本方案评估了营养丰富的（TSB）和最低限度的（FAB）培养基成分对 铜绿假单胞菌 微通道中稳态流动环境下PAO1和PA14生物膜的发育
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摘要
摘要
致病菌Pseudomonas aeruginosa是多种医院内感染的主要病因，其日益增强的抗菌药物耐药性已构成重大的公共卫生威胁。本文提供了一套全面的实验方案，详细描述了利用微流控系统对两种关键的P. aeruginosa菌株PAO1和PA14的生物膜发育过程进行实时可视化和定量分析的方法。该方法采用光学透明的多通道微流控芯片，使细菌培养物在连续稳定的培养基流动条件下生长，培养基包括胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）或改良的最低限度苛养厌氧肉汤（FAB），并可调节其中碳源浓度，从而模拟临床环境中的实际条件。在24小时期间，通过自动化的实时成像，以高度可重复的方式记录生物膜的生长与成熟过程，包括生物膜表面积覆盖率、厚度以及表面粗糙度等参数。本实验旨在通过结果证明，两种菌株的生物膜形成均显著受到培养基营养成分变化的影响。本可视化方案的目标是为研究人员提供一种在稳定层流条件下研究生物膜动态行为的方法，所得见解有望用于开发针对医院环境中早期P. aeruginosa生物膜的非抗菌类清除策略。
引言
本方法旨在观察两种不同培养基——胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和改良最低苛养厌氧肉汤（FAB）——对两种微生物生物膜生长的影响 铜绿假单胞菌 菌株，即 PAO1 和 PA14。尽管 P. aeruginosa PAO1 和 PA14 均为常用实验室参考菌株，其中 PA14 菌株可感染更广泛的宿主，范围从植物到无脊椎动物1TSB 营养肉汤是一种通用型培养基，含有 2.5 g/L 葡萄糖作为碳源，因其成分为酪蛋白和大豆蛋白胨，可提供有机氮源及天然糖类，同时含有氯化钠以维持渗透压平衡，故可培养多种细菌。2最小FAB培养基则仅含有极低浓度（降低50倍）的单一碳源，浓度为0.05 g/L，用于探究厌氧细菌的生长需求。PAO1和PA14菌株均暴露于单向层流条件下，产生0.01 Pa的低壁面剪切应力。该剪切应力值常出现在 P. aeruginosa-定植部位，包括囊性纤维化患者的支气管和胃肠道。通过实时测定生物膜百分比表面覆盖率、厚度以及表面粗糙度的算术平均值，对24小时内生物膜的生长情况进行测量。
P. aeruginosa 的生物膜是导致相当大比例的医院获得性感染的主要原因，也是囊性纤维化患者死亡的重要病因3,4
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方案
1. 玻璃器皿清洗
- 将两个200 mL和三个1 L的玻璃瓶浸入10%盐酸（HCl）溶液中，用于培养基和琼脂的制备，室温下浸泡约5分钟。
注意：盐酸具有腐蚀性。所有涉及酸的操作均应在化学通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目用具）。 - 随后将玻璃器皿从HCl溶液中取出，用自来水冲洗两次，再用蒸馏水（dH2O）冲洗一次。
2. 胰蛋白胨大豆肉汤培养基的制备
- 配制TSB溶液：使用洁净的称量舟和精密天平称取6 g/200 mL的TSB粉末。
注：所用TSB粉末的成分为：葡萄糖（2.5 g∙L-1）、磷酸氢二钾（2.5 g∙L-1）、酪蛋白胰酶消化物（17 g∙L-1）、大豆粉木瓜蛋白酶消化物（3.0 g∙L-1）和氯化钠（5.0 g∙L-1）。 - 使用量筒量取200 mL去离子水（dH2O），倒入先前清洗干净的玻璃瓶之一中。
- 将6 g TSB粉末加入盛有200 mL dH2O的洁净玻璃瓶中，密封瓶口，混匀约2分钟，使粉末完全溶解，制成TSB溶液培养基。
- 将TSB培养基溶....
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结果
本部分概述了应用上述实验方案时的代表性结果。所有实验均至少进行了三次独立的生物学重复，每次包含六个平行通道，数据以均值 ± 标准差表示。所有图表中的误差线均代表标准差，具体定义见图注。
PAO1 和 PA14 菌株的生长 在37 °C、TSB培养基中、0.01 Pa流体动力壁面剪切应力条件下培养24小时的结果如图所示 图1图中显示，在实验初期，PAO1菌株在基质表面的定植比例高于PA14菌株。PAO1菌株较高的初始附着速率与现有文献一致，表明该菌株具有相对较快形成表面附着的表型特征19然而，在实验进行约11小时时，PA14占据的表面面积超过PAO1菌株，而PAO1菌株所定植的基质面积则开始下降。PAO1菌株基质定植减少可能归因于细胞脱落和/或细胞死亡。PA14占据较大比例的表面是该菌株逐代附着过程的特征，这解释了实验初期生物膜形成水平较低，而随着实验进行逐渐增加的现象。1在此交叉之后，PA14菌株对基质表面的定.......
