利用微流控系统实时可视化营养介质对 铜绿假单胞 菌生物膜发育的影响

摘要

本方案评估富营养介质（TSB）和极低营养介质（FAB）对铜 绿假单胞 菌、PAO1和PA14生物膜在微通道稳态流动环境中形成的影响。

摘要

致病细菌铜绿 假单胞 菌是多种院内感染的主要原因，其抗菌耐药性日益增强，使其成为重大的公共卫生威胁。本文提出了一个全面的方案，详细介绍了利用微流控系统在两种关键金 黄色假单胞 菌菌株PAO1和PA14中实时可视化和定量生物膜发育的方法。该方法采用光学透明、多通道微通道板，使细菌培养物连续、稳定地接收培养基，包括含含三氯大豆汤（TSB）或具有不同碳源浓度的改良最小精细厌氧汤（FAB），从而模拟临床环境中的条件。在24小时内，自动实时成像以高度可复现的方式捕捉生物膜的生长和成熟过程，包括生物膜表面积覆盖率、厚度和表面粗糙度。实验目标是利用这些结果证明，两种菌株的生物膜形成都受到营养培养基成分变化的显著影响。该可视化方案的目标是为研究人员提供一种方法，在稳定层流条件下研究生物膜动态，所获得的见解可用于开发替代的非抗菌策略，在院内环境中根除早期金 黄色单胞菌 生物膜。

引言

该方法的目标是观察两种不同培养基——三叶酸大豆汤（TSB）和改良极小致厌氧汤（FAB）——对两种铜 绿假单胞 菌菌株（PAO1和PA14）生物膜生长的影响。虽然P . aeruginosa 的PAO1和PA14都是常见的实验室参考株，但PA14株感染的宿主比例更高，从植物到无脊椎^动物1。TSB营养液是一种通用培养基，含2.5克/升葡萄糖作为碳源，能够培养多种细菌，因其含有酪蛋白和大豆肽类，提供有机氮和天然糖分供应，同时含有氯化钠以维持渗透平衡²。相比之下，最小FAB培养基采用最低浓度（50倍还原）单一碳源，浓度为0.05 g/L，以探索厌氧细菌的生长需求。PAO1和PA14应变均暴露于单向层流，导致壁面剪切应力低至0.01 Pa。这种剪切应力值通常存在于P . aeruginosa定殖部位，包括囊性纤维化患者的支气管和胃肠道。通过实时评估生物膜百分比、表面积覆盖率、厚度和表面粗糙度的算术平均值，测量了24小时内的生物膜生长。

金银杆菌生物膜占院内感染的显著比例，是囊性纤维化患者死亡的主要原因之一（^3,4,5）。此前关于碳源水平对细菌生物膜发育影响的研究忽视了水动力流动在生物膜形成中的关键作用，使用的剪应力值不代表P. aeruginosa感染部位，或仅进行了实验后生物膜动力学和形态学分析 ^6,7.该方法通过利用生物膜在稳态流动条件下实时成像，在微流控通道内实现，该通道与囊性纤维化患者的生理环境极为相似，从而解决了这些局限性。

该方法相较于用于研究生物膜形成的其他技术具有显著优势。在24小时生物膜生长期内应用实时成像，确保正在形成的生物膜不受干扰，无需干燥或化学改造，避免了成分的变化，并比需要样品操作的方法更具有代表性。此外，通过施加稳定的流体动力学流动条件并在很大幅度内调整碳源浓度，该程序更准确地复制了P. aeruginosa院内感染部位的生理环境。这使得它比使用静态检测的方法更具代表性，比如96孔微量滴度板或试剂试卷，后者无法捕捉流体流动对生物^膜显影的关键影响（^9,10,11）。

所采用的微流控装置是因其尺寸与肺部部分相似，如细支气管和支气管¹²。此外，P. aeruginosa感染是严重烧伤患者的重大隐患，其血糖水平可能显著波动于正常范围^13,14。

