命。将 mRNA 基序从 AAN4 延长至 AAN6 显著提高了形成稳定复合物的概率（p < 0.001）。平均寿命从 7.5 s 增加到 18 s，而不稳定事件的比例（< 10 s）从 80 ± 2% 下降到 68.3 ± 2.9%（图 2A-C）。
随后，我们测试了Hfq结合基序对sRNA的影响。将边缘结合位点从UUAUUUUUUU缩短为CUUC（sRNA-SR，“短边缘”）后，产生的相互作用极不稳定（与AAN4结合的平均寿命为1.9 s）；在此背景下增强mRNA基序仅产生轻微改善（与AAN6结合的平均寿命为3.0 s，无显著差异，图2B，C）。因此，两个组分均对所形成复合物的稳定性有贡献，但较弱的sRNA-Hfq相互作用限制了增强mRNA基序所带来的稳定性提升。
mRNA上Hfq结合位点与种子位点之间的间隔序列可促进更稳定复合物的形成
Hfq可保持与AAN区域的结合，同时利用其边缘表面促进对sRNA最佳配对位点的搜寻16。这一特性提示，mRNA上两个结合区域之间的额外间隔可能影响相互作用的稳定性。
为了验证这一点，我们在Hfq结合位点和sRNA结合位点之间引入了一个15个核苷酸的单链间隔序列（N15）。该修饰使稳定退火事件的持续时间显著延长，从7.5秒（AAN4）增加到47秒（AAN4-N15）（p < 0.01）（图3A，B）。持续时间少于10秒的结合事件比例也从80 ± 2%下降至44 ± 6%（图3C）。这些数据表明，结合模块之间增加的柔性有助于稳定退火中间体，并促进形成更持久的双链结构。
数据可用性：
本研究发现所支持的全部数据，包括单分子FRET轨迹、处理后的数据集和分析脚本，均已公开提供于Mendeley Data数据库，网址为：doi:10.17632/3z8fng2c8g.1
图1sRNA-mRNA 互补性对结合效率的影响。（A） 用于sRNA-mRNA退火的单分子FRET检测。Alexa Fluor 555标记的sRNA与固定化的mRNA-Cy5-DNA拴系复合物之间发生碱基配对，产生高FRET信号。模型mRNA包含一个Hfq结合位点（AAC）4 （蓝色）和一个sRNA结合位点（S5，红色），随后是五个核苷酸以及RNA-DNA杂交区。sRNA包含一个边缘结合位点（橙色）。（图中各面板B-D按实验条件（种子长度）分组。（B） 单个 mRNA 分子上典型的 sRNA 结合事件。图中显示了 Alexa Fluor 555 标记的 sRNA（供体，绿色）和 Cy5-DNA 拴系物（受体，红色）的荧光强度轨迹。Cy5 在记录的前十个帧和最后十个帧期间被直接激发。 (C) 显示50个代表性mRNA分子与sRNA-Hfq结合的栅格图。每条水平条带代表一个单独的sRNA-mRNA相互作用。 (D) mRNA与sRNA之间相互作用的FRET效率直方图，其中互补区域分别为4 bp（N = 416个mRNA）、5 bp（N = 513个mRNA）、8 bp（N = 191个mRNA）和10 bp（N = 105个mRNA）。FRET效率基于每个结合事件在0.1秒时间间隔内经基线校正和串扰校正后的供体与受体荧光强度计算得到。图中所示高斯拟合（蓝色）用于指示主要的FRET群体，但未用于E_FRET值的计算。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 2：Hfq 结合基序长度对 sRNA-mRNA 相互作用的影响。 所有变体中的碱基配对区域长度均为 5 bp。（A） 栅格图显示由 sRNA-Hfq 复合物结合的 50 个代表性 mRNA。每条水平条带代表一次单独的相互作用。上方的示意图说明了相应的 RNA 设计，其中 mRNA 中 (AAC) 重复序列的数量以及 sRNA 中边缘结合区域的长度（SR = “短边缘”）有所变化。颜色编码同 图 1A。（B） sRNA-mRNA 结合寿命的散点图。每个点代表一次单独的结合事件。平均寿命（红色水平线）：mRNA-AAN4 + sRNA 为 7.5 s（N = 188 个 mRNA），mRNA-AAN6 + sRNA 为 18 s（N = 142 个 mRNA），mRNA-AAN4 + sRNA-SR 为 1.9 s（N = 85 个 mRNA），mRNA-AAN6 + sRNA-SR 为 3 s（N = 149 个 mRNA）。（C） 柱状图显示结合事件中短于 10 s 的百分比。误差线表示来自两个独立数据集的标准偏差。采用单因素方差分析（ANOVA）结合 Tukey 多重比较事后检验进行统计分析。***p < 0.001，****p < 0.0001；ns，无显著性差异。