SVF富集微脂的机械加工，用于创伤性软组织缺损重建

Summary

本方案描述了一种可重复的方法，用于从自身脂肪组织中机械处理的SVF富集微脂，并将其注射到腔状创伤性软组织缺损中，用于临床重建。

Abstract

创伤性软组织缺损因组织流失、血管受损以及难以实现持久覆盖而对重建构成重大挑战。脂肪组织提供了实用的自身组织来源，机械处理的基质血管分数（SVF）富集微脂可在术中制备，无需酶促消化。
本研究提出了一套标准化的临床方案，用于采集自身脂肪组织并将其加工成SVF富集微脂肪，注射到空腔型创伤性软组织缺损中。脂肪在大腿或腹部的低负压下手工采集，通过切割和注射器乳化机械碎块，过滤以达到均匀的微脂稠度，并离心分离含SVF的部分。加工过的微脂以多层方式注入整个伤腔。术后评估包括连续临床评估、照片记录以及伤口面积缩小的测量，直至上皮化。
在一个小队列中，该方法与伤口逐渐收缩和约4-8周内完全上皮化相关，且无重大并发症。虽然细胞组成和存活率尚未被量化，但该技术提供了一种适用于无酶处理或实验室设施的可行术中方法。该方案提供了一种实用且最小作的输注SVF微脂方法，用于管理创伤性腔体缺损，并可能成为进一步对照研究的基础。

Introduction

创伤性腔体软组织缺损仍是主要的重建挑战，因为它们结合了组织损失、局部灌注受损以及感染和死腔形成的高风险。传统覆盖技术，如分层皮肤移植或皮瓣移植，在许多情况下能提供持久的覆盖。然而，它们常受供体部位发病率、技术复杂性和长期结局的多样性限制，尤其是在受污染或瘢痕化床区^1,2,3。

脂肪组织是异质细胞群（称为基质血管分数（SVF）的丰富且易于获取的来源。SVF包括间充质间质细胞、内皮前体、周围细胞及支持基质元件。当SVF保留在脂肪组织颗粒中时，其原生细胞外环境在处理^{和临床传递}过程中得以保留4.临床上，SVF富集型脂肪移植物被报道能改善移植物保持率，并与多种适应症中加速伤口上皮化相关，^5,6,7。

从抽脂液中获得SVF有两种主要策略。酶消化通常每单位体积产生的高成核细胞数，但需要专用试剂、实验室基础设施、更长的处理时间，并且在许多司法管辖区受到监管限制 ^4,8。相比之下，机械加工方法包括切割、注射器对注射器的乳化、过滤以及使用封闭系统机械装置。这些方法允许以最小作和更短的周转时间（^6,9,10,11）快速制备SVF富集微脂肪。近期机械系统报告处理时间<15分钟，某些系列的产率接近酶法，尽管测量的细胞数和存活率可能因设备和而^异。

尽管关于机械处理SVF和慢性溃疡和糖尿病足病脂肪移植的文献日益丰富，针对蛀牙型创伤性软组织缺损的标准化且可重复的方案仍然稀少 ^7,12。已发表的临床报告通常涉及慢性溃疡、糖尿病伤口或美学性脂肪移植。然而，只有少数提供术中分步骤方案，明确收获参数、乳化终点、过滤孔径、离心力（×克）、每伤口面积的剂量以及创^{伤环境注射}的创口准备标准^7,13。

因此，考虑此方法的外科团队需要实用适用性的指导。根据现有文献和我们的手术经验，单个腔体的典型术中抽吸量为~20-40毫升。这个体积通常能产出足够的加工微脂，填满小到中等大小的空洞。相比之下，大批量重建可能超出现场机械处理的范围，可能需要分阶段手术或替代策略（^9,12）。机械式SVF方法在感染受控前，对严重污染的伤口也不太适用;在这种情况下，应在移植前进行辅助清创和感染管理（包括靶向抗生素及适当时的负压伤口治疗）。

本研究旨在提供一套详细且可重复的术中方案，用于通过机械加工制备SVF富集微脂肪，并将该产品注射到空腔型创伤性软组织缺损中。该方案强调明确的作参数（收割、机械碎裂与乳化、过滤、离心（以× 克表示）、注射技术以及客观伤口面积测量），以便其他外科团队在各自环境中采纳并验证该方法。