虽然该方案专门使用两种 P. aeruginosa菌株，但该方法同样适用于研究其他引起感染或在类似条件下定殖区域的细菌早期发育。此外，其他营养介质成分以及流动条件（如脉动和振荡流动，或更高的壁面剪切值）也可以用同样的方法进行研究。

方案

1. 玻璃器皿清洗

1. 将两瓶200毫升玻璃瓶浸泡用于培养基和琼脂，以及三瓶10%盐酸（HCl）浸入室温下约5分钟。
   注意：盐酸具有腐蚀性。所有酸处理均需在化学烟雾柜内进行，同时佩戴适当的个人防护装备（实验服、手套和护目镜）。
2. 随后，将玻璃器皿从盐酸浴中取出，用自来水冲洗两次，再用蒸馏水（dH₂O）冲洗一次。

2. 三联大豆汤培养基制备

1. 准备TSB溶液，使用干净的称重船称重6克/200毫升TSB粉末，并用精密天平秤。
   注：所用TSB粉末的成分如下：葡萄糖（2.5克·^L-1）、磷酸二钙（2.5克·^L-1）、胰腺酶消化酪蛋白（17克·^L-1）、大豆粉帕帕伊斯消化（3.0克·^L-1）和氯化钠（5.0克·^L-1）。
2. 用测量圆筒测量200毫升dH_2O，倒入事先清洗过的玻璃瓶中。
3. 将6克TSB加入装有200毫升dH_2O的干净玻璃瓶中，密封瓶盖，搅拌约2分钟溶解粉末，制成TSB溶液培养基。
4. 高压灭菌器TSB培养基溶液在121°C温度、1.5大气压下浸泡15–20分钟，以灭菌溶液。
   注意：（暂停点）TSB溶液可在使用间隔室温（约20°C）储存，用于未来实验。

3. 严格的厌氧汤液制备

1. 准备FAB介质痕量金属溶液。
   1. 在称重0.5–210克时使用独立的干净称重船和铲子，称重0.5–210克时使用精密天平，称重0.001–0.5克时使用分析天平。测量以下组分及其数量：CaSO_{4.2H 2}O（200 mg∙^L-1），FeSO 4.7H₂O（200 mg∙^L-1），ΜSO₄。氢氧化酶_2O（20毫克·^L-1），CuSO_{4.5H 2O}（20毫克·^L-1），ZnSO_{4.7H 2O}（20毫克·^L-1），CoSO_{4.7H 2O}（10毫克·^L-1），NaMoO₄。H₂O（10 mg∙^L-1），H₃BO₃（5 mg∙^L-1）^7,9。
   2. 将每种成分加入一个1升清洁玻璃瓶中，瓶内含1升_2O的dH，并与_2O的dH充分混合。
   3. 将混合物加入剩余的两个1升消毒玻璃瓶中，各加入1毫升，并加入1升_2O的dH，彻底混合。
2. 准备20 mM柠檬酸钠补充剂FAB进行隔夜培养
   1. 使用单独的干净称重船和刮刀测量以下成分及其数量，称重0.5-200克时使用精密天平，称重0.001-0.5克时使用分析天平，测量0.001-0.5克质量时使用分析天平：柠檬酸钠（20 mM），（NH₄）₂SO₄ （2 g∙^L-1）， Na₂HPO_{4.2H 2}O（6 g∙^L-1）， KH₂PO₄（3 g∙^L-1）、NaCl（3 g∙^L-1）、MgCl₂（93 mg∙^L-1）和 CaCl₂（11 mg∙^L-1）^7,9。
   2. 将所有成分加入剩余的1升消毒玻璃瓶中，瓶内含1升dH_2O，并加入1毫升微量金属溶液。
   3. 充分搅拌。
3. 制备0.3 mM葡萄糖补充剂FAB用于生物膜生长。
   1. 用0.3毫米葡萄糖替代20毫米的柠檬酸钠。使用步骤3.2.1中列出的相同组件和质量。
   2. 在剩余的1升玻璃瓶中，将0.3毫米的葡萄糖FAB成分加入1毫升dH_2O和1毫升微量金属溶液中，充分混合。
4. 在121°C的蒸汽温度和1.5大气压下，高压灭菌15-20分钟，以消毒介质。
   注意：（暂停点）制造制造介质溶液可在室温（约20°C）下储存，用于未来实验。

