使用一次性结扎夹在小鼠中进行袖状胃切除术

摘要

本文介绍了一种利用一次性结扎夹建立小鼠袖状胃切除模型的实验方案。该模型具有术后死亡率低、手术时间短的优点，且治疗效果与传统的缝合技术相当。

摘要

目前，袖状胃切除术（SG）的小鼠模型严重依赖手工缝合——这是一种技术要求高、手术时间长、围手术期死亡率高且学习曲线陡峭的操作，限制了非外科研究人员对该模型的使用。为解决这一瓶颈问题，我们开发了一种简化的SG操作方案，采用一次性结扎夹，这种器械在临床胃肠道手术中广泛应用。在饮食诱导肥胖的C57BL/6J小鼠中，使用结扎夹的方法使平均手术时间减少了>50%（20.9 ± 3.2 vs. 43.9 ± 3.0 分钟），并与传统缝合方法相比显著提高了12周的存活率。该方法达到了相当的代谢效果，包括持续的体重减轻、改善的葡萄糖耐量、增强的胰岛素敏感性以及减轻的肝脂肪变性。值得注意的是，该模型无需专业的显微外科技术或吻合器设备，而这些设备在小鼠实验中通常难以获得。我们推荐这一基于结扎夹的方法用于研究人员，特别是那些缺乏高级外科培训但重视减重手术机制研究中操作效率与可重复性的研究者。对于追求直接临床可转化性的外科医生而言，基于缝合的技术仍是更优选择，尽管其需要更严格的围手术期管理。

引言

减重手术被公认为治疗重度肥胖及其相关并发症最有效的干预手段¹。小鼠袖状胃切除术（SG）模型是研究减重手术相关病理生理变化及潜在机制的重要工具。该模型的优势在于可利用基因修饰小鼠品系，例如基因敲除或过表达小鼠。易于复制、能够严格控制实验条件并便于实验操作的小鼠模型，对于临床转化研究至关重要²。

传统的鼠类袖状胃切除术（SG）模型采用基于缝线的技术来构建管状胃囊。该方法包含多个精确的手术步骤，通常需要较高的技术水平。代表性技术包括单层缝合SG^3,4和勒姆伯特缝合法SG^5,6，平均手术时间约为30至45分钟⁷。因此，对十只小鼠进行SG手术通常需要5至7.5小时的操作时间。在涉及多个实验组的研究中，累计手术可能持续2至3个连续日程。较长的操作周期可能带来后勤方面的限制，并导致围手术期条件的变异性，从而影响实验的一致性和术后监测。研究人员已探索替代方法，以建立更易操作的小鼠SG模型。使用吻合器辅助（SG-吻合器）^7,8和使用夹闭装置（SG-夹闭）^9,10,11的方法代表了显著的改进。这些方法简化了胃囊成形过程中的特定环节，降低了手工缝合的技术要求，从而有助于在不同外科经验水平的研究环境中更广泛地应用。然而，由于适合小鼠体型的吻合器设备供应有限，SG-吻合器技术在小鼠中的应用受到实际限制，因而更多用于大鼠模型。关于SG-夹闭方法，以往研究通常使用一到两个钛夹，并辅以附加缝线^9,10,11。标准钛夹光滑的内表面导致组织贴合不良，因此需要额外固定以确保手术的可靠性和胃壁的完整性。

结合SG吻合器和SG夹闭模型的特点，本方案介绍了一种使用一次性结扎夹建立的小鼠胃袖状切除（SG）模型。这类结扎夹常用于胆囊切除术、阑尾切除术及其他胃肠道手术中，可牢固夹闭组织，如残余胆囊管、阑尾根部及血管，无需额外缝线加固。目前已有适用于小鼠胃长度的夹子规格。这种新型SG夹闭模型操作简便、可靠性高，其治疗效果与传统的缝线模型相当。

