果 蝇 卵母细胞中中心体微管网络的实时成像与定量分析工作流程

Summary

本文介绍了一种结合实时成像与自动分析工具的方案，用于分析 果蝇 卵母细胞中的微管动态。该工作流程能够高效且可重复地测量微管行为，包括生长、方向、速度和空间组织，并在优化后可适配至其他细胞类型。

Abstract

微管（MT）细胞骨架对许多细胞功能至关重要，包括细胞形状、极性、迁移和分裂。虽然中心体作为分裂动物细胞的主要MT组织中心（MTOC）起作用，但许多分化细胞，包括 果蝇 卵母细胞，依赖着中心体途径来组装MT网络。与大量MT在增殖细胞中组织的知识相比，MT网络如何在没有中心体的情况下组装，目前知之甚少。 果蝇 卵母细胞为研究中心体MT的组织和动态提供了有力的模型。然而，其密集的MT网络对传统成像构成挑战。实时成像能够实时可视化MT的生长和定向，但标准化的分析方法仍然有限。本文介绍了一种基于活成像的方案，利用末端结合蛋白1（EB1）-绿色荧光蛋白（GFP）分析果 蝇 卵母细胞中MT生长动态，GFP是一种标记活性MT聚合位点的辅助追踪蛋白。高分辨率Airyscan共聚焦显微镜支持EB1彗星的探测，定制斐济宏和Python脚本则提供了简洁且可重复的彗星密度、速度、长度和方位量化。我们通过比较对照卵母细胞与受冷诱导MT脱聚合的卵母细胞，以及Patronin突变体（人类中的CAMSAP），这是一种保守的MT-末端稳定子和非中心体微管组织中心（ncMTOC）的核心成分，验证了该方法作为MT动力学受损的正向对照。我们的分析揭示了区域特异性的MT动态，包括EB1彗星的前置富集和特征性方向偏差，并确认了工作流程对MT生长细微扰动的敏感性。这种方法为研究卵母细胞中MT行为提供了一个可靠且用户友好的框架。该分步方案使得在该背景下研究MT调控因子成为可能，并且在适当优化下，可能适用于其他分化细胞类型，如神经元和上皮细胞。更广泛地说，它支持机制性研究和遗传筛选，探讨多样的MT结构如何支撑专门化的细胞功能。

Introduction

微管（MT）细胞骨架是真核细胞的重要组成部分，在建立和维持细胞形状、极性和分裂中发挥着重要作用。MT聚合物的动态行为，以生长和收缩为特征，对许多基于^MT的工艺至关重要^1,2。不同MT阵列的组装依赖于微管组织中心（MTOCs）的联合作用，MTCs从这些中心形成MT细胞，以及多种MT调控蛋白的活性，这些蛋白控制MT的稳定性、方向和动力学^1,2,3。研究最深入的MTOC是中心体，它生成放射状MT阵列，这些MT对调控间期细胞形状和极性以及有丝分裂中有丝分裂纺锤体组装^{至关重要。}然而，在有丝分裂或分化时，如神经元和上皮细胞，中心体MTOC活性常被减弱，极端情况下如卵母细胞中可被消除^6,7。这通常与细胞类型特异性MT细胞骨架的重塑相关，MTOC功能被赋予其他^{细胞位点2,3,8}，通常称为非中心体MTOCs（ncMTOCs）。虽然在阐明有丝分裂细胞中MT的组织方面取得了重大进展，但对于MT如何在有丝分裂或分化过程中的动物细胞中如何成核、稳定和空间排列，知之甚^少。值得注意的是，在生物体中，大多数细胞是不分裂的;它们已经退出了细胞周期和/或分化。因此，理解MT细胞骨架在这些环境中如何组装和调控至关重要。这些知识对于揭示不同机械交流结构如何建立以支持专门细胞功能至关重要。

果蝇黑色胃肠卵母细胞为研究中心体MT的组织和功能提供了强大的系统。在卵子形成中期，中心体活性减弱^9，MT由位于卵母细胞前外侧皮层的ncMTOCs产生（见图1B）。该MT网络对于母体mRNA、蛋白质和细胞器定位至关重要，而这些细胞器又对未来胚胎轴的建立^{和发育至关重要。}先前研究表明，卵母细胞的ncMTOCs由MT末端蛋白Patronin组成，Patronin与光谱板蛋白Shot形成复合体，锚定在皮层肌动蛋白细胞骨架上。有人提出MTs由切断酶（如Katanin）产生的短MT片段生长，这些酶可作为进一步MT聚合的种子¹²。类似机制也被提出在其他分化细胞中，如^神经元13，其中中心体活动减少。然而，切断产生复杂MT网络（如卵母细胞）的机制仍不充分。目前尚不清楚这些情境下的MT是主要通过基于切割的重排形成，还是切断与新生MT成核的结合。卵母细胞MT网络的复杂性使其成为研究MT如何在非主流中心体环境中生成和组织的理想系统。值得注意的是，这也对成像和分析构成挑战：卵母细胞内密集的MT网络使得使用传统免疫染色或静态成像方法难以分辨单个^MT2,14。

实时成像极大地提高了MT网络研究的能力，因为它能够实时可视化MT聚合事件，为MT生长的动态和方向提供了关键见解。以往的研究已成功通过对加端标记^14、15、16的实时成像分析了卵母细胞中MT的生长动态。然而，在许多情况下，用于量化MT动力学的图像分析程序仅被简要描述，依赖定制或实验室特定的实现，或未公开，从而限制了重复性和更广泛的采用。我们的方法基于这些先前方法，提供一个完整文档化、公开且用户友好的分析流程，实现跨数据集和实验条件的MT增长参数的标准化量化。在该方案中，MT动态在中期卵生成处成像，即MT细胞骨架被中心体MT网络组织。生长中的MT通过EB1-GFP（一种MT加端追踪蛋白^17,18）进行可视化，并通过激光扫描共聚焦显微镜和高速模式的阵列探测器采集。我们方法的新颖之处在于其图像分析：一个完整文档化、用户友好的逐步流程，用户只需选择感兴趣的区域。图像处理和量化通过定制斐济宏和Python脚本实现，使得对EB1彗星的高效且可复现的探测和参数提取，包括生长方向、速度和空间组织。该框架提供了一个标准化且易于访问的工具，用于比较不同实验条件下的MT动力学。