4. TSB琼脂制备

1. 用精密天平和洗净称重船和刮刀测量8克/200毫升TS琼脂。
2. 在另一艘称重船上，使用相同的精确天平，测量1克/200毫升的细菌级琼脂。
3. 用量筒测量200毫升_2O的dH，倒入最终的、事先清洗过的玻璃瓶中。
4. 将两种琼脂成分倒入200毫升的dH₂O中并充分混合。
5. 在121°C温度、1.5大气压下，高压灭菌15–20分钟，以灭菌介质。
   注意：（暂停点）TSB琼脂可在使用间隙以室温（约20°C）储存，未来实验中使用前需重新加热。

5. 培养皿绿 假单胞菌（Pseudomonas Aeruginosa ）培养

1. 将琼脂放入微波炉中约5分钟，或直到溶液变成液态。
2. 打开并消毒2级安全柜表面，使用70%乙醇溶液，准备使用。请在本节内完成以下所有步骤，并在此二类安全柜内完成。
3. 将25毫升琼脂溶液倒入50毫升小瓶，倒入90毫米培养皿中，等待琼脂凝固。
4. 从-80°C冷冻室中取出P . aeruginosa 的PAO1和PA14冷冻库存。将肉质放入37°C的培养箱中，约5分钟，或直到内容物完全解冻。
5. 将接种环浸入解冻的 金银杆菌 高压中，将样品涂抹在琼脂中。
6. 对另一个 金刚杆菌 菌株重复步骤5.5，创建两个独立的 P. aeruginosa 培养皿，一个用PAO1菌株，另一个用PA14菌株。
7. 在每个培养皿上标注P . aeruginosa 菌株、复活日期和首字母，然后放入37°C培养箱中16–18小时。
   注：（暂停点） P. aeruginosa PAO1和PA14培养皿可在4°C下储存，保存期最长可达4周，并用于未来实验。

6. 铜 绿假单胞菌 PAO1 和 PA14 甘油库存

1. 打开并消毒二级安全柜，选择八个50毫升小瓶装入夜间培养液。
2. 使用先前制备的TSB和柠檬酸钠FAB培养基（第3节），向八个小瓶中的四个倒入5毫升TSB培养基，向剩余四个小瓶注入柠檬酸钠最小FAB培养基。
3. 利用先前培养的培养皿和接种环，接触 P. aeruginosa PAO1培养皿中的五个独立菌落，转移到TSB小瓶中。对柠檬酸钠FAB培养基和 P. aeruginosa 菌株PA14培养皿重复此操作。
4. 将清洁的接种环直接浸入剩余的四个TSB和柠檬酸钠FAB培养基小瓶中，形成对照。
5. 将八个小瓶全部放入摇晃培养箱中，在200转/分钟、37°C下孵育16至18小时，并清晰标记。
6. 取回培养小瓶，确保接种金 黄色单胞菌 的样本浑浊，且用作对照的样本保持清白。
7. 将四支接种过P . aeruginosa的小瓶以4000× 克 离心，20°C离心5分钟，以分离P . aeruginosa 与培养基。确保离心机保持平衡。
8. 忽略上清液，离心后将P. aeruginosa颗粒重新悬浮，使用含15%甘油的1毫升溶液、150微升甘油和850微升新鲜TSB或柠檬酸钠FAB培养基。
9. 将再悬浮培养物转移到1毫升小瓶中，放入-80°C冷冻室。
   注意：（停顿点）甘油库存可在-80°C下长期储存，并用于未来实验。

