免疫染色和染料穿透实验，用于定义 果蝇 胚胎上皮中核心褶皱的隔板连接蛋白

摘要

这些方案概述了如何表征对照和突变果蝇胚胎上皮中褶皱隔断连接的组织和闭合功能。

摘要

这些方案的目的是评估果蝇胚胎外胚层来源上皮组织中褶皱隔板连接（pSJs）的组织结构和屏障功能。pSJ在外胚层组织的侧膜上形成了一种闭塞屏障，包括表皮、唾液腺、气管和后肠，功能类似于脊椎动物组织中的紧密连接。在果蝇中，已鉴定出30种形成pSJs所需的蛋白质。核心pSJ蛋白最初沿侧膜长度定位，但在胚胎发生第16阶段，在连接处基部的顶端侧侧区域高度富集。到胚胎发生晚期第15阶段，这些组织已具备功能完整的闭塞连接。本文将介绍可用于探究对照和突变胚胎中pSJs组织和功能的免疫染色和染料渗透方案。成功应用这些方案可用于证明pSJs的遮蔽功能，并测试未知基因是否编码连接的核心成分。

引言

上皮组织的一个关键功能是将生物体内的不同区域进行区隔。创造这些独特环境对器官功能和保护有机体免受外部威胁至关重要。上皮细胞间形成的闭塞连接负责建立和维持这些环境，防止溶质在顶端和基底侧间^流动。在脊椎动物中，闭塞连接称为紧连接，而无脊椎动物如果蝇^1,3则称为隔结连接（SJ）。节肢动物中有两种SJ类型，分别根据其组织分布和^超微结构区分。褶皱隔断连接（pSJs）存在于表皮、唾液腺、气管和后肠等外胚层来源组织中。它们的超结构特征是位于细胞间隙中，位于附着点^3,5基部的电子密度高密度结构梯形阵列。相比之下，平滑隔中隔结（sSJ）存在于内胚层来源的组织，如中肠和马尔皮吉小管，且细胞间不显示电子密度高的隔^膜。

果蝇的遗传学研究已鉴定出30种对pSJ结构和功能至关重要的蛋白质，并发现了其他存在于连接点但似乎不具备建立或维持功能的蛋白质（见^第7章综述）。通过这些分析，科学家将SJ蛋白分为三类。核心SJ蛋白位于连接点内，是连接点建立和维持所必需的。已鉴定出17种蛋白为核心pSJ蛋白，包括Coracle（Cora）、Neurexin IV、巨球蛋白补体相关蛋白（Mcr）、Kune-kune和ATP酶α 8,9,10,11,12。已有九种蛋白质被鉴定为辅助pSJ蛋白，这些蛋白是建立和/或维持连接点所必需的，但它们不一定存在于该连接点内。该类包括Rab5、Rab11和Coiled^13、14等蛋白质。最后，pSJ驻留蛋白定位于pSJ，但对连接的建立和维持是可怕的。该组的四个成员包括《大圆盘》和《束缚盘III》^15,16页。

功能完整pSJ的建立是一个多步骤过程，始于胚胎发生过程中，所有核心pSJ蛋白均已完全表达。部分核心pSJ基因在母体表达，但到第12至¹⁷阶段均显示强合子表达。在第12阶段，核心pSJ蛋白沿着侧膜全长分布。在第13至16阶段，核心pSJ蛋白被内吞，然后回收回pSJ区域的侧膜。该过程需要pSJ辅助蛋白，包括Rab5和Rab111111111111111111111111111111111111111111111111111111111等^蛋白质。到第16阶段，核心pSJ蛋白紧密定位于pSJ沿侧膜区域。与上述观察一致，该接点的完全闭塞功能发生在胚胎发生¹²的第15晚期。这一点最好通过染料渗透性分析来证明。在连接形成之前，带有荧光标记（如罗丹明）的10 kDa右旋糖酐珠可以通过细胞间的细胞旁空间。如果将标记的右旋糖酐注射到血腔，它会迅速积累到管状上皮细胞的腔内，如气管、唾液腺和后肠。在第15期末pSJ生理紧绷后，注射的右旋糖酐仅限于上皮基底侧，无法在这些器官的腔内（顶端区域）积聚。

