一种通过单极射频在小鼠坐骨神经上诱导热损伤的模型

摘要

本研究将射频系统应用于小鼠坐骨神经，建立了热损伤神经的射频消融模型。该方法解决了小鼠外周神经热损伤模型中可控性差的问题，为神经损伤修复及神经病理性疼痛的研究提供了切实可行的建模方法。

摘要

周围神经损伤常导致神经病理性疼痛，并触发神经修复过程。尽管目前可控的物理损伤模型已较为成熟，但现有的热损伤模型仍处于探索阶段，且可控性较差。在临床实践中，射频消融（RFA）系统常被用于对组织和神经造成热损伤。RFA是一种治疗手段，已被证实可通过诱导神经热损伤有效阻断疼痛信号传导。通过调节特定参数，可改变消融范围以及受累神经分布区域的麻木程度和运动功能障碍。本研究采用单极射频系统，在小鼠坐骨神经上施加75°C持续30秒，建立了一种稳定且可控的神经损伤模型。术后第7至14天，机械缩足阈值（MWT）显著升高，并于第28天恢复。该研究填补了当前RFA神经损伤模型的空白，复制了临床上RFA操作后所观察到的神经损伤特征，为后续关于RFA诱导神经损伤的研究提供了方法学框架。

引言

神经病理性疼痛在临床管理中仍面临持续挑战，因其疼痛机制仍在不断研究之中。为了研究神经病理性疼痛的分子与细胞机制，已成功在啮齿类动物中应用脊神经结扎（SNL）¹、慢性压迫性损伤（CCI）²、坐骨神经部分结扎（pSNL）³、坐骨神经横断（SNT）⁴以及保留神经损伤（SNI）⁵等模型来模拟外周神经的物理性损伤。为了提高模型的可控性与稳定性，先前的研究已提出改进方法，例如引入压力计和选择性损伤，并已得到实施。

尽管射频技术已取得良好的临床效果，但也伴随多种副作用。例如，手术中用于止血的射频消融术（RFA）⁶，可能因器械尖端温度过高而对周围组织造成热损伤，并存在损伤周围神经的风险⁷。此外，用于治疗三叉神经痛⁸、带状疱疹后神经痛⁹及其他神经性疼痛疾病的RFA，虽可在术后缓解主要疼痛，但常伴随支配区域长期术后麻木、表层痛觉过敏及其他不适症状^10,11。因此，针对周围神经热损伤的研究逐渐受到关注。然而，现有的动物模型尚无法精确控制热损伤的温度、持续时间及作用部位，从而限制了损伤程度的一致性。

既往研究采用与恒温水浴¹²或热水泵相连的导热金属棒，将热水注入与神经直接接触的橡胶管中¹³，以模拟射频消融（RFA）对神经损伤的热效应。然而，以往的热损伤模型仅能诱导热损伤，从而排除了射频电流及其参数对神经的影响。射频消融造成的损伤是否仅由热效应引起，或射频参数变化等因素是否也对神经产生独立影响，仍有待探讨。目前缺乏直接采用射频热凝系统建立神经损伤的动物模型，这阻碍了与射频消融相关的神经损伤研究进展。本研究直接采用单极射频消融系统，通过对小鼠坐骨神经实施射频消融损伤，模拟临床射频消融操作中相关的神经损伤，为周围神经射频损伤的基础研究提供了方法学参考。

方案

动物实验经首都医科大学宣武医院实验动物中心动物伦理委员会批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行。¹⁴成年雄性C57BL/6小鼠（8–10周龄，20–25 g）在受控环境条件下分组饲养（每笼4–5只）（22 ± 2 °C，湿度50%–60%，12小时光照/黑暗循环，光照时间为07:00），可自由获取标准啮齿类动物饲料和水。所有行为学评估均在光照期的08:00至12:00之间进行。试剂、软件和设备的详细信息列于 材料表.

1. 麻醉与小鼠准备

1. 通过腹腔注射20 mg/mL的三溴乙醇溶液对小鼠进行麻醉，剂量为每10 g体重0.2 mL。
2. 使用棉签将眼用软膏涂抹于双眼表面。
3. 将小鼠置于左侧卧位。使用电动剃须刀去除小鼠右侧体表1 cm × 1 cm区域的毛发（图1）。
   注意：此步骤可增加躯干与电路负极板之间的接触面积，有助于降低电路电阻。
4. 将小鼠躯干部分以右侧朝下的方向与金属负极板接触。在躯干与负极板接触区域滴加数滴离子液体（0.9% NaCl或改良Ringer溶液；成分见材料表），以增强导电性。
   注意：确保头部和面部不接触负极板，以防止电流意外作用于眼睛或其他器官。
5. 使用胶带将左侧后肢固定于朝上位置，膝关节保持屈曲状态，并在负极板上固定。去除左大腿区域的毛发，并用75%乙醇对术区进行三次消毒。
6. 在继续操作前，通过夹捏后肢或尾部无回缩反应确认麻醉深度足够。
   注意：围手术期应避免使用局部麻醉药（如利多卡因）或非甾体抗炎药（如对乙酰氨基酚），因为这些药物可能影响术后神经行为学评估结果。