7. 测量隔夜培养物的光学密度

1. 重复步骤6.1–6.5，仅使用两瓶TSB中质小瓶，一瓶为对照，另一瓶为PAO1 金锈菌 株。
2. 将1毫升TSB培养基移入1毫升分光光度计小瓶，置于II类安全柜内，并将0.9毫升TSB培养基转移到第二支小瓶，并补充0.1毫升过夜培养液。
3. 将分光光度计设置为600 nm，使用1 mL TSB分光光度计小瓶校准机器，测量0.1 mL悬浮小瓶¹⁵的光学密度。
   1. 如果测得的吸光度未达到0.1，则重新计算所需的悬挂容积。
      注意：达到吸光度读数0.1（_V1）所需的悬浮体积，可通过初始0.1毫升悬浮液瓶吸光读数_C1、悬浮液调整所需吸收度_C2以及期望的浓浓度过夜悬浮液体积_V2计算：
      C₁V₁ = C₂V₂
      在上述例子中，如果C₁ = 3.59，C ₂ = 0.1，V ₂ = 10 mL，则需要的夜间悬浮液体积为10 mL溶液中的0.279 mL。
4. 将10毫升TSB培养基装入50毫升小瓶中，去除与制造10毫升、外径0.1英寸、600纳米悬浮液所需悬浮液体积相同的TSB培养基。利用过夜培养，加入计算的懸浮液体积，并进行约5秒的漩涡混合。
5. 将1毫升调整后的10毫升悬浮液转移到分光光度计瓶中，重新测量吸光度以确保为0.1。
6. 对PA14和TSB培养基，以及两种 P. aeruginosa 菌株和柠檬酸钠FAB培养基重复上述7.1–7.5。

8. 可活细胞计数

1. 将dH₂O转移到II类安全柜内的方形培养皿中，并使用多通道移液器将180微升液体转移到透明的96孔聚苯乙烯板¹⁶的第2至9列。
2. 将10 mL 0.1 OD 600悬浮液转移到一个独立的方形培养皿中，并使用多通道移液器将200微升悬浮液转移到96孔聚苯乙烯板的第1柱。
3. 使用多通道移液器将96孔聚苯乙烯板第1柱的悬浮液转移至通道2，随后将通道2稀释悬浮液20微升转移到通道3，重复至通道9，使悬浮液从^10-1 稀释到^10-8。
4. 将50毫升TS琼脂（第4节及步骤5.1）通过II类安全柜中用小瓶转移到方形培养皿中，放置至琼脂变浑浊。
5. 使用多通道移液器，将每孔2至9柱的10微升液体以柱状方式转移到TS琼脂培养皿，确保柱子之间不接触。
6. 在37°C下孵育TS琼脂24小时，等待转移的稀释物稳定后。
7. 通过确定培养皿是否可计数（30到300个菌落），计算每毫升（mL）的菌落形成单位（CFU）。
8. 确定所用10 mL悬浮液的稀释因子;此时悬挂被稀释至1/10（0.1 OD 600）。
9. 计算每个电镀柱的单个稀释因子。这是每根柱中添加稀释悬浮液的量，除以加入悬浮液后该柱的总体积。在96孔板的第2柱（培养皿第1列）的情况下，20 μL/200 μL = 1/10。
10. 通过将每列的单个稀释因子相乘来计算总系列稀释因子。
    注：在这种情况下，由于每列间传递20微升，使每列井总体积为200微升，每个序列稀释量为1/10。使总级数稀释1×^10-8。
11. 确定从96孔板转移到培养皿时的电镀稀释因子。要测定CFU/mL，将每条基层（10微升）的体积除以1 mL。在这种情况下： 。
12. 通过将原始悬浮稀释因子（0.1）乘以总系列稀释因子（1 × ^10-8）和电镀稀释因子（）来确定最终稀释因子。
13. 计算原始样品中的CFU∙^mL-1 ，将板上的CFU乘以最终稀释因子的倒数。
    注意：在这种情况下，如果计数为200 CFU，这意味着执行200 × 1/1 × ^10-8，CFU /mL为2 ×^{10 10} CFU∙^{mL-1 17}。