核心pSJ蛋白有一个共同特征，即每个核心pSJ蛋白都需要所有其他核心pSJ蛋白的存在才能正确定位亚细胞^18,19。pSJ形成中的这种相互依赖性是核心pSJ蛋白的决定性特征，也是本文所提出方案的基础。核心或辅助pSJ基因的突变导致胚胎致死，其特征是第16期胚胎中其他核心pSJ蛋白沿侧膜错位，而非紧密定位于其正常的顶端侧侧区域。相比之下，pSJ常驻基因的突变不会导致核心pSJ蛋白的错位¹⁵。pSJ在核心及辅助pSJ基因突变中的功能破坏，通过在第16或17期突变胚胎气管腔、唾液腺或后肠内积累标记的10 kDa右旋糖酐来揭示。最后，核心蛋白与辅助pSJ蛋白的区别在于其亚细胞定位。核心pSJ蛋白一旦形成后与pSJ紧密结合，而辅助pSJ蛋白对连接组装至关重要，但不一定存在于连接处。辅助pSJ蛋白的最佳例子是Rab5和Rab11。这两者都是细胞质蛋白，帮助将货物从质膜运送到早期内体，再循环内体，然后再返回质膜¹⁴。为了区分新的潜在pSJ蛋白是核心成分还是辅助蛋白，通常有助于制造特异性抗体或表达荧光标记的重组蛋白，以确定这些蛋白在pSJ成熟过程中的不同位置。

这些协议的目的是明确区分潜在的核心和辅助pSJ蛋白与pSJ常驻蛋白。多项研究揭示了pSJ蛋白在发育过程中还有其他非阻塞性作用，包括形态发生和顶端-基底极性17,20,21,22。随着对pSJ生物学兴趣的增加和更多潜在pSJ蛋白的发现，本文呈现的简单易解方案将帮助研究人员正确表征这些蛋白的pSJ组织和遮蔽功能。文献中还描述了许多用于表征pSJ蛋白的实验方法，包括光漂白后荧光恢复（FRAP）和透射电子显^微镜6,23。尽管这些方法通常非常有用，但本文所展示的免疫染色测定法能够快速可视化pSJ蛋白定位，而无需昂贵且耗时的超微结构方法;而染料渗透性测定则提供了单靠影像无法实现的功能性pSJ完整性读数。此外，这些检测还可使用标准实验室设备完成，如高质量的荧光显微镜和简易的显微注射装置。需要注意的是，这些检测方法针对果蝇第16期胚胎进行了优化，不适合评估sSJs的组织或功能。

方案

1. 胚胎分期

1. 将健康且符合基因型的雄性和雌蝇交配（参见 材料表 示例），并将其放入胚胎采集笼中，配以涂抹酵母膏的新鲜苹果汁盘。让苍蝇适应蛋收集笼一两天，再开始胚胎采集。
2. 收集胚胎于苹果汁盘上，使其发育至第16阶段（产卵后约13小时（AEL）至25°C下16小时AEL）。让成虫在苹果汁盘上产下受精卵1-2小时，然后将受精盘从卵收集笼中取出，然后将其熟成至13-16 AEL，温度为25°C。 或者，在25°C下过夜采集胚胎，然后在固定前或固定和免疫染色后的影像检查中选取第16期胚胎。
   注意：胚胎分期可以通过肠道形态评估，肠道形态最容易通过紫外光谱的自体荧光（即DAPI通道）来观察。在第16期胚胎中，肠道呈现为三个垂直于身体长轴的平行长椭圆（见图1H）。

