一种通过单极射频在小鼠坐骨神经上诱导热损伤的模型

摘要

本研究将射频系统应用于小鼠坐骨神经，建立了热损伤神经的射频消融模型。该方法解决了小鼠外周神经热损伤模型中可控性差的问题，为神经损伤修复及神经病理性疼痛的研究提供了切实可行的建模方法。

摘要

周围神经损伤常导致神经病理性疼痛，并触发神经修复过程。尽管目前可控的物理损伤模型已较为成熟，但现有的热损伤模型仍处于探索阶段，且可控性较差。在临床实践中，射频消融（RFA）系统常被用于对组织和神经造成热损伤。RFA是一种治疗手段，已被证实可通过诱导神经热损伤有效阻断疼痛信号传导。通过调节特定参数，可改变消融范围以及受累神经分布区域的麻木程度和运动功能障碍。本研究采用单极射频系统，在小鼠坐骨神经上施加75°C持续30秒，建立了一种稳定且可控的神经损伤模型。术后第7至14天，机械缩足阈值（MWT）显著升高，并于第28天恢复。该研究填补了当前RFA神经损伤模型的空白，复制了临床上RFA操作后所观察到的神经损伤特征，为后续关于RFA诱导神经损伤的研究提供了方法学框架。

引言

神经病理性疼痛在临床管理中仍面临持续挑战，因其疼痛机制仍在不断研究之中。为了研究神经病理性疼痛的分子与细胞机制，已成功在啮齿类动物中应用脊神经结扎（SNL）¹、慢性压迫性损伤（CCI）²、坐骨神经部分结扎（pSNL）³、坐骨神经横断（SNT）⁴以及保留神经损伤（SNI）⁵等模型来模拟外周神经的物理性损伤。为了提高模型的可控性与稳定性，先前的研究已提出改进方法，例如引入压力计和选择性损伤，并已得到实施。

尽管射频技术已取得良好的临床效果，但也伴随多种副作用。例如，手术中用于止血的射频消融术（RFA）⁶，可能因器械尖端温度过高而对周围组织造成热损伤，并存在损伤周围神经的风险⁷。此外，用于治疗三叉神经痛⁸、带状疱疹后神经痛⁹及其他神经性疼痛疾病的RFA，虽可在术后缓解主要疼痛，但常伴随支配区域长期术后麻木、表层痛觉过敏及其他不适症状^10,11....

方案

动物实验经首都医科大学宣武医院实验动物中心动物伦理委员会批准，并依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行。¹⁴成年雄性C57BL/6小鼠（8–10周龄，20–25 g）在受控环境条件下分组饲养（每笼4–5只）（22 ± 2 °C，湿度50%–60%，12小时光照/黑暗循环，光照时间为07:00），可自由获取标准啮齿类动物饲料和水。所有行为学评估均在光照期的08:00至12:00之间进行。试剂、软件和设备的详细信息列于 材料表.

1. 麻醉与小鼠准备

1. 通过腹腔注射20 mg/mL的三溴乙醇溶液对小鼠进行麻醉，剂量为每10 g体重0.2 mL。
2. 使用棉签将眼用软膏涂抹于双眼表面。
3. 将小鼠置于左侧卧位。使用电动剃须刀去除小鼠右侧体表1 cm × 1 cm区域的毛发（图1）。
   注意：此步骤可增加躯干与电路负极板之间的接触面积，有助于降低电路电阻。
4. 将小鼠躯干部分以右侧朝下的方向与金属负极板接触。在躯干与负极板接触区域滴加数滴离子液体（0.9% NaCl或改良Ringer溶液；成分见材料表），以增强导电性。
   注意：确保头部和面部不接触负极板，以防止....

结果

通过术中和术后指标确认模型建立成功。射频消融（75 °C，30 s）完成后，在拔出射频针时可观察到针尖与坐骨神经之间存在轻度黏附。这种黏附是由于接触部位局部蛋白质变性与凝固所致，提示热能传递适当且针尖与神经直接接触。若无黏附现象，则可能提示手术过程中针尖发生移位，导致神经损伤不一致或未达到理想损伤效果。

术后，RFA组小鼠在第7天和第14天的MWT显著高于术前基线水平及假手术组（P < 0.001；图5）。这种短暂的机械性感觉迟钝反映了表浅感觉的降低，与RFA术后临床观察结果一致。至术后第21天，MWT值开始下降，并在第28天和第35天恢复至基线水平，表明神经损伤是可逆的，而非发生永久性轴突变性。相反，若在术后第7至14天未观察到MWT升高，或术中未见粘连形成，则提示热能传递不足或针头位置不当。

组织学验证进一步支持了神经损伤的成功建立。术后第7天，多克隆抗体免疫荧光染色显示，与假手术组相比，射频消融组中阳性神经元的比例显著更高（

讨论

随着微创手术的快速发展，射频技术的应用日益广泛^6,7,18。随着射频技术在临床实践中的不断拓展，相关研究推动了其更广泛的应用。然而，射频电流对组织的作用仍需进一步研究，尤其是在射频技术应用于神经病理性疼痛治疗后，许多患者在射频消融术（RFA）后出现感觉异常等并发症，影响了生活质量。

本研究采用单极射频消融（RFA）系统对小鼠坐骨神经损伤进行治疗。单极RFA系统手术的关键在于降低阻抗以满足设备工作要求，因此术前准备尤为重要，包括负极金属板接触面的皮肤处理以及导电介质的选择。由于小鼠毛发具有轻微疏水性，皮肤准备时应暴露约1 cm × 1 cm面积的可见皮肤，以确保导电介质充分发挥作用。此外，导电介质可从离子液体和导电膏中选择。本研究选用离子液体，因其在小鼠体内无代谢影响，且术后若未彻底清除也不会存在误吞风险。然而，此过程中需特别注意保温；若工作环境温度较低，应在负极板下方加垫加热垫并采取其他保温措施，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4-0 缝合线	Jinhuan Medical	C412	缝合皮肤
6-0 缝合线	Jinhuan Medical	KCR631	缝合肌肉层
Alexa Fluor 488 二抗	Invitrogen	A-11008	二抗
ATF3 兔多克隆抗体	Novus Biologicals	NBP1-85816	多克隆抗体
弯头精细镊	Beyotime Biotechnology	FS031	剪切肌肉和筋膜
DAPI 抗荧光淬灭封片剂	Beyotime Biotechnology	P0131	抗荧光淬灭介质
玻璃显微指针	Yuyan Instruments	BLFZ10	抬起神经
GraphPad Prism	Graphpad Software, LLC	version 9.0	输出数据图像
显微剪刀	Beyotime Biotechnology	FS217	剪开皮肤切口
改良 Ringer’s 溶液	自行配制	N/A	乳酸钠 3.10 g/L；NaCl 6.00 g/L；KCl 0.30 g/L；CaCl2·2H2O 0.20 g/L
持针器	Yuyan Instruments	Y32010	夹持缝合针
QuickBlock 封闭液	Beyotime Biotechnology	P0260	免疫荧光封闭试剂
射频治疗仪	Cosman Medical	RFG-1A	射频系统
射频热凝电极套管针	Cosman Medical	TCD-10	绝缘射频针
乳酸钠林格注射液	Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd	86902180001566	离子液体以降低电阻
SPSS Statistics	IBM Corp	version 27.0	统计分析软件
直头精细镊	Beyotime Biotechnology	FS027	剪切肌肉和筋膜
Von Frey 纤维丝	Danmic Global	Aesthesio Semmes-Weinstein	行为学测试