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：Hfq结合位点与sRNA结合位点之间间隔序列长度对sRNA-mRNA相互作用的影响。 所有变体中的碱基配对区域均为5个碱基对长。（A） 显示由sRNA-Hfq复合物结合的50个代表性mRNA的栅格图。每条水平条代表一次单独的结合事件。上方的示意图说明了相应的RNA设计。N15 = 随机序列的15个核苷酸间隔区。颜色编码同图1A。（B） sRNA-mRNA结合寿命的散点图。每个点代表一次单独的结合事件。平均寿命（红色水平线）：mRNA-AAN4 + sRNA为7.5 s（N = 188个mRNA），mRNA-AAN4-N15 + sRNA为47 s（N = 289个mRNA）。（C） 柱状图显示短于10 s的结合事件所占百分比。误差线表示来自两组独立数据集的标准偏差。统计分析采用非配对t检验。**p < 0.01。请点击此处查看该图的放大版本。
补充图1：E. coli Hfq蛋白的纯化。 Hfq表达与纯化的SDS-PAGE分析。（上图）在Ni2+亲和（HiTrap）柱纯化过程中收集的样品，包括诱导前、诱导后、沉淀、裂解液、上样液、穿流液、洗涤组分及洗脱峰组分。（下图）经HiLoad 16/600 Superdex 200柱进行凝胶过滤层析后，峰组分的SDS-PAGE结果。图中标注了Hfq的单体（约11 kDa）和六聚体（约66 kDa）形式。请点击此处下载该文件。
讨论
本研究建立了一种最小化的单分子实验体系，用于解析特定RNA序列特征如何决定Hfq介导的sRNA-mRNA退火效率。通过改变种子区域长度、Hfq结合基序强度以及结合模块之间的间距，我们直接在单分子分辨率下量化了每个参数对双链稳定性的贡献。与仅报告群体平均效应的群体测量方法不同，该方法能够直接解析单个结合与解离事件，从而实现对动力学异质性和瞬时相互作用的测量。我们的结果表明，即使较短的种子区域也能发生瞬时结合，而较长的种子区域则形成寿命更长的稳定双链。这些发现与早期研究结果一致 体内 以及集成数据表明，细菌sRNA中的天然种子区域通常跨越6-12个核苷酸，且极少形成完全互补的双链结构21,22,23.
我们还发现，mRNA 和 sRNA 的 Hfq 结合基序均显著影响双链的稳定性。延长 mRNA 上的 AAN 基序可增加结合寿命，而缩短 sRNA 的边缘结合位点则明显降低其稳定性。这支持了一种协同作用模型：Hfq 的远端面锚定富含腺苷的 mRNA 基序，而边缘区域则招募富含尿苷的 sRNA，以促进互补区域的有效对齐9,17。与通常仅能检测到功能性调控结果的遗传学或报告基因检测方法不同，该系统可将结合稳定性与下游效应进行定量分离，从而直接比较各个序列特征如何调节物理相互作用的寿命。当 sRNA 与 mRNA 配对需要发生结构重排时，强边缘结合基序尤为重要，因为它可增强 RNA 在 Hfq 上的保留17。此外，人们认为 sRNA-Hfq 复合物可通过边缘区域促进对 mRNA 的侧向扫描16，这一特性在靶位点距离 Hfq 结合区域较远时可能尤为关键。我们关于结合位点间含有 15 个核苷酸间隔序列的实验结果支持这一观点，表明种子序列与 Hfq 基序之间的额外灵活性可增强配对稳定性，可能通过减少链交换过程中的空间位阻实现。
除了天然系统外，该结果还与合成或人工设计的小RNA（sRNA）相关。目前大多数设计策略集中于优化种子区域或通用骨架结构23,24,25，但我们的数据强调了其他决定因素，例如Hfq结合基序与靶标区域之间的间隔距离。由于序列特征是以可控且模块化的方式引入的，该检测方法为验证设计规则提供了一个系统的实验框架。这一原则可为未来构建具有更高调控效率的人工sRNA提供指导。
尽管该方法能够对RNA-RNA相互作用进行定量且可重复的分析，但也存在局限性。该检测方法研究的是完全互补的区域，而大多数生理条件下的sRNA-mRNA相互作用包含错配和凸起结构，这些结构可能影响识别与调控过程。该方法可测量sRNA-mRNA结合的寿命，但并未直接探讨下游的调控结果，例如翻译抑制或mRNA降解。未来对该检测方法的改进可引入错配的种子区域、不同GC含量序列，或核糖体与降解体，以系统性地探究这些因素如何影响结合动力学。
致谢
感谢 Sarah Woodson 教授协助使用单分子仪器。本研究由波兰国家科学中心（2022/46/E/NZ1/00462，授予 EMM）和欧洲分子生物学组织安装资助（EMBO Installation Grant，IG 5730-2024，授予 EMM）资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.45 μm 滤膜 | Millipore | HABG04700 | |