9. 微流控系统的设置与实验运行

1. 将每株P . aeruginosa 菌株接种5毫升培养液汤，形成隔夜培养液，并在37°C下培养16–18小时。
2. 搭建微流控系统和相关软件。
   1. 按以下顺序激活微流控系统组件：电源、微流控系统控制器、CMOS摄像头、机箱加热器、显微镜、计算机及相关显示器。
   2. 在提示时，输入多通道板侧面的48孔0–2 Pa多通道板相关条码，激活微流控软件并启动相应的控制模块接口。
3. 设置 P. aeruginosa 多通道板孔接种程序。
   1. 将隔夜培养的光学密度调整为0.1 OD₆₀₀。
   2. 将50微升0.1 OD 600悬挂液并联地输送到II类安全柜内六个通道的出口井。
      注意：为最大化异常结果识别的可能性，会同时并行运行六个通道。
   3. 更换48孔多通道板盖，并将其转移到系统孵化器内的可移动台并固定。
4. 设置P . Aeruginosa 多通道板通道接种程序。
   1. 通过微流控系统控制模块播种微流控通道，方法是选择： 手动 > 柱1–4 >流体 ：TSB，37°C >，最大 剪切（Pa）：0.1 （1 dyne∙^cm-2 = 0.1 Pa），并选择48孔0–2 Pa板图的出口井。
   2. 选择中 止 按钮，在2–4秒后停止流动，并离开板块30分钟，以确保细胞在开始连续流动前已附着在通道基底上。
      注意：30分钟的持续时间允许重力帮助浮游金 黄色假孔杆 菌附着在底部通道壁上。这段时间会因细菌和营养培养基类型而异。
   3. 将多通道板从可移动培养箱阶段移除，并将1毫升新鲜TSB转移到II类安全柜中六个通道的入口井。
   4. 将多通道板转移到孵化器内的可移动台并固定好。
5. 设置 自动运行。
   1. 确保24小时实验中使用的流量与自然界中P. aeruginosa分布的区域相关，方法是手动>剪切应力：0.01 Pa，并记录显示的体积流量（μL⋅^h-1）。确保该值为8.2 μL⋅^h-1，对于48孔微通道板。
   2. 将体积流量转换为^m3∙^s-1，计算河道截面积（^m2），并确定在0.01 Pa流体动力剪切应力下的流速。
      注意：通过使用并重新排列流体体积流量方程，可以计算流体通过通道的速度：
      
      其中U为流体速度（m∙^s-1），A为多通道板中通道的微通道截面积（m^²）。
   3. 利用TSB介质的密度ρ和动态粘度（μ）计算流动雷诺数，并确保在流体流动范围内发现 金银杆菌 生物膜。对于0.01 Pa的流体动力剪应力，确保TSB和FAB介质的雷诺数分别为0.0117和0.0165。如果超出该范围，检查液体状态是否设置为TSB。
      