在本论文中，我们应用该方法比较对照卵母细胞和冷处理去聚卵母细胞中的MT生长情况。这既有助于验证该方案，也支持未来研究，旨在解析候选蛋白在MT调控中的作用。

Protocol

1. 果蝇遗传学

注意：为了在卵母细胞中可视化MTs，本方案使用公开的转基因（材料表），表达带有GFP（绿色荧光蛋白）^标签的MT加末端追踪蛋白EB1。EB1-GFP特异性结合生长中的MT及其末端，表现为沿聚合方向移动的荧光“彗星”^17,18。这使得MT的生长动态能够可视化和量化，包括生长方向、速度和卵母细胞内的空间分布^14,20。

1. 所有蝇株均置于标准玉米粉琼脂培养基，温度为25°C，采用标准果 蝇 饲养技术。
2. 将携带针对目标蛋白表达的UAS-RNAi转基因的8–12只处女雌蝇交配给5只基因型matα4-Gal4-VP16的雄蝇;EB1-GFP。
   注意：为了简化遗传杂交，通过将V32-Gal4线（插入第二条染色体）与EB1-GFP线（插入第三条染色体）交叉生成果蝇株。由于EB1-GFP受UASp启动子控制，V32-Gal4驱动因子可诱导EB1-GFP以及后续杂交中引入的任何UAS-RNAi转基因表达（如有需要）。
3. F1后代（后代）孵化后，选择10至15只目标基因型（少于一周龄）的雌蝇。
4. 将雌虫和2–3只雄鼠转移到一个新鲜的小瓶中，瓶子上覆盖少量酵母膏。酵母膏能刺激卵子生成，促进卵室发育。雄性的存在确保了交配，同时促进卵母细胞的成熟和产卵。将蝇数保持在25°C两天。
   注意：为了研究特定基因在MT动态中的作用，可以通过使用UAS/GAL4系统²¹实现蛋白质敲低，并结合公开的母体驱动因子matα4-Gal4-VP16（也称为V32-Gal4;材料 表），该方法从卵生成的第3至4状态开始在生殖系中启动Gal4表达。如上所述，该驱动因子诱导EB1-GFP及UAS-RNAi构造的表达，使目标蛋白仅在胚粒期之后才能被耗尽。该策略绕过了目标蛋白在初始有丝分裂和卵母细胞指定过程中的潜在早期功能。进行此类实验时，应按前述方式准备飞蝇。

2. 卵巢夹层

1. 在标准飞垫上用二氧化碳麻醉F1雌性，并选取一名雌性进行解剖。
2. 将选定的雌鱼直接转移到一个35毫米玻璃底盘（玻璃厚度为0.13–0.15毫米）上，并在蝇子顶部滴一滴成像油。
3. 将飞蝇朝下（翅膀朝下）放置腹部。用一把镊子轻轻夹住下胸部，再用另一把镊子夹住腹部后端的一点腹部表皮。
4. 小心地从开口处拉出生殖道，轻轻取出。
5. 用镊子轻轻将卵巢和单个卵巢滑入油中，分离它们。操作卵巢时，始终将卵巢靠近较早的卵室（第13-14期），以避免损伤更脆弱的中期（第6-9期），这也是影像学中关注的部分（见图1A，B）。
6. 抓住卵巢前端，那里有天竺菌和早期卵室（见图1A，B）。缓慢而稳定地施加拉力，分离单个卵巢。拉动时，卵室会在不同发育阶段出现。该过程可以在同一卵巢重复多次，以分离出额外的卵巢²² （见视频演示）。
   注：对于经过冷处理以解聚MT的卵母细胞，解剖过程按前述方式进行，但使用BRB-80缓冲液代替成像油。剥离后的卵巢随后转移到含有BRB-80的微管中，并在冰上孵育15分²³秒。孵育后，卵巢被转移到带有成像油的玻璃底盘中，随后从第3.1步恢复方案。

3. 实时成像

1. 用合适的载玻片支架将玻璃底盘放置在显微镜台上。
2. 选择第7或第8期的卵室进行成像。
   注意：这些阶段的卵室可根据卵母细胞大小和核位置识别。卵母细胞明显大于单个护士细胞，约占卵室三分之一（第7阶段）至第8阶段的一半。卵母细胞核位于卵母细胞的前皮层，紧邻护士细胞²⁴。
3. 避免拍摄显示卵泡细胞外层不连续或其他损伤迹象的卵子腔，这些可能表明产钳造成的机械性破坏。为了获得最佳图像质量，使用具有高信噪比（SNR）的快速共聚焦成像系统，配备63倍物镜（1.40 NA，油浸）。确保你遵循奈奎斯特-香农采样标准。
4. 调整焦点并确定合适的曝光，因为曝光可能因所用EB1构造（如不同启动子或荧光标签）和显微镜系统而异。信号应足够明亮以追踪彗星动力学，但不应被背景荧光饱和或遮挡。
5. 将488纳米激光设置为激发GFP荧光团（10%激光功率;探测器增益=750 V）。为GFP荧光团选择合适的发射窗口，范围为500–550 nm或等效滤光片组。
6. 获取时长至少4分钟的延时影片，使用500毫秒（2帧/秒）的帧间隔，以获得足够的数据来跟踪单个MT及其结束。（补充视频1，展示了一种代表性的时间流逝采集，适合后续MT跟踪分析。）
7. 使用显微镜采集软件中的阵列探测器处理，使用默认的滤波器强度处理采集到的图像。
   注意：浸泡在成像油中后，剥离后的卵巢可存活长达90分钟。在此期间，卵室可成像且无明显退化迹象。此期结束后，应解剖新雌虫，并准备新鲜卵室^{进行成像。}