2. 射频消融手术

1. 以股骨作为参考。沿股骨长轴方向，使用显微剪刀在尾侧向外侧偏移0.5 cm处做1 cm长的皮肤切口（图2）。
2. 沿皮肤切口钝性分离股二头肌（BFM），使用显微镊寻找坐骨神经主干。坐骨神经在膝关节附近分叉（图3）。
3. 使用显微镊在坐骨神经分叉点上方约2 mm处，从周围组织中钝性分离坐骨神经主干，长度约5 mm。钝性分离过程中避免损伤血管。
   注意：若不慎损伤血管，使用无菌棉签吸除血液，并施加适当压力止血。待无持续渗血后再继续操作。
4. 将射频消融（RFA）凝固针连接至射频治疗仪。将针尖平放于肌肉组织上测试阻抗。若阻抗高于1 kΩ，使用滴管在小鼠身体与负极板之间添加离子液体，直至阻抗降至1 kΩ以下。
5. 用玻璃显微镊轻轻提起已分离的坐骨神经。将RFA针置于坐骨神经下方，使暴露的金属针尖距离坐骨神经分叉点3 mm（图4）。
6. 设置射频治疗仪参数如下：热凝模式，75 °C，30 s，频率2 Hz，脉宽1 ms。启动RFA能量输出。
7. 轻柔撤出RFA针。使用镊子提起肌肉组织，复位坐骨神经。使用6-0可吸收聚乙醇酸（PGA）缝线缝合肌肉层。使用4-0可吸收PGA缝线缝合皮肤切口。
8. 术后将小鼠置于循环温水毯（38 °C）或恒温加热垫（37–38 °C）上，表面覆盖卫生纸或毛巾，以促进毛发干燥并防止直接热损伤。
9. 将小鼠放回笼中，等待其从麻醉中恢复。常规饲养，并每日检查切口完整性，监测摄食量、饮水量及整体身体状况。

3. 实验组

1. RFA 组：按照步骤 2.1–2.9 所述，执行完整的 RFA 手术方案。
2. 假手术组：执行与 RFA 组完全相同的操作（步骤 2.1–2.5 和 2.7–2.9），但在步骤 2.6 中不启动 RFA 系统的输出。将 RFA 针置于坐骨神经下方并保持原位 30 秒，期间不施加电流，随后进入步骤 2.7。
   注意：假手术组用于控制手术创伤、麻醉、神经操作和针头放置等因素，排除热损伤的独立影响。

4. MWT 的 Von Frey 评估

1. 每次测试前，将小鼠随机放入 von Frey 测试平台，适应 15 分钟，直至探索行为停止。
   注：该平台底部设有 0.6 cm × 0.6 cm 孔径的金属网，并配有多个红色透明容器用于放置小鼠，各容器之间互不干扰。
2. 采用上下法进行 von Frey 评估¹⁵。将 von Frey 纤维丝施加于左后足底中部，力度需足以引起轻微弯曲，持续 3 秒或直至出现缩足反应¹⁶。
   注：起始测试使用 0.4 g 的纤维丝。若无反应，则使用下一更高级别的纤维丝；若出现反应，则使用下一更低级别的纤维丝。首次方向改变后继续测试四次。本研究中，实际设定 2 g 纤维丝为上限，因为在此力度下，von Frey 纤维丝会使前肢抬离地面，但未出现逃避或缩足反应。
3. 记录反应结果，并使用上下法计算器计算 50% 机械痛阈值（MWT）（von Frey 实验上下法计算器，https://bioapps.shinyapps.io/von_frey_app/）。
4. 在基线期（术前）以及术后第 7、14、21、28 和 35 天进行 von Frey 测试。

5. 背根神经节组织采集与免疫荧光染色

1. 术后第7天，采集射频消融组和假手术组的L4–L6节段背根神经节（DRG）。
2. 将组织置于4 °C条件下，用10%蔗糖-多聚甲醛固定6–12小时。
3. 在4 °C条件下，用30%蔗糖-PBS溶液对组织进行过夜冷冻保护处理。
4. 将组织包埋于最佳切割温度化合物中¹⁷。
5. 切制13 µm厚的冷冻切片，并使用非离子型表面活性剂对切片进行通透处理。
6. 用封闭剂封闭后，在4 °C条件下与多克隆抗体孵育过夜。
7. 洗涤后，在室温下与二抗孵育2小时。
8. 用抗荧光淬灭封片剂封片。