      其中 D_h 是所用微通道的液压直径，采用以下方式获得：
      
      其中，w和h分别代表所用微信道的宽度（m）和高度（m）。
   4. 计算流体显影长度，以确保图像采集区域内的流体流动完全显影。
      注意：层流通过通道的显影长度可利用雷诺数Re和通道的液压直径 D_h计算：
      L_dev = 0.06ReD_h
   5. 设置自动运行： 编辑自动运行 > 协议设置 > 持续时间：24小时，重复次数为1次，剪应力为0.01 Pa。保存 协议。
   6. 在序列 设置 标签中，通过重复一次新创建的协议，创建新序列，覆盖通道1–6，选择流体： TSB，温度为37°C。保存这段序列。
6. 使用 多维采集 窗口设置图像采集。
   1. 使用系统软件选择“ 多维采集 ”，然后点击 “实时 ”按钮（ 多维采集 窗口左下角）。通过显微镜舞台，使用 实时查看 按钮和相机放大倍率5×至40×在显微镜触摸屏上查看1至6频道，一次显示相机视野中的一个通道。
   2. 准备相机进行图像采集： 多维采集 > 保存：选择一个目录以保存图像>延 时： 时长：24小时，与流体动力流动时长相同> 时间间隔：每次拍摄图像之间的时间间隔，设定为10分钟。
   3. 通过选择波长>输入相机设置 照明：明场 50% 相机 50%：黑白 > 自动曝光：每次拍摄>获取：每个时间点 >自动对焦：绝不。
   4. 通过将放大倍率设为20×确定相机位置，生成665.6微米×665.6微米的视场，并导航至频道观看区中间，频道号将在中央刻印。
   5. 添加舞台位置以便相机捕捉，然后导航到 “舞台 标签”位置，选择添加按钮将其添加到目录。
      1. 对距离通道观测区入口处0.9984毫米的上游点和3.0016毫米的下游点重复此法，该位置代表摄像机视野的中间点。
         注意：这些成像位置的选择旨在展示观察区域沿线生物膜的生长，同时确保内部流动充分发育。这样每个微通道就要拍摄三张图像，在这种情况下，每10分钟拍摄18张图像。
7. 进行实验运行
   1. 在系统 控制模块 窗口中，选择 自动运行 > 运行设置 > 序列：选择创建的0.01 Pa序列，然后选择 开始。
   2. 紧接着，导航到 多维采集 窗口> 获取。这开始每10分钟采集18张图像，实验结束时产生2610张图像。
      注：上述部分是在初次实验约48小时后，在相同条件下通过另外六个微通道再现的。

10. Z栈累积

1. 每次实验运行结束时，选择三个通道，并以40×倍率获得沿通道排列的三段z叠加，方法是打开主模块>多维采集：取消勾选除“Z系列”外的所有选项。
2. 在多 维采集 中选择通道某一部分后，进入Z系列并 更改 互动 设置>：增量：0.5 ，取消勾选两个勾选框。
3. 使用显微镜对焦旋钮，旋转直到生物膜失焦，然后选择 “顶顶置于电流”输入z距离。重复此操作，但将对焦旋钮反向旋转，选择 “设置底部至当前”。这使显微镜有足够的距离捕捉z叠。
4. 在 保存 窗口中选择一个文件夹保存z堆栈，然后在窗口右下角选择“ 获取 ”开始采集。

11. 实验后图像与数据分析