4. 图像处理

执行以下工作流程生成图表和统计数据，以量化与MT动力学相关的各种参数。通过宏/脚本自动执行每一步，或按照协议手动执行（见图2）。该工作流程中使用的所有斐济宏、跟踪脚本和 Python 分析代码均作为 补充编码文件 1–7 提供。

1. 图像预处理 - 步骤1
   以下步骤通过校正光漂白和减少背景噪声来准备原始延时摄影图像，确保信号稳定性以便跟踪。首先，EB1的可见性通过高斯差分（DoG）滤波器增强，该滤波器起到空间带通滤波器的作用。通过从轻微模糊图像中减去高度模糊的图像，该过程抑制了低频细胞质雾霾和高频像素噪声，同时隔离EB1彗星的衍射极限信号。其次，应用时间梯度滤镜以增强生长的MT尖端。图像堆栈被重新切片，将时间维度映射到空间Y轴。然后应用一个核为[-1 0 1]的一维卷积，计算每个像素的时间导数，突出显示亮度增长最快的运动彗星前缘。然后，堆栈会被重新切回原始尺寸，合并到复合图像中，并导出用于分析。
   注意：此步骤可以通过拖拽宏文件 File1.Step1_MTs_macro.ijm （补充编码文件1）进入斐济并运行宏。
   1. 前置插件安装（一次性设置）
      1. 斐济启动。在菜单栏中进入 插件>安装 。
      2. 在文件浏览器中，选择随该协议提供的 File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar （补充编码文件7）文件。
      3. 当被要求保存插件时，确保目的地是你斐济安装目录内的默认插件文件夹，然后点击 保存。
      4. 重启斐济 以完成安装。
         注意：该编译版本与斐济内置版本相同，但取消了单独安装 Java 开发套件（JDK）的需求，简化了设置流程。
   2. 漂白剂校正与降噪：
      1. 打开斐济，然后用Bio-Formats导入插件打开每个文件
      2. 通过运行漂白剂校正插件（使用简单比漂白剂校正，背景=0）来补偿荧光衰减。
      3. 运行卡尔曼堆栈滤波器编译（卡尔曼堆栈滤波器编译）（acquisition_noise = 0.1;偏置 = 0.7），以抑制随机光子噪声，同时保持真实信号动态随时间变化
      4. 如果需要，可以裁剪图像时间维度以减少处理时间。
         注意：这些步骤生成去噪图像，随后在步骤1结束时（4.1.5）（图3A）显示为通道1。建议排除前5到10帧（时间点），因为卡尔曼滤镜的滚动窗口只部分过滤这些初始帧。
   3. 高斯分布器（DoG）的特征增强差异：
      1. 复制4.1.2.4版本中的图片两次（右键点击图片并点击复制）。
      2. 用低σ（σ = 1）对一个副本应用高斯模糊插件。
      3. 用高标准差（σ = 8）对另一份副本应用高斯模糊插件。
      4. 打开插件图像计算器，从低西格玛图像中减去高西格玛图像（= 低西格玛 – 高西格玛），以分离出细致细节。
      5. 如果需要，使用斐济的数学减法>去除背景，并选择一个值（DoG阈值=100），只保留真实信号。
         注意：这些步骤生成一个高斯差分图像，随后在步骤1结束时（4.1.5）以通道2的形式出现（图3B）。
   4. EB1-GFP信号增强：
      1. 从4.1.2.4中选择图片，使用Reslice插件，设置为：顶部，禁止插值。
      2. 使用带有内核 [–1 0 1] 的 Convolve 2D 插件来增强 MT 技巧。
      3. 用同样的设置再用Reslice插件恢复原始图片尺寸。
      4. 注意：这些步骤将生成具有增强EB1-GFP信号的图像。该图像随后会在步骤1结束时（4.1.5）（图3C）以通道3的形式出现。
      5. 合并频道并导出图片：
         1. 使用合并通道插件将MT EB1-GFP图像（4.1.2.4）与高斯差分图像（4.1.3.5）及EB1-GFP信号增强图像（4.1.4.3）合并。确保在合并过程中，用于进一步分析的图像放置在通道3。
         2. 将生成的文件保存为.tif文件，使用命名格式：“filename”_processed.tif。确保用于下游分析的图像以_processed.tif结尾
2. 关注区域（ROI）- 第二步
   在此步骤中，将沿卵母细胞前后轴定义三个ROI：前轴（ROI1）、中轴（ROI2）和后轴（ROI3）。进行这种空间分割，以便分析卵母细胞不同区域的MT动态。
   注意：此步骤2可对每个“文件名”执行_processed.tif方法是将宏文件File_2_Step2_MTs_macro.ijm（补充编码文件2）拖到斐济并按运行。宏会提示用户手动在卵母细胞中绘制矩形。最接近多边形起始点（第一次点击）的区域对应第一个ROI。所选矩形区域将自动被划分为相等矩形投资回报率。如果没有保存投资回报率，下一步会在完整图像中运行。
   1. 定义投资回报率：
      1. 通过插件→生物格式→生物格式导入器打开目标文件。
      2. 使用多边形工具绘制一个跨越目标区域的兴趣区域。
      3. 将选定的区域添加到ROI管理器中（按T键）。
      4. 重复步骤4.2.1，确定你需要多少投资回报率。
   2. 测量与出口面积：
      1. 选择第一个投资回报率
      2. 运行分析 → 测量，并将 Area 值保存为名为“filename”的文件_processed_RoiArea.csv。
         注意：文件名必须与原始图片名称一致，结尾为：_processed_RoiArea.csv
      3. 使用ROI管理器来保存投资回报率。使用相同的文件名和 the.单一ROI的ROI扩展，还是多ROI的.zip扩展。
3. 探测和跟踪EB1-GFP彗星 - 步骤3
   使用TrackMate插件²⁵ 来检测EB1-GFP彗星并跟踪它们随时间的移动。