值得注意的是，当研究旨在复制临床外科技术、探究缝线特有的生物力学或生物学效应，或需要最大程度的解剖学精度时，基于缝合线的腮腺导管结扎术（SG）仍是首选方法。对于具备高级显微外科技能的研究人员而言，手工缝合方法更贴近人类手术操作，因此在实现转化保真度方面更为合适。相比之下，使用结扎夹的模型提供了一种简化、高效且易于实施的替代方案，在保持实验严谨性的同时，拓宽了小鼠SG在不同研究环境中的适用性——尤其是在外科技术经验有限的情况下。

方案

本方案遵循国际动物福利伦理准则，并已获得暨南大学实验动物福利与伦理委员会批准（批准编号：20240227-0073）。

注意：30只雄性C57BL/6J野生型小鼠（8周龄），体重22-25 g，在温度为20-26 °C、12/12小时昼夜循环的无特定病原体（SPF）环境中饲养。经过4周高脂饮食适应后，将小鼠随机分为三组：SC组（夹闭胃窦组，SG with clip）、SS组（缝合胃窦组，SG with suture）和SH组（假手术组），每组10只小鼠。

1. 术前准备

1. 术前2天改为流质饮食，术前无需禁食。
   注意：术前过渡到流质饮食有助于小鼠胃内固体食物排空，从而减少术中污染。此外，这也有助于更好地适应术后流质营养，确保充足的能量摄入。
2. 将加热垫固定在配备麻醉面罩的手术台上，并将温度调节至约37 °C。
3. 用75%酒精清洁手术台。
4. 从100 mL生理盐水中抽取1 mL，用于溶解青霉素粉末。然后将全部溶解后的青霉素溶液注入剩余的99 mL生理盐水中，配制成浓度为800,000 IU/100 mL的青霉素溶液。
5. 使用3%异氟烷和0.5 L/min氧气对小鼠进行约30秒的麻醉，随后将小鼠头部置于麻醉面罩中，并维持异氟烷浓度为1.5%。
6. 用安尔碘溶液对胸部和腹部皮肤进行消毒，并覆盖无菌巾。

2. 手术操作

1. 正中剖腹术：在剑突下方约2 cm处提起皮肤，沿中线做1.5 cm切口。沿腹白线无肌肉区域切开，切口大小以刚好能放入牵开器为宜（约1.5 cm）。
2. 胃外置：使用湿润棉签将结肠及部分小肠推向盆腔。用钝头镊子轻柔地将胃提起至腹壁切口处，并用湿纱布剪成的新洞巾覆盖。仔细解剖肝胃韧带、胃脾韧带以及胃窦与胰腺之间的部分血管连接，并用电凝器切断。
   注意：在胃外置和切开过程中，及时放置额外的无菌巾或湿润棉球，可有效减少胃内容物对术区的污染。
3. 确定胃大弯侧切除范围，胃底端距离食管3 mm，幽门端距离幽门3 mm。
4. 对于SC组：
   1. 使用施夹器将一次性结扎夹置于预定切除位置；仔细再次确认夹子位置距食管和幽门的距离，然后夹闭。
      注意：夹闭前必须由助手与术者共同确认切除线，以确保切除边缘精确。
   2. 在胃周围预先放置湿润棉球，防止胃内容物溢出污染腹腔；随后迅速切除结扎夹大弯侧约80%的胃组织。
   3. 用安尔碘棉签对切口消毒三次，并用生理盐水棉签擦拭一次（图1）。
5. 对于SS组：
   1. 沿预定切除范围夹闭胃体。
   2. 在胃周围预先放置湿润棉球，防止胃内容物溢出污染腹腔；随后使用眼科剪迅速切除结扎夹大弯侧约80%的胃组织。
   3. 打开止血钳，用生理盐水棉签清理胃腔内容物。
   4. 使用6-0可吸收缝线，采用单层连续缝合法缝合切口两次。第一次连续缝合时，将缝针垂直于切口边缘进针，距离切缘2–3 mm，贯穿胃壁全层，从对侧等距位置出针。以手术结固定首针，随后在均匀张力下交替采取2 mm间距进针，避免组织皱缩或留有间隙，末端以方结（3–4个结）收尾。
   5. 第二次连续缝合与第一次平行，采用错位缝合方式，以增强覆盖效果，保持进针间距和张力一致，避免重叠或扭转。
      注意：棉球或纱布变红提示存在明显出血，尤其在胃切口部位；缝合前必须对切口进行充分电凝止血。
   6. 用安尔碘棉签对切口消毒三次，并用生理盐水棉签擦拭一次（图2）。
6. 对于SH组：
   1. 仅对胃进行夹闭操作，10分钟后松开。
   2. 将胃复位至腹腔正常位置，使用5-0手术缝线缝合肌层和皮肤，消毒后结束手术。
      注意：所有小鼠均在一周内完成手术，以便有效监测术后体重及食物摄入情况。