1. 获取生物膜百分比表面积覆盖数据。
   1. 将采集到的图像加载到系统软件中，方法是选择：分析工具> 查看多维数据 > 选择基础文件 > 选择目录：导航并选择包含已保存图像的文件夹> 查看>波长1，在中央横向显示已采集图像数量的方块中，右键点击顶部的小灰色框， 左角。
   2. 逐一加载每个通道段的图像，选择 舞台位置：选择查看的位置> 加载图像。将图像系列保存为TIFF文件。
   3. 通过选择暗物体的阈值图像>自动阈值突出生物膜，然后使用矩形区域工具对图像进行边界划定。
      注意：阈值图像左侧的滑块可上下移动以调整阈值强度，以更好地区分生物膜和背景。如果图像有阴影，应在没有阴影的区域边框，因为阴影可能默认被高亮，从而改变测量值。
   4. 通过在系统软件窗口中选择“MM 标准测量>>区域测量”，生成矩形边界内高亮生物膜的数据表，包括阈值面积百分比，获取图像中24小时实验中生物膜覆盖率百分比的数据。选择打开日志以打开并保存日志文件，选择F9：日志数据以将数据输入日志文件。
   5. 打开电子表格，利用每个通道段的24小时生物膜数据，创建一个图表，显示24小时内生物膜覆盖百分比。
2. 获取生物膜厚度和算术平均表面粗糙度。
   1. 通过将已保存的文件拖入斐济控制栏，将 z-stack 保存为 Fiji（ImageJ），并转换为 8 位图像： Image > Type > 8-bit。
   2. 提高生物膜与通道表面之间的对比度以消除任何不必要的噪点： 图像 > 调整 > 亮度/对比度。
   3. 对图像进行阈值调整，将生物膜像素值设为255（白色），背景像素值为0（黑色）：图像>调整>阈值。
   4. 设置图像比例，分析>设置比例>像素单位：2048 >已知距离：332.8 >像素宽高比：1.0 >长度单位：μm。
      注：已知距离为332.8微米，因为所用滨松相机的视场为2048×2048像素，每个像素大小为6.5微米，图像采用40×倍率拍摄。
   5. 使用自定义宏¹⁸ （补充文件1）分析Z堆栈，该宏计算并加总每个Z堆栈切片上的生物膜表面积，并利用输入刻度值计算序列厚度，从而确定体积。或者，通过将计算出的体积除以表面积来求出生物膜厚度。
   6. 通过下载ImageJ（非斐济）插件 SurfCharJ 并保存在 插件文件夹 中，获取每个z系列生物膜的算术平均表面粗糙度值。
   7. 将 z-stack 上传到 ImageJ，方法是将已保存的堆栈拖到控制栏，并将其转换为 32 位图像： 图片 > 类型：32-bit。
   8. 创建一个表面图，显示堆栈表面灰值的变化： 分析 > 图剖面 > 更多：高分辨率图。将高分辨率图转换为32位。
   9. 通过启动 SurfCharJ 插件获得算术平均表面粗糙度值： Plugins > SurfCharJ > 粗糙度计算：平均采样长度 （）： 10。
      注意：SurfCharJ 插件利用 z 堆栈表面上的各种灰色值来计算算术平均表面粗糙度。将生成一个包含表面粗糙度参数的表，唯一感兴趣的参数是算术算术平均面粗糙度R_a。表格的数值需要从像素转换为微米。