   注意：步骤3可以通过拖拽宏文件File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py（补充编码文件3）进入斐济并按运行来应用到每个“文件名_processed.tif”上。然后选择一个文件夹进行处理。投资回报率会自动加载，分析将针对每个文件进行，生成相应的点位和跟踪输出。在批量处理前，建议分析2至3张代表性图像，以目视验证默认探测器和跟踪器的设置是否适合彗星的大小和动态。如果设置合适，用户可以调整相关参数，准确跟踪EB1线索，从而最大限度地减少误报和假阳性。
   1. 通过 Plugins → Bio-Formats → Bio-Formats 导入器打开目标文件
   2. 打开TrackMate插件。如果被要求交换T和Z，选择“是”。
   3. 选择日志检测器。将颗粒直径设置为0.5微米（根据需要调整）
   4. 将质量阈值设置为30（根据需要调整）。同时启用子像素定位和预处理，并设置中间滤波器。
   5. 去除任何额外的局部过滤。选择卡尔曼追踪方法
   6. 初始搜索半径设为0.5，搜索半径为0.7，最大帧间隙为2（根据需要调整—— 初始搜索半径 为追踪器提供播种， 搜索半径 控制点在帧间移动的距离， 最大帧间隙 允许轨迹中短暂消失）。
   7. 跳过会出现的轨道过滤。曲目完成后，进入“Spots”→导出为CSV，并将文件命名为“filename”_ROI01_spots.csv
   8. 注意：文件命名应反映分析的投资回报率（ROI）数量。如果使用多个ROI，请保存每个输出文件并带有相应的标识符，如_ROI01、_ROI02等。
4. 数据可视化与定量分析——第四步
   使用Python脚本处理跟踪数据，计算关键参数，包括彗星数量、速度、寿命、角度一致性和方位。这些脚本生成汇总表（CSV文件）、图表和统计分析，以支持MT动力学的定量分析（图4).
   1. 软件环境设置：
      1. 安装 Python （3.12） 发行版。确保安装了以下外部 Python 库（通过 pip install pandas numpy scipy matplotlib seaborn ipython statmodels notebook）： Pandas 和 NumPy （用于数据结构处理和数值计算）、 SciPy 和 Statsmodels （特别是 scipy.stats，用于循环统计和假设检验）、 Matplotlib 和 Seaborn （用于生成玫瑰图和统计条形图）、 IPython （用于笔记本内的显示工具）、 Jupyter Notebook （用于使用笔记本）。
      2. 将自定义分析模块（File_5_MTModule1.py 和 File_6_MTModule2.py – 补充编码文件 5 和 6）放置在根目录中，与分析笔记本（文件 4_Step4_MTs_results.ipynb – 补充编码文件 4）并列。
      3. 通过在 Python 终端中运行命令“jupyter notebook”打开 Jupyter 笔记本，加载文件 4_Step4_MTs_results.ipynb – 补充编码文件 4 笔记本。
   2. 输入数据与参数定义：
      1. 填写数据库，将生物复制映射到其实验元数据。
      2. 为每个实验提供以下信息： 基名： 文件名中唯一的标识符串， 条件： 实验组（例如，“对照”、“处理”）， 校正角度： 使ROI与生物轴对齐所需的角度（例如，前方=0°）。
      3. 调整参数：导出图像格式和DPI，绘制颜色，以及用于角度计算的默认分区大小
      4. 设置数据过滤参数排除短轨道： 最小轨道长度： 时长超过此长度的轨道被丢弃
   3. 分析流程的执行：
      1. 读取并执行所有代码单元以处理原始追踪数据。脚本会遍历数据库列表，执行以下步骤：
         1. 识别与每个基地名称关联的所有ROI专用CSV文件。
         2. 基于最小长度的滤波轨迹（仅保留持续超过3帧的轨迹），计算瞬时速度，计算总位移，并对所有轨迹应用参考角度修正。
         3. 通过从元数据加载的ROI面积对彗星数量进行归一化，以计算彗星密度。
      2. 将处理过的数据汇总成主数据集（df_all），并为每个投资回报率计算通用汇总统计量（平均速度、轨道时长和角度一致性向量长度）。
      3. 执行make_combined_rose_panel函数生成分组玫瑰地块。这创建了一个对每个实验条件下所有ROI角度分布的并排面板比较。执行create_comprehensive_analysis_plots_enhanced创建标量指标的条形图。
      4. 执行run_angle_analysis_pipeline函数以进行特定的方向分析：
         1. 将轨道分类为方向箱，采用两种策略：基本分拣（4个90°宽度的箱子：北/前、东/右、南/后、西/左）和前/后分箱（2个180°前方与后方）。
         2. 计算每个卵母细胞在每个定义方向下移动的路径百分比。
   4. 统计分析与产出生成：
      1. 通过定义的标量指标迭代：每帧每个区域的平均彗星数量、平均彗星轨迹持续时间和平均彗星速度。对于每个度量，它执行：
         1. 进行 Kruskal-Wallis 或 Mann-Whitney U 检验，以实现不同实验条件下的独立比较。
         2. 进行Friedman或Wilcoxon检验以评估各投资回报率的一致性。
         3. 使用普拉特方法进行弗里德曼和威尔考克森签名秩检验，评估每个投资回报率内的朝向偏好（例如北向与南向）。
         4. 将以下结果导出到结果目录：摘要CSV（metrics_table.csv、track_table.csv、roi_metrics.csv）、统计报告（例如平均彗星velocity_mwu.csv）和图（高分辨率PNG文件）。
            注意：第四步只能在 Python 中执行。打开File_4_Step4_MTs_results.ipynb，读取并执行所有单元格。每个单元包含执行指令和相应预期结果。