2. 胚胎固定与免疫染色

1. 组装一个用尼龙网（120毫米网）的胚胎收集篮。用尼龙网盖住篮口和螺纹，然后拧上盖子。
2. 用画笔和胚胎清洗液轻轻将胚胎从苹果汁盘中取出。将胚胎混合物倒入胚胎收集篮中，并用蒸馏水冲洗胚胎。
   注意：注意将水引导到胚胎收集篮内侧，避免将胚胎溅到篮侧，否则因粘附导致胚胎脱落。
3. 通过将胚胎采集篮和胚胎浸入含有50%商业漂白剂（最终浓度为3.75%次氯酸钠）的托盘中，进行脱丝膜化。将胚胎放入漂白剂中旋转，并在室温下浸泡3-5分钟。将滤篮从漂白剂中取出，用蒸馏水冲洗胚胎，同时将水流顺滤篮内侧流下。
4. 将等量的新鲜4%对甲醛溶液和庚烷加入20毫升闪烁小瓶，准备固定瓶。通过将适量的对甲醛溶解在高温（~90°C）1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，置于化学熏罩中，制备对甲醛溶液。为加快溶解过程，向定剂中加入10微升14N氢氧化钠（每10毫升PBS），直到甲醛溶解，然后加入10微升14N盐酸，将pH调整回中性。
   注意：处理对甲醛和庚烷时，务必穿戴实验服、护目镜和手套，且仅在化学排气罩下使用。对甲醛是致癌物且具有腐蚀性，而庚烷高度易燃，且会刺激皮肤和眼睛。
5. 拆开胚胎收集篮，将尼龙网与脱胆虫胚胎一起浸入庚烷中。胚胎会从尼龙中脱落，沉降到庚烷（上层）与固定层（下层）的界面。通过在平台摇动器上以每分钟240转（RPM）的速度摇晃固定瓶，固定胚胎20分钟。
6. 用巴斯德移液器在化学排气罩中取出固定瓶中的修复剂。将修复剂丢弃在经过批准的危险化学废物容器中。加入等量的甲醇，关闭固定室，并用力摇晃5-10秒。固定胚胎会从玻璃膜中脱离，沉入甲醇底部（下层）。玻璃膜膜及未从膜膜中撕裂的胚胎将留在界面，并在第2.7步中移除。
   注意：处理甲醇时务必穿戴实验服、护目镜和手套，因为甲醇有毒且易燃。
7. 用巴斯德移液器去除庚烷，并将其丢弃在经过批准的危险化学废物容器中。然后去除大部分甲醇，将胚胎留在一小池甲醇中，并将甲醇丢弃于有害化学废弃物中。加入5毫升甲醇，搅动胚胎，让它们静置。再次去除大部分甲醇，重复这个过程两次。
8. 将含甲醇的胚胎转移到0.8毫升玻璃培养管中。去除甲醇，加入750毫升块状溶液（PBS加1%普通驴血清和0.1% Triton X-100）。将胚胎用PBS洗涤3次，然后在室温下用块状溶液孵育30分钟，同时在平台摇杆上轻轻搅拌。
9. 再用PBS冲洗胚胎一次，然后加入阻断体和原一抗。使用针对核心pSJ蛋白（如Coracle）和粘附连接蛋白（如E钙粘蛋白）的抗体。胚胎在原一抗体中孵育，温度为4°C，或室温下3-4小时，并在平台摇杆上轻柔混合。
10. 用原抗取出阻断体，并在PBS中冲洗胚胎三次。加入块状，并在室温下用平台摇杆清洗胚胎30分钟。
11. 再用PBS冲洗胚胎一次，然后加入阻断溶液和第2.9步所用原一抗特异性的荧光标记二级抗体。胚胎在室温下孵育3-4小时，或在4°C下过夜。
12. 用二级抗体去除阻断体，并在PBS中冲洗胚胎三次。加入块状，并在室温下用平台摇杆清洗胚胎30分钟。
13. 再次用PBS冲洗胚胎，然后用巴斯德移液器将其转移到显微镜载玻片上。用小条Whatman纸去除多余的PBS，注意不要碰胚胎。用装载培养基覆盖胚胎（商业化或由90%甘油、10% 1 M Tris、pH 8.0、0.5% 正丙基烯酸酯作为抗褪色剂制成）。用合适尺寸的1.5号罩盖玻璃覆盖，并用指甲油封住边缘。