结果

本节概述了应用上述方案时的代表性结果。所有实验均至少使用三个独立的生物复制体进行，每个复制体由六个平行通道组成，数据以均值±标准差表示。所有图中的误差条都表示标准差，如图例所示。

图1展示了PAO1和PA14应变在37°C、TSB介质中以及0.01 Pa流体动力学壁面剪切应力下的生长，历时24小时。图示显示，PAO1菌株在实验初期占据的基底表面比例高于PA14。PAO1菌株较大的初始附着率与现有文献一致，表明该菌株具有较快形成表面附着的表型¹⁹。然而，PA14菌株定殖的表面积在实验进行约11小时后超过了PAO1菌株，而PAO1菌株占据的底物面积开始减少。PAO1对底物定殖的减少可能是由于细胞脱离和/或细胞死亡所致。PA14占据表面的大量比例反映了菌株的代际附着过程，解释了实验初期生物膜形成较低及实验进行时生物膜水平增加的原因^。在此交叉之后，PA...

讨论

构成该方案的多个关键步骤，使得比传统方法更全面、更准确地分析生物膜形成。关键组成部分是使用48孔微通道板，微尺度通道尺寸为350微米×70微米×4毫米（宽×高×长）。这些尺寸特意复制了医院环境中的流动条件和微环境，如尿导管或囊性纤维化患者的肺支气管（12,21,22,23）。每次实验运行还使用六个并行通道，每次运行至少重复三次。由于细菌本身具有随机性，这种重复对于确保数据完整性至关重要^24,25。通过精确复制这些微观条件并多次重复，本研究结果比通过少数复制和宏尺度通道获得的结论在体内环境中更具相关性和适用性。尽管如此，48孔微槽板仍是一种消耗品，每块板最多只能复制24次，之后需要新的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
（NH4）2SO4	阿克罗斯有机	7783-20-2	针对改良型FAB介质
48孔0-2Pa微槽板 - 玻璃盖片	细胞微系统	910-0047-5 背包	用于培养基流动和生物膜 生长的微通道，支持实时成像
-80 & deg;C型冷冻柜	赛莫飞世尔科学	1.16057E+15	用于储存甘油库存以备进一步使用
琼脂，细菌级	阿克罗斯有机	443570010	琼脂培养板——培养细菌
分析平衡	VWR	VWRI611-2297	用于测量所用介质的组成部分
高压灭菌器	Priorclave	4304	用于消毒玻璃器皿
生物通量1000HT	I&L 生物系统	https://il-biosystems.com/cell- 微系统/设备/生物通量-1000ht- 剪切流系统/	用于微通道流动和生物膜生长实验
生物通量控制模块	I&L 生物系统	https://il-biosystems.com/cell- 微系统/设备/生物通量-1000HT-剪切流系统/	建立并监测微通道内的培养基流动及生物膜生长
BioFlux 蒙太奇软件	I&L 生物系统	https://il- biosystems.com/app/uploads/2025/01/Bi oFlux_Overview_.pdf	建立并监测微通道内的培养基流动及生物膜生长
CaCl2	费舍尔科学	10043-52-4	针对改良型FAB介质
CaSO4.2H2O	化学克鲁兹	A1719	对于1升最小金属溶液
透明聚苯乙烯96孔板	科宁，科斯塔	CLS7007	对于可活细胞计数
CoSO4.7H2O	西格玛-奥尔德里奇	10026-24-1	对于1升最小金属溶液
CuSO4.5H2O	霍尼韦尔	209198-100G	对于1升最小金属溶液
埃彭多夫电子管 3810X	埃彭多夫	30125150	对于金黄色葡萄干甘油菌来说
FeSO4.7H2O	VWR国际有限公司	284005E	对于1升最小金属溶液
斐济（ImageJ）	美国国立卫生研究院	https://imagej.net/software/fiji/downloa DS	Z栈图像处理
葡萄糖	西格玛-奥尔德里奇	50-99-7	对于葡萄糖改良的FAB培养基
甘油	西格玛-奥尔德里奇	56-81-5	对于金黄色葡萄干甘油菌来说
H3BO3	费舍尔科学	10043-35-3	对于1升最小金属溶液
滨松虎鲸闪光灯4.0相机型号C11440- 42U	滨松	C11440-42U	对于微通道流动和生物膜生长 实验实时成像
KH2PO4	费舍尔生物试剂	7778-77-04	针对改良型FAB介质
甲基化灵	西格玛-奥尔德里奇	2857	在使用 之前和之后清洁微生物柜
MgCl2	西格玛-奥尔德里奇	M8266-100G	针对改良型FAB介质
微生物学柜二级	赛莫飞世尔科学	42111226	执行方案步骤时， 污染细菌、汤或琼脂
迷你孵化器	Labnet 国际	编号03171014	在-80度及零下之后解冻PAO1和PA14;C冷冻和 用于初始24小时细菌琼脂板生长
MnSO4。H2O	西格玛-奥尔德里奇	10034-96-5	对于1升最小金属溶液
Na2HPO4.2H2O	西格玛-奥尔德里奇	10102-40-6	针对改良型FAB介质
氯化钠	西格玛-奥尔德里奇	S5886-500G	针对改良型FAB介质
NaMoO4。H2O	西格玛-奥尔德里奇	10102-40-6	对于1升最小金属溶液
精密平衡	VWR	VWRI611-2299	用于测量所用介质的组成部分
冷藏离心机	赫雷乌斯	40289841	分离甘油原料中<铜锈杆菌培养物中的br/>上清液
半微型卡壳	阿尔法实验室	X72053	用于光学密度测量
摇晃孵化器	INFORS 高压	https://infors- ht.com/en/products/incubator- 震动器/多重子标准	对于过夜培养
柠檬酸钠	西格玛-奥尔德里奇	71498-250G	对于柠檬酸钠改性FAB培养基
无菌塑料接种环	微规格	15782105	对于P. aeruginosa，将PAO1和PA14注射到琼脂平板和猎鹰管中
三溶大豆琼脂，蔬菜	米利波尔	14432-500G-F	琼脂培养板——培养细菌
三联大豆汤	西格玛-奥尔德里奇	T8907	脱水培养基 - 6 g/200 mL
1型饮水机	赛莫飞世尔科学	编号42103311	对于断层水
ZnSO4.7H2O	费舍尔科学	7446-20-0	对于1升最小金属溶液