3. 术后护理

1. 将小鼠放入纯氧诱导箱中。约2分钟后小鼠可苏醒。取出小鼠并置于加热垫上，密切观察其意识状态和呼吸情况，待其能够自主活动后放回笼中。
2. 皮下注射葡萄糖盐水溶液（5%葡萄糖和4.5%氯化钠），剂量为20 mL/kg，单次给药。
3. 在小鼠术后恢复意识前，立即皮下注射美洛昔康，剂量为4 mg/kg（浓度：0.4 mg/mL），之后每24小时重复注射一次，连续三天。
4. 术后前三天提供雅培营养液和高脂饮食；术后第四天起将营养液替换为饮用水。
5. 术后连续三天每日肌肉注射青霉素（30,000 U/kg），以预防感染。
6. 每日观察小鼠的一般状况，并根据需要及时给予对症治疗。

4. 检测指标

注意：小鼠术后存活4周且无明显术后并发症，视为手术成功。

1. 在手术时记录每只小鼠的体重及手术持续时间，并在术后12周内每周监测各组小鼠的体重、食物摄入量、死亡率以及严重并发症的发生情况。
2. 在第12周进行代谢和肠道转运功能评估，包括腹腔注射葡萄糖耐量试验（ipGTT）、胰岛素耐受试验（ITT）和小肠转运试验。
   1. ipGTT试验：小鼠禁食12小时。剪取尾尖约1 mm，测定空腹血糖（0分钟）。按2 g/kg体重剂量腹腔注射20%葡萄糖溶液。在给药后15、30、60、90和120分钟分别测定血糖水平。
   2. ITT试验：小鼠禁食6小时。测定空腹血糖水平。按0.5 U/kg体重剂量腹腔注射胰岛素溶液（0.075 U/mL）。在注射后15、30、60、90和120分钟分别测定血糖水平。
   3. 小肠转运试验：小鼠禁食12小时。按10 mL/kg体重剂量经口灌胃给予10%炭粉悬浮液。30分钟后处死小鼠。完整切除从幽门至盲肠近端的小肠。计算肠道转运率，即炭粉前沿至幽门的距离除以小肠总长度。
3. 处死小鼠，观察袖状胃的解剖结构及小肠的形态学变化。
4. 采用苏木精-伊红（HE）染色和油红O染色对肝脏组织进行染色，并采集血液样本检测血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和游离脂肪酸（FFA）水平。

5. 统计学分析

1. 将所有连续变量（体重、食物摄入量、小肠通过率、血糖水平和血清学参数）表示为均值 ± 标准差。
2. 使用双因素重复测量方差分析（因素：组别和时间）分析纵向体重和食物摄入量数据。
3. 使用单因素方差分析分析小肠通过率和血清学参数。
4. 对于腹腔注射葡萄糖耐量试验（ipGTT）和胰岛素耐量试验（ITT）数据，计算每个受试者的曲线下面积（AUC），并使用单因素方差分析比较各组的AUC值。
5. 在方差分析结果具有显著性时，采用Bonferroni校正进行事后两两比较。
6. 将统计学显著性定义为 p < 0.05。所有统计分析均使用GraphPad Prism 9（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）进行。