5. 统计分析：

注意：由于跟踪数据分布非高斯分布，所有比较均采用非参数统计检验。

1. 使用Mann-Whitney U检验（两组）或Kruskal-Wallis检验，随后进行事后两两对比较（针对>组）评估实验条件间的独立差异（如对照组与处理组）。
2. 使用弗里德曼检验（全局差值）和威尔考克森签名秩检验（两两）评估同一投资回报率内的取向偏好。
3. 使用普拉特法处理零差平局。
4. 将两两比较报告为未校正的p值，以保持统计功效。使用提供的脚本报告原始和调整后的p值，显著性设为0.05。除非另有说明，所有汇总统计数据均值±均值标准误（SEM）报告）。

Results

该方案已成功利用EB1-GFP（一种标记MT活性聚合位点的末端追踪蛋白）分析果蝇黑胃肠卵母细胞在卵生成中期的MT生长动态和极性（^17,18）。当通过激光扫描共聚焦显微镜成像时，EB1-GFP呈现为明亮、点状的“彗星”，沿^{MT生长方向}运动（见图3A;补充视频1）。追踪和量化这些彗星可以精确评估MT的成核、伸长和卵母细胞组织。利用该工作流程，对对照卵母细胞及受实验扰动MT网络的卵母细胞进行了MT动态评估。具体而言，EB1彗星行为在三种条件下进行了比较：未处理对照卵母细胞、冷处理对照卵母细胞和冷处理杂合p特龙素突变卵母细胞^12,26。冷处理可诱导MT去聚合，从而在恢复过程中评估MT再生。将杂合p特氨酸突变体（+/patr⁰⁵²⁵²）卵母细胞纳入为MT动力学受损的阳性对照。Patronin是一种保守的MT减末稳定蛋白²⁷，是卵母细胞¹²及^其他组织ncMTOCs的核心成分。先前研究表明，受MT去聚合的主托素突变体在再生¹²彗星后EB1彗星数量显著减少。因此，加入杂合囊摄蛋白突变体使该方法在已知MT再生缺陷背景下得到验证。在中心体减弱并通过中心体通路生成MT时，对第7-8期卵母细胞进行了成像。

与之前的观察一致，EB1彗星密度最高的是在卵母细胞前部，向后部逐渐减少，^14,15（见图5B;表1;补充表1和表2）。为区分真正的MT聚合事件与驻止或面外信号，该协议区分检测到的EB1-GFP焦点总数和运动焦点子集。不动的部分很可能代表静止的彗星或主要沿轴面运动的彗星（图5A，B）。MT轨迹长度和生长速度的分析仅针对移动的EB1-GFP彗星进行，以避免包含可能干扰轨迹长度和速度估计的静止信号或轴向运动。EB1-GFP总焦点和运动分数分别以图表显示，以便直接比较整体检测与动态行为（图5A，B）。在对照卵母细胞中，方案在前部区域测得0.189 ±0.02 SEM EB1运动彗星/^μm²（18.9 EB1彗星/100^微米²），其次是中部和后部区域0.064±0.02 SEM和0.04±3 SEM EB1运动彗星/^μm²（6.4和4.3 EB1彗星/100^微米²）（见图5B;表1;补充表1和表2）。此前一项²⁸项研究测量了同一发育阶段的EB1彗星，探测到48.54颗EB1彗星/100微米^²，高于本次探测到的运动EB1-GFP彗星的数值。然而，考虑到探测到的EB1-GFP彗星总数，测量值是一致的（见图5A;表1;补充表1和表2）。该研究的材料与方法部分未说明用了多少个z堆叠来成像卵母细胞。因此，分析中可能包含了多个z-堆栈，这可能导致EB1-GFP彗星数量增加。另一个可能影响报告数值的因素是用于彗星定量的卵母细胞区域。如果将感兴趣的区域选在最前端极点附近，即EB1彗星密度最高的区域，可能会比这里展示的测量结果更高。尽管如此，这里得到的结果与之前报告的相同数量级，且一致反映EB1彗星密度向后方区域的下降，^14,15。

在冷诱导MT再生后，对照卵母细胞的EB1彗星数与未处理对照组相当，显示MT恢复良好。相比之下，与之前报告一致的¹²，帕特罗宁突变体在前部区域（ROI1）活动性EB1彗星数量显著减少，与两组对照组相比（见图5B;表1;补充表1和表2）。尽管中后区域（ROI2和3）的彗星数量也呈下降趋势，但这些差异在统计学上并不显著（见图5B）。此处观察到的减少幅度低于基于诺可达唑的¹²检测报告。这很可能反映了使用杂合父蛋白突变体，其中只有一个等位基因发生突变。此外，冷诱导脱聚协议可能无法完全去聚所有MTs，且从冰中移除与成像之间的5–15分钟间隔可能允许MT在数据采集前实现部分成核和再生。相比之下，诺可达唑基的检测法在colcemid失活后立即使用显微镜紫外激光¹²进行。尽管如此，这些结果表明该方案能够检测MT组织中生物学相关、区域特异性的变化。它们还与ncMTOCs和Patronin（ncMTOC核心组分）在卵母细胞前部的富集相符。中后部彗星数量减少较弱，也可能反映了在这些阶段后皮层中ncMTOCs和Patronin发育性排除。