Protocol

所有程序均由机构伦理委员会批准（批准号）KL-2025062）并根据赫尔辛基宣言进行。所有患者在参与前均获得书面知情同意。

1. 患者选择与术前评估

1. 包括在完成充分手术清创后，需进行重建干预的成年患者，这些患者出现龋齿型创伤性软组织缺损。
   注意：缺损应显示有明显的腔体，周围有可存活组织，重建时无持续坏死。
2. 排除有活跃全身感染或局部伤口感染失控、糖尿病控制不良（定义为HbA1c持续>8%）、影响肢体的显著周围血管疾病、已知凝血障碍或当前抗凝且无法安全中断、缺损部位恶性肿瘤，或术前评估确定的吸脂或麻醉禁忌症患者。
3. 进行基线数据收集和伤口评估
   1. 记录患者基线特征，包括年龄、性别、伤口位置、损伤机制及从受伤到重建的时间。
   2. 在标准伤口准备后进行伤口评估。用无菌尺测量伤口的最宽处的长度和宽度。获取固定距离和方向的标准数码照片。利用基于校准照片的平面测量计算伤口面积（cm²）（见步骤6.6）。
4. 提供术前咨询。向患者解释手术步骤、预期益处、潜在风险（包括感染、脂肪吸收及需额外手术）、术后护理要求及随访计划。
5. 确认理解并在手术前获得书面知情同意

2. 术前准备

1. 无菌设备的制备
   1. 准备所需的无菌设备，包括：抽脂导管（直径2-3毫米，钝头）、Luer锁注射器（容量10-20毫升）、用于注射器间转移的无菌Luer锁连接器、外科剪刀、钝头注射导管（22G，×50毫米）。
   2. 使用前确认所有设备的完整性和无菌性。
2. 膨胀溶液的制备与浸润
   1. 将1000毫升0.9%生理盐水吸入无菌容器
   2. 加入2毫升1：1,000肾上腺素，达到1：500,000的最终浓度。在无菌条件下彻底混合。
   3. 将溶液连接到带有2-3米钝浸润导管的Luer-lock注射器上
      注意：利多卡因被故意省略，以便实现分开且剂量控制的麻醉。
   4. 将溶液从深层向浅层缓慢扇形通道注入皮下供区（如腹部或大腿）。
   5. 根据供体部位表面积和预期抽脂体积调整总体积。
   6. 浸润直到组织出现均匀的膨胀和血管收缩。
   7. 浸润后等待10-15分钟，让血管收缩达到最大程度后再采收。注意：肾上腺素能减少术中出血并促进脂肪收集。省略利多卡因可防止超过安全麻醉剂量，并允许局部或区域麻醉单独使用。
3. 麻醉的施用
   注意：麻醉药与膨胀溶液分开施用，根据缺损大小、供区部位和患者耐受性选择。根据缺损大小、供体部位和患者耐受性，选择以下麻醉方法之一。
   1. 局部浸润（野外阻滞）：使用钝头（22克 × 50 毫米）导管浸入 0.5-1% 利多卡因和1：200,000 肾上腺素。放射状扩散，环绕供体部位的感觉神经。在进行供体部位作或肿胀浸润前，应预留5-10分钟以获得完全麻醉效果。
      注：最大剂量：7 mg/kg利多卡因，配合肾上腺素，已根据患者体重和合并症调整。
   2. 区域麻醉（可选）：根据供体部位使用超声引导的周围神经阻滞。使用布比卡因（0.25-0.5%）或罗吡卡因（0.5%），按标准指南按剂量调整。采摘前确认阻断起效时间（10-20分钟）。
   3. 全身麻醉：适用于大缺损或联合手术。按照机构规程进行管理，并进行标准监测。
      注意：确保所有浸润溶液的全身肾上腺素总剂量均在临床安全范围内。

3. 脂肪收获

1. 根据以下标准选择供区（腹部和/或大腿侧侧）
   1. 是否有足够的皮下脂肪组织，以便采集时不发生轮廓变形
   2. 没有局部瘢痕、感染或可能影响组织质量的既往手术。
   3. 患者在手术台上的可及性和位置，以便无菌浸润和吸入。
      注意：选择组织充足且既往创伤较少的部位，有助于脂肪采集的持续性，并减少手术并发症。
2. 用11号手术刀在无菌条件下做一个2-3毫米的皮肤切口。切开皮肤和真皮，直达皮下层，但不深入筋膜或肌肉。
3. 保持一个小而受控的切口，以减少疤痕形成。
4. 将2-3毫米的抽脂导管连接到10-20毫升的Luer-lock注射器上。
5. 将导管通过皮肤切口插入皮下脂肪层，保持在下方筋膜的浅层位置。
6. 使用温和、多方向的移动，将导管均匀分布在目标皮下平面。
7. 通过轻轻抽出注射器活塞，手动施加低负压，以吸取脂肪组织。
8. 避免过激吸力，以减少对脂肪来源细胞的机械性损伤。
9. 继续以小块受控抽吸，重新定位导管于皮下层，以最大化采集效率。
   注意：将注射器保持在室温（20-25°C）以保持细胞存活能力。
10. 采集约20-40毫升脂吸液，调整为缺损大小。
11. 抽吸后，取出导管，用单根3-0或4-0尼龙缝线闭合皮肤切口，或使用无菌粘胶条进行较小的刺伤切口。在供区部位涂上无菌敷料。
12. 抽吸脂吸液最初装在用于采集的Luer-lock注射器中。轻轻取下采集导管，将抽脂液转移到新的无菌10-20毫升Luer-lock注射器中进行进一步处理。
13. 避免暴露在空气、高温或过度机械力下。在处理（如纯化、离心或注射）前，将抽吸液保持在室温（20-25°C）下。
    注意：使用新鲜无菌注射器可以防止污染，并实现标准化处理。温和的处理可以保持脂肪细胞和基质血管分数的存活能力