结果

手术成功的标准定义为小鼠术后存活超过4周且未发生严重并发症。术后第4周之后发生的死亡归因于并发症。在连续12周的术后观察期间，SC组有1只小鼠于术后第24天因缝线引起的伤口和腹腔感染而死亡，其余9只小鼠均存活至第12周。SS组共有5只小鼠死亡，死亡时间分别为术后第5天、第7天、第12天，以及术后第7周和第12周。前两例死亡归因于过度虚弱，第三例死于袖状胃梗阻及感染，最后两例死于严重的腹腔粘连性肠梗阻。SH组所有小鼠均存活至术后12周（图3）。显然，SC组的术后生存率显著高于SS组。

SC组小鼠术后高存活率在很大程度上可归因于手术操作的简便性。由于使用了一次性结扎夹，SC组的平均手术时间显著短于SS组（20.9 ± 3.18 分钟 vs. 43.9 ± 3.03 分钟，p < 0.05）（图4）。术中SC组袖状胃切口处仅有少量渗血，而SS组则更常出现出血情况。此外，术后第一天，SC组小鼠表现出更为活跃的行为，例如自由攀爬和进食；相比之下，SS...

讨论

采用一次性结扎夹建立小鼠袖状胃切除术（SG）模型，该手术方法简便、高效且可重复。基于夹子的技术在治疗效果上始终与传统的缝线袖状胃切除术模型相当，同时显著缩短了手术时间，并提高了术后生存率。

小鼠胃窦-缝合模型的手术技术本身并不复杂，许多在血管缝合方面有经验的外科医生均可成功实施该操作。一项涵盖82项研究的综述报道，在小鼠胃窦模型中，术后平均死亡率为17%¹²。不稳定或难以重复的动物模型不适合作为研究工具。传统的小鼠胃窦-缝合模型具有操作复杂、耗时较长、学习曲线陡峭等特点，且在很大程度上受到精细解剖结构的影响。首先，小鼠胃部密集的小血管网络在切割和缝合过程中易导致明显出血。其次，胃内容物可成为污染源，增加术后感染风险⁹。最后，切除部位的较大创面可能导致渗出增加，并在术后与邻近组织和器官形成粘连。这些挑战在我们的预实验中普遍存在。

一次性结扎夹在临床实践中常用于永久性闭合血管和胆管，可提供高度可靠且无渗漏的密封效果。结扎夹内表面带有细密...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无菌溶液	Prosperich	HC-3566	消毒胸部和腹部皮肤
75% 酒精	Macklin	E885996-500ml	清洁手术台
动物麻醉机	YuyanBio	Yuyan-ABS	小鼠麻醉设备
施夹器	杭州康基	Φ10 mm × 330 mm	一次性结扎夹施夹器
一次性结扎夹	杭州康基	KJ-JZJ02XL	制作胃袖状切除术
电外科笔	YuyanBio	Gemini（电池供电）	术中电凝止血
Ensure	雅培实验室	H20181147	液体饮食
血糖仪及试纸	ACCU-CHEK	Guide Me	血糖监测
GraphPad 软件	美国加利福尼亚州圣地亚哥	GraphPad Prism 9	数据统计与分析
加热垫	RTtech	RT-jr01	维持小鼠术中体温
高脂饮食	Research Diets, Inc	D12492	脂肪占 60 kcal%
异氟烷	RWD	R510-22	麻醉药物
美洛昔康	阿拉丁	M129228-25g	术后镇痛药物
显微外科器械	碧云天	FS500	进行动物手术
小鼠拉钩	CHIU POK	CP-ckq	小鼠腹部手术牵开
手术缝线	金环医疗	CR537/KCR631	手术缝线