对对照卵母细胞EB1轨迹长度的分析显示，卵母细胞前部的彗星轨迹较长（0.613微米±0.04 SEM），而中部和后部的彗星较短（分别为0.463 μm ±0.04 SEM和0.488 μm ±0.05 SEM）（见图5C;表1;补充表1和表2）。这一发现与之前的数据一致，显示MT在后极的存续时间比前极短，表明后极MT的^{持续时间更短}。在冷处理的杂合子父系蛋白突变卵母细胞中，EB1彗星长度在前后区域显著减少。在中部区域也观察到类似的非统计学显著趋势（见图5C;表1;补充表1和表2），暗示MT稳定性部分降低。综合来看，这些结果支持了Patronin作为负端MT稳定剂的已知作用，并且与此前在果蝇培养细胞中观察到的观点一致，在果蝇培养细胞中，Patronin的流失导致MT纺锤变短^12,27。这些发现也凸显了该方案在检测MT动力学中微妙但生物学意义显著扰动方面的敏感性。

在测量对照卵母细胞中的EB1彗星速度时，分析在前、中和后区分别检测到0.208±0.01微米/秒、0.207±0.01微米/秒和0.202±0.01微米/秒的平均速度（见图5D;表1;补充表1和表2），与之前的研究^14、15相符。对照组卵母细胞从前部到后部的MT生长速度略有下降。这可能反映了ncMTOCs以及可能的其他未识别微管相关蛋白（MAPs）在前外侧区域的富集，这些蛋白促进MT的生长和伸展，从而促成观察到的后部减少。在冷处理的卵母细胞中，囊蛋白杂合突变体相比对照组表现出MT生长速度略有下降的非统计学显著趋势，尽管这一差异未达到统计学显著性（图5D;表1;补充表1和表2）。这一发现与此前在表达主保素突^变体的果蝇神经干细胞中的观察结果一致。

ncMTOCs位于卵母细胞前外侧区域，并排除其后部，导致大多数MT生长时负端锚定在前外侧皮层。因此，卵母细胞内形成前后梯度，方向偏差适中：60%的MT向后生长，40%向前¹⁴生长。我们的方案成功检测到卵母细胞所有区域对照卵母细胞的偏置（见图5E）。MT方向偏向在后部区域更为明显，如先前报道的¹⁴。值得注意的是，这种后置富集方向偏倚在冷处理后，对照组和杂合子主护蛋白突变卵母细胞的消失（见图5E，F）。在冷处理的对照卵母细胞中，MT的生长方向在所有区域均向前导向。这一变化在前部和中部区域呈现为趋势，并在后部区域具有统计学显著性（见图5F）。这种偏向后侧偏移的一种可能解释是，在冷处理条件下，新聚合的MT可能需要时间与促进MT稳定和/或交联的MAPs结合，如马达蛋白。这些因素的延迟招募可能削弱后导向多发性增强。总之，该方案能够对卵母细胞内MT的生长、长度、速度和方向进行灵敏且定量的分析。它可靠地检测到区域特异性、具有生物学意义的MT动态变化，这与以往研究一致，并展现出对MT行为细微差异的敏感性，这一点在杂合p特罗素突变体中观察到的现象中得到了体现。

图1： 果蝇 黑胃蛋卵生成 （A） 果 蝇 卵巢卵生成概述。 每个卵巢包含12至16个卵巢，作为卵子生产线。卵子发生始于生殖器，2–3个生殖系干细胞不对称分裂，产生干细胞和子细胞，子细胞开始分化。这些细胞经过4次有丝分裂，形成一个由环状管连接的16细胞囊肿。从这些细胞中，一个细胞成为卵母细胞，其余则作为护养细胞，支持卵母细胞的生长和发育，最终发育到后端的第14期卵母细胞。 （B）果 蝇 第9阶段卵室的示意图。MT 由位于前外侧皮层的 ncMTOC 产生，而这些 ncMTOC 被排除在卵母细胞¹² 的后侧。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：协议工作流程图。 从卵巢剥离和实时成像到彗星跟踪和定量分析的主要步骤概述。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3：通过处理第7至第8期卵母细胞生成的代表性图像。 （A-E）展示第一步图像处理流程的代表性图像，应用于对照、冷处理和杂合 囊性蛋白⁰⁵²⁵² 冷处理卵母细胞的第7–8期卵母细胞。通道是从每帧0.5秒拍摄的150帧延时电影中，最大投影2帧的代表图像。 （A） 通道1，对应于从相应成像的卵母细胞生成去噪图像。（B） 通道2，对应于生成高斯图像的差分。（C） 频道3，对应生成图像，增强EB1-GFP彗星信号以显示彗星尖端。（D） 通道2和通道3合并，有助于可视化通道2处理产生的彗星尖端。（E） 通过时间色彩编码插件在斐济时间流逝C生成的EB1-GFP彗星轨迹，以展示MT动力学。颜色编码表示20帧的时间投影（帧间隔0.50秒）。比例杆 = 10微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：STEP 4 Jupyter Notebook 中一个部分的截图。 笔记本由Markdown单元组成，提供自明的指令，随后是输出实时结果和日志的代码单元。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：对对照和冷处理第7-8期卵母细胞中EB1-GFP彗星动态分析。 数据代表对照组、冷处理和管氨酸⁰⁵²⁵²个卵母细胞±SEM平均值（ROI1–ROI3）。EB1-GFP彗星的测量来自斐济处理的延时影像;除非另有说明，分析均针对Channel 3处理的图像进行。通过Channel 2图像（DoG图像）分析了EB1-GFP彗星总数。统计显著性评估采用Kruskal–Wallis检验后接Mann–Whitney事后比较，或Friedman检验后进行Wilcoxon匹配对检验（p < 0.05;p < 0.001;p < 0.0001）。（A） 散点图，显示EB1-GFP彗星总数的平均数。（B）散点图，显示运动能力较高的EB1-GFP彗星平均数量。（C） 散点图，显示EB1-GFP彗星轨迹的平均长度。（D） 散点图，显示EB1-GFP彗星的平均速度。（E）玫瑰图，显示对照组（n=14）、冷处理（n=12）对照组（n=12）和patronin⁰⁵²⁵²冷处理（n=11）卵母细胞中EB1-GFP轨迹的方向。每个卵母细胞中，向前（A）或后（P）方向的每条路径的平均百分比，适用于每种病症及其投资回报率（ROI）。（F）柱状图，显示EB1-GFP彗星轨迹角度中朝向卵母细胞前后侧的平均百分比。百分比计算为每个卵母细胞，代表每个ROI内彗星方位的相对分布。请点击此处查看该图的放大版本。