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讨论
该方案中的多个关键步骤共同作用，相较于其他更传统的检测方法，能够实现对生物膜形成更为全面且准确的分析。其中关键环节之一是使用48孔微通道板，其微通道尺寸为350 µm × 70 µm × 4 mm（宽 × 高 × 长）。这些尺寸可特异性地模拟医院环境中存在的流动条件和微环境，例如尿道导管或囊性纤维化患者肺部细支气管中的情况。12,21,22,23每次实验运行设置六个平行通道，每项实验至少重复三次。由于细菌行为具有内在的随机性，这种重复对于确保数据的完整性至关重要。24,25通过精确复制这些微尺度条件并进行多次重复实验，本研究的发现对实际应用具有显著更高的相关性和适用性 在体 相较于使用少量重复和宏观通道获得的环境，该系统能提供更具代表性的环境。尽管如.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢谢菲尔德大学机械、航空航天与土木工程学院（MAC）提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| (NH4)2SO4 | Acros Organics | 7783-20-2 | 用于改良FAB培养基 |
| 48孔0-2 Pa微通道板 - 玻璃盖玻片 | Cell Microsystems | 910-0047-5Pack | 用于培养基流动和生物膜 生长的微通道，支持实时成像 |
| -80 °C 冰箱 | Thermo Fisher Scientific | 1.16057E+15 | 用于保存甘油菌种，以备后续使用 |
| 琼脂，细菌级 | Acros Organics | 443570010 | 用于琼脂平板——细菌培养 |
| 分析天平 | VWR | VWRI611-2297 | 用于称量培养基各组分 |
| 高压灭菌器 | Priorclave | 4304 | 用于玻璃器皿的灭菌 |
| BioFlux 1000HT | I&L Biosystems | https://il-biosystems.com/cell- microsystems/device/bioflux-1000ht- shear-flow-system/ | 用于微通道中的流体流动和生物膜生长实验 |
| BioFlux 控制模块 | I&L Biosystems | https://il-biosystems.com/cell- microsystems/device/bioflux-1000ht- shear-flow-system/ | 用于设置和监测微通道内的培养基流动和生物膜生长 |
| BioFlux Montage 软件 | I&L Biosystems | https://il- biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf | 用于设置和监测微通道内的培养基流动和生物膜生长 |
| CaCl2 | Fisher Scientific | 10043-52-4 | 用于改良FAB培养基 |
| CaSO4.2H2O | ChemCruz | A1719 | 用于配制1 L最小金属溶液 |
| 透明聚苯乙烯96孔板 | Corning, Costar | CLS7007 | 用于活菌计数 |
| CoSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | 10026-24-1 | 用于配制1 L最小金属溶液 |
| CuSO4.5H2O | Honeywell | 209198-100G | 用于配制1 L最小金属溶液 |
| Eppendorf 管 3810X | Eppendorf | 30125150 | 用于铜绿假单胞菌甘油菌种保存 |
| FeSO4.7H2O | VWR International Ltd. | 284005E | 用于配制1 L最小金属溶液 |
| Fiji (ImageJ) | 美国国立卫生研究院 | https://imagej.net/software/fiji/downloa ds | 用于Z轴堆栈图像处理 |
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | 用于葡萄糖改良FAB培养基 |
| 甘油 | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | 用于铜绿假单胞菌甘油菌种保存 |
| H3BO3 | Fisher Scientific | 10043-35-3 | 用于配制1 L最小金属溶液 |
| Hamamatsu Orca-Flash 4.0 相机 型号 C11440- 42U | Hamamatsu | C11440-42U | 用于微通道流动和生物膜生长 实验的实时成像 |
| KH2PO4 | Fisher BioReagents | 7778-77-04 | 用于改良FAB培养基 |
| 甲基化酒精 | Sigma-Aldrich | 2857 | 用于在使用前后清洁微生物操作柜 |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100G | 用于改良FAB培养基 |
| II级微生物操作柜 | Thermo Fisher Scientific | 42111226 | 用于在无菌条件下执行实验步骤，避免细菌、肉汤或琼脂被污染 |
| 小型培养箱 | Labnet International | sn03171014 | 用于从-80 °C 冰箱中取出后解冻PAO1和PA14菌株 ，以及初始24小时细菌琼脂平板培养 |
| MnSO4.H2O | Sigma-Aldrich | 10034-96-5 | 用于配制1 L最小金属溶液 |
| Na2HPO4.2H2O | Sigma-Aldrich | 10102-40-6 | 用于改良FAB培养基 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886-500G | 用于改良FAB培养基 |
| NaMoO4.H2O | Sigma-Aldrich | 10102-40-6 | 用于配制1 L最小金属溶液 |
| 精密天平 | VWR | VWRI611-2299 | 用于称量培养基各组分 |
| 冷冻离心机 | Heraeus | 40289841 | 用于将铜绿假单胞菌培养物与 上清液分离以制备甘油菌种 |
| 半微量比色皿 | Alpha Laboratories | X72053 | 用于光密度测量 |
| 摇床培养箱 | INFORS HT | https://infors- ht.com/en/products/incubator- shakers/multitron-standard | 用于过夜培养 |
| 柠檬酸钠 | Sigma-Aldrich | 71498-250G | 用于柠檬酸钠改良FAB培养基 |
| 无菌塑料接种环 | Microspec | 15782105 | 用于将铜绿假单胞菌PAO1和PA14接种至琼脂平板和Falcon管中 |
| 胰蛋白酶大豆琼脂，含vegitone | Millipore | 14432-500G-F | 用于琼脂平板——细菌培养 |
| 胰蛋白酶大豆肉汤 | Sigma-Aldrich | T8907 | 脱水培养基 —— 6 g/200 mL |
| 一级水分配器 | Thermo Fisher Scientific | sn42103311 | 用于提供去离子水 |
| ZnSO4.7H2O | Fisher Scientific | 7446-20-0 | 用于配制1 L最小金属溶液 |
参考文献
- Grace, A., Sahu, R., Owen, D. R., Dennis, V. A. Pseudomonas aeruginosa reference strains PAO1 and PA14: A genomic, phenotypic, and therapeutic review. Front Microbiol. 13, 1023523(2022).
- T8907 Tryptic Soy Broth. , Sigma-Aldrich. Available from:
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重印与许可
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