4. SVF富集微脂的机械加工

1. 将采集的抽脂液置于无菌10-20毫升Luer-lock注射器中，室温（20-25°C）下直立5分钟，以便基于重力分离。
2. 站立后，可见三层明显的油脂层（游离脂质分率）、中层脂肪层、下层水性/血液层。
3. 采用无菌技术，将注射器垂直持住，喷嘴朝上，轻轻推进活塞，将上层油层排出，直到只剩脂肪部分。将注射器倒置，并用无菌注射器缓慢推进或吸入，小心地去除下层水膜/血液。只保留中间脂肪分以供进一步处理。
   注意：去除游离油脂和水溶液成分可减少炎症副产物，提升移植物的稳定性和细胞活性。
4. 将残留的脂肪分数转移到无菌不锈钢或玻璃皿中。使用无菌外科剪刀，轻柔地将脂肪组织切碎成约1-2毫米大小的碎片，避免过度的压缩或剪切力。
5. 将切碎的脂肪组织装入10毫升Luer-lock注射器中。将此注射器连接到第二个10毫升Luer锁注射器，使用无菌的雌性对女性Luer锁连接器。
6. 通过机械乳化脂肪组织，在两个注射器间来回传递20-30次，速度稳定适中。持续直到达到均匀、可注射的微脂稠度。
   注意：加工过的脂肪应呈现均匀乳化，且油脂分离极少。
7. 拆卸Luer-lock连接器，将注射器中的乳化微脂转移到与离心转子兼容的无菌离心管中。离心前确保管子按体积平衡。
8. 在室温下以约400×克离心乳化脂肪3分钟。
9. 离心后，可以看到三层：上层油层、中层SVF富集微脂分组、下层水/血层（见图1）。
10. 使用无菌注射器，只需小心抽取中间富含SVF的微脂层，避免邻近层的污染。
11. 将收集到的颗粒通过500-1000微米无菌不锈钢网状过滤器，去除纤维状杂质和大颗粒。这一步骤有助于平稳的注射，并减少移植时的导管堵塞。
12. 将过滤后的SVF富缩微脂注入1-5毫升无菌注射器，立即注射。

5. 注入缺陷部位

1. 进行最终的伤口清创，随后用无菌生理盐水彻底冲洗，直到清除所有坏死组织。
2. 通过存在健康的肉芽组织和/或点状出血来确认伤口准备状态，表明灌注充足且组织存活能力充足。
3. 采用无菌技术，将钝头导管（直径1.2-2.0毫米）从伤口边缘或相邻完整皮肤插入缺损处，尽量避免直接穿过中央伤口底部。
   1. 深度和组织平面：将导管推进到紧邻伤口床的皮下组织面;除非缺损深度明确指示，否则避免进行肌肉注射。
   2. 插入角度：将导管插入时，相对于伤口表面的低斜角（约10-30°），以便可控、分层沉积。
   3. 套管位置：将套管尖端保持在血管丰富的组织平面内，以优化移植物存活率并减少挤出。
4. 采用多层逆向扇动技术注射富含SVF的微脂，在缓慢取管时沉积少量分液。
5. 将移植物均匀分布于伤口基部、边缘及周围皮下组织，以实现均匀填充并最大化与血管受体组织的接触。
6. 根据腔体的大小和深度调整注射容量，通常范围为5-12毫升。
7. 一旦缺损充分填补并恢复组织轮廓，确保不过度矫正或组织过度张力，注射即停止。
   注意：避免过度填充，以降低脂肪坏死、灌注受损或移植物挤出的风险。
8. 用凡士林纱布覆盖伤口，纱布与伤口表面保持非压性接触。
9. 施以二次敷料保护部位，同时允许被动排水，并最大限度减少注入微脂的剪切力。