3. 免疫染色胚胎的影像与数据分析

1. 为了获得最佳效果，建议用40倍油浸物镜的共聚焦显微镜拍摄胚胎。使用对照胚胎在共聚焦上设置激光强度和增益，以实现强烈的荧光信号，同时避免像素过饱和。利用中肠形态学识别第16期选择胚胎（即未表达平衡器编码GFP以识别突变胚胎的胚胎）。扫描重点关注唾液腺或后肠，这些器官极化且侧膜较长，非常适合区分附着连接处、pSJ及剩余侧面。图像为Z位，包含唾液腺或后肠腔径的最大，以观察上皮细胞的完整侧膜。
   注： 图1C 所示的例子是在共軛焦显微镜上拍摄的，配备HC PL APO 40x/1.3 CS2油浸透镜，561纳米激光激光强度为1.59，增益为3.3,638纳米激光激光强度为2.0，增益为21.7（见 材料表）。
2. 图像显示至少20个对照和突变期16胚胎的极化组织。仅记录附着连接标记紧密定位于膜顶端外侧区域的胚胎数据，以确保胚胎被正确固定和染色。接着，记录pSJ标记沿侧膜的分布。在野生型16期胚胎中，观察pSJ蛋白在附着连接基部侧膜约10-15%的强富集。
   注意：即使pSj蛋白在侧膜长度上有10-20%的错位，也可诊断pSJ组织缺陷。pSJ组织缺陷在所有核心和辅助pSJ突变胚胎中都非常明显，因此你应该预期75%-100%的突变胚胎会明显错位pSJ蛋白。

4. 染料注射准备

1. 将标记为10 kDa的右旋溶于0.5 M磷酸钠、pH值7.5和5 mM氯化钾中，制成新鲜染料溶液。
2. 用拉针器将一根毛细管（外径1.0毫米，内径0.5毫米，带纤维）拉入玻璃针中。
   注意：拔针者个体独特，理想针的设置每天不同。好的针具有逐渐变细至尖锐的尖端，应该位于 图2A所示的形状之间。左侧的针较长，推入胚胎时可能会弯曲。这可以通过将针头从针尖更远处重新折断来纠正。右侧的针头不错，但刚断时孔径较大，可能会将过多液体推入胚胎。如果发生这种情况，换一根尖头更细的新针。当拔针器上的条件合适时，最好同时拉多根针。多余的针头可以存放在密封容器中，并用泡沫或胶带单独固定针头。
3. 将针头装入微型机械臂的针架。将微作手放在倒置显微镜旁边（见图2F）。将针尽可能与显微镜载玻片平行，然后将其降低，使其与载玻片侧面处于相同的Z平面上。
4. 通过敲击显微镜载玻片的侧面，折断针尖。将针抬高于滑套水平，取出以便装填。
5. 用最小的移液器尖端（P2或P10尖端）或通过毛细作用将针尾放入1.5毫升微离心管中，将染料注入毛细管。
6. 将填充的针重新装入针架，并通过在显微镜载玻片表面的一滴卤碳油中注入一点，测试右旋糖酐的流动。
   注意：断得很长的针头不会漏油，除非加压，流量可以通过注射器活塞施加的压力来调节。

5. 胚胎装载与染料注射

1. 选择第16或第17期胚胎（对照和突变），并以中肠形态作为分期标记。
2. 用22 x 22 #2厚度的封面单在苹果汁盘上画一条凹陷线。将大约25个分期胚胎排成一排，后端接触线，腹部朝上。
3. 在22 x 22 #2的封面纸上贴上一块双面胶带。将胶带接触胚胎线，轻轻摩擦盖片，将胚胎从平板移到盖单上的双面胶带上（见图2B）。
4. 通过在载玻片上滴一滴卤碳油，利用毛细作用形成粘结，将盖片固定在显微镜载玻片上。将盖片朝向更靠近滑套侧面，与结霜部分相对。将胚胎在干燥剂容器中干燥3-5分钟，或在实验台上的空气中干燥10-15分钟（见图2C-E）。用卤素油完全覆盖胚胎。
   注意：胚胎干燥后会稍微不那么饱满，但不会非常软。 图2E 所示的胚胎在相对湿度42%、21.2摄氏度的房间中自然风干15分钟。
5. 将载玻片与胚胎一起安装到倒置显微镜上，胚胎朝上（远离物镜）。将微作器对准，使针头朝向胚胎后端，角度尽可能接近胚胎（见图2G）。调整微作器的Z轴，使针尖对准胚胎中点（沿背腹轴）。
6. 快速将胚胎阶段移入针头，使针尖进入胚胎血源。用10、25或50毫升注射器注射少量染料（~0.2-0.5 nL）。迅速拔针，将培养期移到下一个胚胎，重复这个过程。10分钟内尽可能多地注射胚胎。
   注意：针头插入胚胎约25%处，避免染料直接注入与前肠和后肠腔相连的膜状腔。注射的染料应该会让胚胎看起来“膨胀”，使其看起来更饱满。过度注射会导致造影剂和血淋巴从注射部位冒出，应避免。
7. 加入额外的盐碳油，并用22 x 22 #2的封套覆盖胚胎。额外的卤素油在两层盖片之间形成更均匀的层，防止胚胎被压碎。