6. 统计分析

1. 以均数 ± 均数的标准误（SEM）表示正态分布的连续性数据。
2. 采用独立样本 t 检验进行组间比较。
3. 采用重复测量方差分析（ANOVA）对同一组在不同时间点的组内比较进行分析。
4. 对事后两两比较应用 Bonferroni 校正。
5. 使用统计学软件处理所有数据，并将统计学显著性设定为 P < 0.05。

结果

通过术中和术后指标确认模型建立成功。射频消融（75 °C，30 s）完成后，在拔出射频针时可观察到针尖与坐骨神经之间存在轻度黏附。这种黏附是由于接触部位局部蛋白质变性与凝固所致，提示热能传递适当且针尖与神经直接接触。若无黏附现象，则可能提示手术过程中针尖发生移位，导致神经损伤不一致或未达到理想损伤效果。

术后，RFA组小鼠在第7天和第14天的MWT显著高于术前基线水平及假手术组（P < 0.001；图5）。这种短暂的机械性感觉迟钝反映了表浅感觉的降低，与RFA术后临床观察结果一致。至术后第21天，MWT值开始下降，并在第28天和第35天恢复至基线水平，表明神经损伤是可逆的，而非发生永久性轴突变性。相反，若在术后第7至14天未观察到MWT升高，或术中未见粘连形成，则提示热能传递不足或针头位置不当。

组织学验证进一步支持了神经损伤的成功建立。术后第7天，多克隆抗体免疫荧光染色显示，与假手术组相比，射频消融组中阳性神经元的比例显著更高（

讨论

随着微创手术的快速发展，射频技术的应用日益广泛^6,7,18。随着射频技术在临床实践中的不断拓展，相关研究推动了其更广泛的应用。然而，射频电流对组织的作用仍需进一步研究，尤其是在射频技术应用于神经病理性疼痛治疗后，许多患者在射频消融术（RFA）后出现感觉异常等并发症，影响了生活质量。

本研究采用单极射频消融（RFA）系统对小鼠坐骨神经损伤进行治疗。单极RFA系统手术的关键在于降低阻抗以满足设备工作要求，因此术前准备尤为重要，包括负极金属板接触面的皮肤处理以及导电介质的选择。由于小鼠毛发具有轻微疏水性，皮肤准备时应暴露约1 cm × 1 cm面积的可见皮肤，以确保导电介质充分发挥作用。此外，导电介质可从离子液体和导电膏中选择。本研究选用离子液体，因其在小鼠体内无代谢影响，且术后若未彻底清除也不会存在误吞风险。然而，此过程中需特别注意保温；若工作环境温度较低，应在负极板下方加垫加热垫并采取其他保温措施，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-0 缝合线	Jinhuan Medical	C412	缝合皮肤
6-0 缝合线	Jinhuan Medical	KCR631	缝合肌肉层
Alexa Fluor 488 二抗	Invitrogen	A-11008	二抗
ATF3 兔多克隆抗体	Novus Biologicals	NBP1-85816	多克隆抗体
弯头精细镊	Beyotime Biotechnology	FS031	剪切肌肉和筋膜
DAPI 抗荧光淬灭封片剂	Beyotime Biotechnology	P0131	抗荧光淬灭介质
玻璃显微指针	Yuyan Instruments	BLFZ10	抬起神经
GraphPad Prism	Graphpad Software, LLC	version 9.0	输出数据图像
显微剪刀	Beyotime Biotechnology	FS217	剪开皮肤切口
改良 Ringer’s 溶液	自行配制	N/A	乳酸钠 3.10 g/L；NaCl 6.00 g/L；KCl 0.30 g/L；CaCl2·2H2O 0.20 g/L
持针器	Yuyan Instruments	Y32010	夹持缝合针
QuickBlock 封闭液	Beyotime Biotechnology	P0260	免疫荧光封闭试剂
射频治疗仪	Cosman Medical	RFG-1A	射频系统
射频热凝电极套管针	Cosman Medical	TCD-10	绝缘射频针
乳酸钠林格注射液	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd	86902180001566	离子液体以降低电阻
SPSS Statistics	IBM Corp	version 27.0	统计分析软件
直头精细镊	Beyotime Biotechnology	FS027	剪切肌肉和筋膜
Von Frey 纤维丝	Danmic Global	Aesthesio Semmes-Weinstein	行为学测试