度规	投资回报率	控制（n=14）	冷处理对照组（n=12）	Patronin05252 冷处理（n=11）
EB1-GFP彗星总数（#/μm²）	ROI 1（前方）	0.667 ± 0.18	0.691 ± 0.20	0.570 ± 0.17
	ROI 2（中间）	0.394 ± 0.11	0.532 ± 0.15	0.400 ± 0.12
	ROI 3（后部）	0.353 ± 0.09	0.561 ± 0.16	0.378 ± 0.11
动量EB1-GFP彗星编号（#/μm²）	ROI 1（前方）	0.189 ± 0.02	0.175 ± 0.03	0.099 ± 0.03
	ROI 2（中间）	0.064 ± 0.02	0.091 ± 0.02	0.056 ± 0.02
	ROI 3（后部）	0.043 ± 0.01	0.104 ± 0.03	0.047 ± 0.02
EB1-GFP 彗星轨迹长度（μm）	ROI 1（前方）	0.613 ± 0.04	0.621 ± 0.03	0.478 ± 0.07
	ROI 2（中间）	0.463 ± 0.04	0.535 ± 0.03	0.410 ± 0.05
	ROI 3（后部）	0.488± 0.05	0.543 ± 0.04	0.393 ± 0.05
EB1-GFP彗星速度（μm/sec）	ROI 1（前方）	0.208 ± 0.01	0.198 ± 0.01	0.188 ± 0.01
	ROI 2（中间）	0.207 ± 0.01	0.199 ± 0.01	0.186 ± 0.01
	ROI 3（后部）	0.202 ± 0.01	0.194 ± 0.01	0.177 ± 0.01

表1。 EB1-GFP彗星在分析卵母细胞前后区域的测量总结。 测量数据来自对照组、对照冷处理和杂合 囊摄素⁰⁵²⁵² 冷处理卵母细胞。关注区域定义为ROI1（前侧）、ROI2（中侧）和ROI3（后侧）。

补充表1。EB1-GFP彗星在不同实验条件下的测量统计分析。 P值表示对照组、冷处理对照组和杂合 型囊红蛋白⁰⁵²⁵² 冷处理卵母细胞在每个ROI（ROI1-ROI3）中的差异。三种条件之间采用Kruskal–Wallis检验进行全局比较，随后进行两两Mann–Whitney事后比较。 请点击这里下载此文件

补充表2。EB1-GFP彗星在各实验条件下ROI测量值的统计比较。P值显示对照组冷处理卵细胞中ROI1（前置）、ROI2（中间）和ROI3（后置）之间的差异。使用弗里德曼检验评估各病症内投资回报率的总体差异。随后，使用Wilcoxon匹配对符号排名检验进行了ROI间的两两比较。请点击这里下载此文件

补充视频1。 对对照阶段7–8卵母细胞的加端追踪蛋白EB1-GFP进行延时成像，展示了适合后续MT跟踪分析的代表性采集（见图3）。 请点击这里下载此文件

补充编码文件1： File_1_Step1_MTs_macro。我。用于图像预处理的Fiji/ImageJ宏。它通过高斯差分（DoG）滤镜自动进行光漂白校正、卡尔曼滤波和背景减法。它还采用时间梯度增强（重新切割和一维卷积）来锐化 MT 笔尖的前缘，以提升追踪精度。 请点击这里下载此文件

补充编码文件2： File_2_Step2_MTs_macro.ijm。Fiji/ImageJ 宏用于半自动化兴趣区域（ROI）定义。它会提示用户定义卵母细胞边界，并自动将选择划分为等距区（在我们的示例中为三个区：前区、中区和后区），以便分析区域分层。 请点击这里下载此文件

补充编码文件3： File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py。一个Python脚本（在Fiji/ImageJ中执行），利用Trackmate自动跟踪EB1彗星。它批量处理预处理图像，利用定义的质量参数检测彗星，将其关联到轨迹中，并将原始坐标数据导出为CSV文件。 请点击这里下载此文件

补充编码文件4： File_4_Step4_MTs_results.ipynb。一台Jupyter笔记本，作为定量分析的主要接口。它加载原始跟踪数据，执行分析流程，生成所有最终输出，包括玫瑰图、统计汇总表以及彗星密度、速度和寿命的比较图表。 请点击这里下载此文件

补充编码文件5： File_5_MTModule1.py。一个自定义的Python模块，包含用于数据提取和基础几何计算的基础实用函数。它包括查找投资回报率文件、计算瞬时速度以及计算基本角度位移的函数。 请点击这里下载此文件

补充编码文件6： File_6_MTModule2.py。一个包含高级分析和可视化功能的自定义Python模块。它包含了方向分析流程（基数与轴向分箱）、稳健统计检验（Friedman/Wilcoxon与Pratt方法）以及生成发表质量极坐标（玫瑰图）的算法。 请点击这里下载此文件

补充编码文件7： File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar。用于预处理宏中的降噪步骤，需要一个编译好的 Java Kalman 滤波器插件（Fiji/ImageJ）。该独立版本无需单独的 Java 开发工具包（JDK），简化了用户的软件设置。 请点击这里下载此文件