6. 成像与数据分析

1. 在荧光化合物显微镜或共軛焦显微镜上进行成像（10倍或20倍空气物镜即可获得明确结果）。在共焦点和Z层成像中，通过约四分之一深度（沿背腹轴）成像，可以揭示标记右旋糖酐是否进入气管腔和后肠腔（需要更深的切片或将胚胎腹面置于顶部以便观察唾液腺）。
   注： 图3 所示的例子是在共軛焦显微镜上拍摄的，采用HC PL APO 10x/0.4 CS2干透镜，激光强度为2.0,561纳米激光增益为13.6。共获得了24个z切片，z步长为2.4纳米（详见 材料表）。
2. 让注射的胚胎老化10分钟，然后检查气管腔、唾液腺或后肠是否有标记的右旋糖酐积聚。记录每个胚胎的基因型和阶段，以及是否有标记的右旋糖酐积聚到任何管状器官中。注意任何胚胎的胚胎周围腔也被强烈染料染色，因为这些胚胎可能是被无意中注射到该腔体中。

结果

本研究方案用于研究果蝇胚胎16期外胚层组织中pSJ的组织和功能。这些协议仅适用于pSJ，不能用于查询sSJ。基因突变导致第16期胚胎中未能将其他pSJ蛋白定位到pSJ区域，并在第16期形成封闭连接，这种突变可能存在于核心pSJ基因或辅助pSJ基因中。两者的主要区别在于，一旦野生型胚胎形成功能性连接，编码的蛋白是否在细胞内定位于pSJ。在这种情况下，该蛋白被归类为核心pSJ蛋白。为证明这一原理，我们首先展示了核心pSJ蛋白在野生型胚胎中从胚胎发生阶段13到16阶段的成熟过程（见图1A-D）。这里我们关注唾液腺，它是一种上皮管，顶端面向腺体腔。在胚胎发生的第13至16阶段，唾液腺由高大的柱状细胞组成，便于在胚胎共聚焦光学切片中直接观察侧膜。利用针对核心pSJ蛋白巨球蛋白补体相关（Mcr;A-C）的抗体，我们发现Mcr在第13期胚胎的侧膜上均匀分布。到第14阶段，Mcr在侧膜顶端区域（即附着连接处蛋白E-cadherin的表达）中更为浓集，尽管在侧膜其余部分仍可见大量Mcr免疫染色。...

讨论

本文介绍了一种方案，利用两种相对简单的检测方法鉴定核心和辅助pSJ蛋白，这些方法可在具备荧光显微镜能力的中型实验室中完成。第一个检测通过对固定突变胚胎的共聚焦成像，研究成熟极化上皮细胞中pSJ的分子组织。第二项检测通过将染料标记的10 kDa右旋糖酐分子注入第16期活胚胎，测试pSJ的封闭功能完整性。这些方案的简洁性，以及pSJ组织和功能缺陷完全用于诊断核心和辅助pSJs突变，使其相较于更费力、技术难度较高的方法（如FRAP和电子显微镜）更具优势。这些方案专门针对果蝇胚胎发生过程中pSJ的组织和功能，不适用于sSJs或发育后期阶段。