| 5 mL Hi-Trap 层析柱 | Cytiva | GE17-0408-01 | |
| 丙酮 | Merck | 270725 | 色谱纯 |
| 丙烯酰胺：双丙烯酰胺溶液 | Merck | A2792-100ML | |
| ALPHA555 NHS 琥珀酰亚胺酯 | Thermo Fischer | A20009 | |
| Amicon Ultra 离心滤膜（截留分子量，3 kDa） | Merck | UFC900308 | |
| 氯化铵 | Merck | 1330-500G | |
| 氨苄青霉素 | Merck | A9518-5G | |
| ATP | Linegal Chemicals | K054.1 | |
| β-巯基乙醇 | Merck | M3148-500ML | |
| 生物素化牛血清白蛋白（BIO-BSA） | Merck | A8549-10MG | |
| 含 Bio-Gel P-30 的 Bio-Spin 层析柱 | Bio Rad | 7326231 | 用于纯化标记的 RNA |
| 过氧化氢酶 | Merck | C9322 | |
| CTP | Linegal Chemicals | K057.4 | |
| Cy3 HNS 酯 | Cytiva | PA13105 | |
| Cy5 NHS 琥珀酰亚胺酯 | Cytiva | PA15101 | |
| DDT | Thermo Fischer | R0861 | |
| 二氯二甲基硅烷 | Merck | 440272 | |
| DNA 寡核苷酸（连接子），5′-氨基连接臂 C6 | Thermo scientific | n/a | |
| DNase I | Thermo Scientific | 18047019 | |
| EDC | Thermo scientific | PG82079 | |
| EDTA | Merck | ED2SS-1KG | |
| EMCCD 相机 | Andor | ||
| 乙醇 | Merck | 1085430250 | |
| 葡萄糖 | Merck | D9434-1KG | |
| 葡萄糖氧化酶 | Merck | G2133-50KU | |
| 甘油 | Merck | G5516-1L | |
| GMP | Merck | G8377 | |
| GTP | Linegal Chemicals | K056.4 | |
| HCl | Merck | 1.00318 | |
| 己烷 | Thermo Fischer | 045652.M1 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 尺寸排阻层析柱 | Cytiva | GE28-9893-35 | |
| IPTG | Merck | 420322-1GM | |
| KCl | Merck | P9541-1KG | |
| KOH | Merck | 484016-1KG | |
| 氯化镁 | Merck | M8266-1KG | |
| 甲醇 | Merck | 34885-M | 色谱纯 |
| 中性亲和素（Neutravidin） | Thermo Fischer | 31000 | |
| 硫酸镍 | Merck | 1067261000 | |
| 尼科尔（Nikkol） | Merck | P8925-1G | |
| Q5 聚合酶 | NEB | M0491S | 用于体外转录模板的制备 |
| RNase A | Thermo scientific | EN0531 | |
| RNasin Plus | Promega | N2611 | |
| 乙酸钠 | Merck | S7545-100G | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S3014-1KG | |
| 亚精胺 | Merck Life Science | S2626 | |
| Tris 碱 | Thermo Scientific | 17926 | |
| Trolox | Merck | 238813-1G | |
| 尿素 | Merck | U1250-5KG | |
| UTP | Linegal Chemicals | K055.3 |
参考文献
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