Discussion

卵母细胞MT动态的实时成像面临独特挑战，因为需要高质量的数据集和定量分析来提取有意义的信息。虽然以往研究报告了^14、15、16的实时成像方法，但图像分析步骤通常高度定制化，且方案缺乏足够的细节以保证重复性。因此，缺乏广泛成像或计算专业知识的研究人员在重复这些分析时可能会面临障碍。为应对这些挑战，开发了一套简化的工作流程，将高分辨率 Airyscan 实时成像与用户友好的自动宏和脚本相结合。该管道能够高效探测和跟踪EB1彗星，随后对MT的朝向、速度和空间组织进行定量分析。通过减少人工干预并提供清晰的分步骤说明，该工作流程促进了卵母细胞MT动力学分析的可及性和可重复性。

卵巢清扫和样本准备是关键的第一步。卵母细胞必须仔细解剖以避免机械损伤，影像时间应限制在90分钟以维持存^活。阶段选择很重要：卵子在卵生成中期后，卵母增大并在细胞质中积累卵黄，这使得在第9阶段以后，EB1信号的可视化变得越来越困难。因此，第9期之后的影像检查不建议²⁰期。此外，为了可重复的定量，尽可能推荐大小相当的卵母细胞，因为这确保了定义的兴趣区域对应样本间的前后位置。

温度控制对于重复性至关重要。蝇类库存应保持在标准培养条件下（25°C），以支持正常发育和EB1-GFP表达一致，尤其是在使用对温度变化敏感的GAL4/UAS系统时。成像过程中的温度稳定性同样重要，因为变化会影响MT的动态。虽然不要求使用温控腔室，但建议在采集过程中避免温度波动。

在图像采集方面，选择阵列探测器共聚焦成像，因其高灵敏度和更好的信噪比，从而最大限度地减少了采集后去噪的需求。应使用高数值孔径物镜（尽可能高）配合适当的折射率匹配，以最大化横向和轴向分辨率，这对于解析密集网络中的单个彗星至关重要。此外，应遵循奈奎斯特-香农³⁰ 采样标准，在XYZ和时间上保持一致，以避免彗星追踪的准确性损失。同样重要的是沿z轴精确选择成像平面。成像过深会导致光散射导致荧光损失，而仅限于皮层表面采集则无法捕捉EB1彗星的完整动态。最有信息量的数据出现在中间的z位置。应避免使用核位于选定平面内的卵母细胞，因为核室会取代大部分细胞质，且缺乏EB1轨迹，从而减少可探测彗星数量。

虽然该分析流程针对阵列探测器共聚焦成像进行了优化，但对硬件无关，并且兼容其他方式，如旋转盘共聚焦显微镜。然而，用户应注意，NA或SNR较低的系统可能需要调整宏的预处理参数（如噪声容忍度/DoGσ），可能导致彗星探测密度低于本研究中呈现的数值。尽管各系统间绝对值可能不同，实验条件与投资回报率（ROI）之间的相对趋势仍保持稳健。

鉴于卵母细胞庞大的三维结构，二维成像仅捕捉MT网络的光学部分。因此，沿z轴陡峭运动的彗星可能会离开焦平面，可能导致路径寿命和绝对速度被低估（因为仅测量速度矢量的xy分量）。然而，对整个卵母细胞进行高速三维体积成像需要更小的视场（FOV）、更短的曝光时间和更快的探测器响应时间，从而降低信噪比并将采集时间分散到多个z切片，从而降低追踪快速EB1彗星所需的时间分辨率。为减少不动彗星和失焦伪影，采用卷积滤镜和最小轨时长滤镜（不含3帧<轨道），以消除穿越焦平面的瞬态点。此外，由于这一几何限制在实验条件下均匀适用，观测到的彗星密度、速度和方位的相对差异依然稳健。虽然像光场显微镜这样的新兴技术理想情况下应同时捕捉完整的三维结构，但它们尚未广泛普及。尽管如此，所有MT动力学参数的测量值与以往报告一致，表明该方案适合在不同实验设置中研究MT动力学。

在使用该协议中的宏之前，建议手动处理前几张图像，以确保软件参数得到正确优化。成像分辨率、放大倍率、信噪比、帧率以及数据是单平面还是Z堆栈等因素都会影响跟踪精度。在目视检查结果轨迹的同时，反复调整参数，以最小化假阳性和假阴性。优化完成后，应在数据集间一致应用参数以确保可重复性。

最后，应注意生物学解释的一些局限性。EB1-GFP选择性标记生长中的MT加末端，因此报告的是活性MT聚合位点，而非整个MT群体。成像期间存在的稳定、非聚合性MT无法通过此方法检测到。虽然这一限制在中卵生成卵母细胞中限制较小，因为大多数MTS高度动态，但在将该方案应用于其他具有大量MT稳定群体的细胞类型（如^神经元）时应考虑这一点。

总之，这一工作流程使果 蝇 卵母细胞MT动力学的高效定量分析成为可能。通过集成优化解剖、阵列探测器共聚焦实时成像和自动化分析工具，它提供了一种严谨且易于理解的中心体调控因子研究方法。虽然该方法主要在卵母细胞中得到验证，但其原理经过优化后可适用于其他细胞类型，包括神经元和上皮等非分裂细胞，为遗传筛选和MT组织机制研究提供了可扩展的平台。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
杜蒙特 #5 镊子	Fine Science Tools	11252-20
EB1::GFP	法国CNRS雅克·莫诺研究所Antoine Guichet博士		基因型：w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.0-14-C
Matα4-Gal4-VP16	Bloomington果蝇资源中心	7062	基因型：w[*]; P{w[+mC]=matα4-GAL-VP16}V2H
油 10S, VOLTALEF	VWR化学品	24627.188
Patronin 突变体	Bloomington果蝇资源中心	16647	基因型：y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
w1118	Bloomington果蝇资源中心	3605
Zeiss LSM 980 带 Airyscan 2	Zeiss