核心及辅助pSJ突变晚期胚胎中所有核心pSJ蛋白的误定位完全具有诊断作用。因此，可以通过对核心pSJ蛋白对突变胚胎进行免疫染色，检测任何潜在的pSJ基因。我们这里展示的方案包括非常标准的对甲醛固定步骤。只要对照阶段16胚胎显示出预期的粘连结处和pSJ标记定位，与该方案的轻微差异应当没问题。发育研究杂交瘤库（DSHB）提供了多种有用的pSJ抗体，包括Cora、ATPase alpha和N...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
针用毛细管（Boro 1 x 0.5/纤维）	FHC	30-30-1
共焦显微镜	徕卡	群星5及nbsp;
注射用22 x 22厚度的玻璃罩	费舍尔科学	12-540-B
镜罩 22 x 30 1.5 厚用于成像	科宁	2980-233
用于免疫染色的培养管（6 x 50 mm）	费舍尔科学	14-958-A
胚胎收集笼	杰尼西科学	59-100
荧光立体显微镜	徕卡	MZ10 F
卤素油（700）	杰尼西科学	59-131
庚烷	费舍尔科学	H350-4
倒置荧光显微镜	徕卡	DMi8
用于脱毛膜胚胎的网状篮子	杰尼西科学	46-101
甲醇	费舍尔科学	A412-4
微型机械臂	成重	MN151
显微镜载玻片	费舍尔科学	12-544-2
拔针器	大卫·科普夫乐器	720型
普通驴子血清	杰克逊免疫检测	017-000-121
尼龙网（120微米）	杰尼西科学	57-102
物镜 HC PL FLUOTR 10X/0.32 pH 1	徕卡	11506537
物镜 HC PL APO 10x/0.40 CS2	徕卡	15506407
物镜 HC PL APO 40x/1.30 CS2	徕卡	15506358
培三式60 x 15毫米	科宁	351007
站台摇臂	环球科学	GTR-FS
原一抗体（Coracle）	DSHB	C566.9
原一抗体（Coracle）	DSHB	C615.16
原抗（E钙黏蛋白）	DSHB	DCAD2
一级抗体（Mcr）	西储储备大学沃德实验室	豚鼠多克隆
罗达明标注为10 kDa右旋糖酐	分子探针	D1824
二级抗体（驴抗豚鼠Cy3）	杰克逊免疫检测	706-165-148
二级抗体（驴抗小鼠Cy2）	杰克逊免疫检测	715-225-151
二级抗体（驴抗大鼠Cy5）	杰克逊免疫检测	712-175-150
桌面摇床	新不伦瑞克科学	C2平台震动器
Tegosept（甲基4-羟基苯甲酸盐）	TCI	H0216
特里顿 X-100	费舍尔科学	BP151500
固定用小瓶（20毫升WHEATON液体闪烁小瓶）	费舍尔科学	03-341-73C
Whatman 3MM 色谱纸	费舍尔科学	05-716-6H
<强>飞股票	<强>全基因型<强>	<强劲>股票编号	<强>来源
Cor4	w*;P{neoFRT}43D cora4/CyO	52232	BDSC
W1118	w[1118]	5905	BDSC
<强>解决方案<强>	<强>食谱
10倍PBS	混合90克NaCl、20克Na2HPO4和8.3克NaH2PO4。H2O和dH20至1升。过滤消毒。用dH2O稀释至1倍，用于免疫染色的洗涤步骤。
10% 特里顿 X-100 溶液	将1毫升Triton X-100与9毫升dH2O混合在平台摇杆上，直到溶解。室温保存。
50%漂白剂	在胚胎脱毛前，将10毫升市售漂白剂（7.5%次氯酸钠）与10毫升水混合。
苹果汁盘	将15克果蝇琼脂用725毫升dH2O煮沸。加入25克糖和250毫升苹果汁，搅拌至混合。让溶液冷却至55摄氏度，然后加入1.3克tegosept，轻轻混合。倒入60 x 15的培养皿中冷却。储存温度为4摄氏度。
阻塞解	将9.8毫升1XPBS与100μl 10% Triton X-100和100μul Normal Donkey Serum混合，装在15锥形管中。
胚胎洗涤液	用70克NaCl和2毫升Triton X-100混合1升dH2O，制成10X胚胎洗涤液。用dH2O稀释到1倍，作为有效的溶液。
修复	用微波炉预热10毫升1X PBS。加0.4 g 对甲醛和移液器混合。加入10ul的14N NaOH，加快溶解速度。放在90摄氏度的热块上，直到溶解。当没有固体对甲醛残留后，加入10μl 14N HCL以调整pH至中性。使用对甲醛时一定要穿实验服、手套和护目镜。
安装介质	混合9毫升甘油和1毫升1M Tris碱基pH值8.0。加入0.05克正丙基-代食酸酯，nbsp;搅拌后加热溶解。将0.5毫升注入叶彭多夫管中，注点;
罗丹右旋糖酐溶液	将标记为罗丹明的10 kDa Dactorn溶解于0.5M磷酸钠、pH值7.5和5 mM氯化钾中，制备新鲜染料溶液。
酵母膏	将50克商业酵母（红星酵母）与一撮蔗糖和足够的水混合成浓稠的糊状。储存温度为4摄氏度。