6. 术后护理与随访

1. 根据机构方案，考虑伤口大小、污染状况及患者特有风险因素，给予预防性抗生素。
2. 指导患者术后1-2周避免供体和移植物部位的压力、剪切或摩擦，以减少移植物位移并优化整合。
3. 每次复诊时检查伤口敷料，并根据需要更换凡士林（凡士林）纱布。不要强行去除附着的纱布;在上皮化过程中允许自发脱离，以防止再生组织的破坏。
4. 请在术后1周、2周、4周和12周安排复查。
5. 每次就诊时使用固定相机拍摄标准化的数码照片，距离伤口，保持一致的光线条件，并使用与伤口同一平面的比例尺（如无菌尺）。这确保了纵向评估的一致性。
6. 使用ImageJ软件（美国国立卫生研究院NIH）通过平面测量测量伤口面积。
   1. 将标准化伤口照片导入ImageJ
   2. 使用参考尺校准图像比例
   3. 使用多边形选择工具手动描摹伤口边缘。
   4. 利用软件的测量功能自动计算伤口面积。
7. 在评估结局时，完全上皮化定义为伤口表面完全覆盖，无需渗出物、敷料需求或无需二次干预。
8. 记录所有术后并发症，包括感染、脂肪坏死、血肿、浆液瘤或伤口愈合延迟。
   注意：所有生物废弃物应遵守机构生物安全规定处理。

Results

共有8名龋齿型创伤性软组织缺损患者采用上述方案治疗。

队列特征

该队列包括5名男性和3名女性，平均年龄为51.5±11.7岁（范围为38-74岁）。缺损分布在下肢（n = 5）、上肢（n = 2）和躯干（n = 1）。平均最大伤口直径为4.3±1.0厘米，腔深范围为3至6厘米。伤害病因包括交通事故（n=4）、挤压伤害（n=3）和跌倒（n=1）。多例术前创口培养呈阳性，最常见的为铜绿 假单胞菌、 金黄色葡萄球菌或 肺炎链 球菌（见表1）。

Discussion

本研究描述了一种临床适用且可重复的方案，用于管理创伤性腔体软组织缺损的SVF富集微脂的机械处理和移植。该协议旨在标准手术室环境中的护理点实施，优先考虑程序的简便性、安全性和可行性，而非生物特征分析。在这组小型临床系列中，所有治疗缺陷均表现出逐渐闭合的伤口，并在12周内实现完全上皮化，且无重大手术相关并发症，支持该方法在临床实践中的可行性。因此，机制解释有意限制于现有文献支持的关联，因为该临床队列未进行细胞表型和存活能力检测。

此前，通过机械处理脂肪组织以获得含SVF微脂的过程已被描述并在重建和再生环境中应用。基质血管组分的酶分离可产生更多成核细胞和祖细胞种群¹⁶，但需要专用试剂、延长处理时间、实验室基础设施，并且在许多区域受监管^限制。相比之下，机械加工使术中准备过程迅速，作极少，尽管细胞产率较低且常难以量化 ^4,5<...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% 生理盐水	巴克斯特医疗（或同等机构）	各种	用作膨胀液的基础溶液
钝头注射导管（22克，次数：50毫米）	CONPUVON（;)，中国	DZ 22及以下;50-C5	用于多层注入SVF富集微脂
离心机	长期的生物技术（），中国	LTA-1600	临床离心机，可产生约400及次;g
数码相机 / 智能手机	任何	无	随访时的标准化伤口摄影
肾上腺素	当地医院药房	各种	加入生理盐水以达到最终浓度1：500,000
ImageJ 软件（版本 1.53 或更高版本）	美国国立卫生研究院	自由软件	用于面积测量伤口面积
抽脂导管（2–3毫米）	标准医疗供应商	无	用于从供体部位采集脂肪组织
Luer-lock 连接器（女性对女性）	贝克顿·迪金森（或同等职位）	各种	用于注射器对注射器的机械乳化
Luer-lock注射器（1、5、10、20毫升）	宏达医疗器械（），中国	未具体说明（机构供应）	用于吸气、机械加工和喷射
无菌敷料/绷带	医院药学	无	术后伤口覆盖
无菌手术剪刀	广州百塘医疗器械有限公司	BT00301（或类似的代表性模型）	用于脂肪组织的机械断裂
凡士林纱布（10厘米及时间：10厘米）	华西医疗敷料有限公司（），中国	未具体说明（机构供应）	术后伤口护理中使用的非粘连敷料