乳腺球形成实验揭示Api5在非致瘤性乳腺上皮细胞系中诱导的干性特征

摘要

本方案描述了建立乳腺球形成实验的方法，用于研究凋亡抑制因子5（Api5）在非致瘤性乳腺上皮细胞中诱导的癌症干性。收集第一代乳腺球的裂解液，分析多种干性标志物，以评估干细胞样特性的获得情况。

摘要

乳腺癌仍是全球女性中最常见的癌症，其年龄标准化发病率和死亡率均居首位。尽管针对乳腺癌的治疗手段已取得进展，但仍有20%的患者会出现疾病复发，这可能归因于一群具有治疗抵抗性的癌症干细胞（CSCs）。这些癌症干细胞可通过处于静止状态而存活于常规治疗中，或因肿瘤组织切除不完全而持续存在，最终导致后期复发。因此，近期研究集中于识别、分离并靶向这一具有抗性的细胞群体。体外实验中，乳腺球形成实验是一种可靠的三维悬浮培养系统，可用于富集和扩增乳腺上皮细胞群体中的干细胞样细胞。本文介绍了一种利用乳腺球形成实验评估非致瘤性乳腺上皮细胞在过表达凋亡抑制因子5（Api5）后获得癌症干细胞样表型的方法。该方案包括通过连续传代培养乳腺球，以评估其形成效率和自我更新能力。此外，从乳腺球中提取的蛋白裂解液可通过免疫印迹法检测已知的干性标志物。该实验可用于研究乳腺上皮细胞群体中癌症干细胞样特性的新型调控因子（如Api5）。所述方法可适用于分子干预的比较研究，或用于体外筛选靶向癌症干细胞的治疗药物。

引言

化疗耐药性乳腺癌的增加，使得人们越来越重视识别和靶向治疗耐药及复发的根本原因——即一类被称为癌症干细胞的细胞群体。这些细胞的特点是能够逃避分化并保持静息状态，从而抵抗多种癌症治疗方式^1,2。目前可采用多种方法来鉴定乳腺癌干细胞，包括乳腺球形成实验^3,4,5、基于细胞表面标志物的细胞分选^6,7、基于外排特性的分离、体内致瘤性实验⁷，以及对干细胞核调节因子（如Oct4⁸、Nanog⁹、Sox2¹⁰ 和Bmi¹¹）的检测。通常，识别和分离癌症干细胞需要结合上述一种或多种方法。

凋亡抑制因子5（Api5）是一种抗凋亡蛋白，在多种癌症中被发现表达上调，包括乳腺癌¹²

方案

1. 使用聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）pHEMA 包被组织培养板

1. 在65 °C下，将1.2 g pHEMA（分子量约300,000）溶于100 mL 95%乙醇中，持续搅拌，配制1.2%的pHEMA溶液（见材料表）。
2. 使用6孔板，每孔加入1 mL pHEMA溶液，对标准组织培养板进行包被。可根据组织培养容器的大小调整pHEMA溶液的用量。
3. 将培养板置于40 °C烘箱中，在无菌条件下干燥。
4. 使用前，将培养板暴露于紫外光下15分钟，随后用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤三次，再用于建立乳腺球形成实验。

2. 接种原代乳腺球

1. 在生长培养基中重悬第16天3D培养物获得的3D解离MCF10A细胞（对照组和Api5过表达组）进行培养¹⁴。
   注意：生长培养基的组成：高糖DMEM（不含丙酮酸钠），添加5%马血清、10 µg/mL胰岛素、0.5 µg/mL氢化可的松、20 ng/mL重组人表皮生长因子（EGF）、100 ng/mL霍乱毒素和200单位/mL青霉素-链霉素（参见材料表）。
2. 吸除废弃培养基，用1 mL DPBS洗涤细胞，然后加入500 µL....

结果

为了评估非黏附条件下乳腺球形成效率，根据实验方案将对照组和过表达Api5的三维解离MCF10A细胞接种于聚HEMA包被的培养板中。与对照组相比，Api5过表达细胞的平均乳腺球形成效率提高了1.58倍（图1B，C）。该结果表明，Api5的高表达可增加在非黏附、无血清条件下存活并增殖的类干细胞前体细胞的比例，从而形成克隆来源的球形结构。

收集原代乳腺球，经解离后重新接种以形成第二代乳腺球。Api5过表达细胞的平均自我更新能力约为对照细胞的2.5倍（图1D，E）。该结果表明，Api5的过表达可增加具有干细胞样特性的自我更新细胞群体，从而支持这些细胞在连续传代过程中的维持。

通过免疫印迹法检测从第一代乳腺球中提取的蛋白裂解液，评估干细胞核调节因子的表达。Api5 过表达导致 Oct3/4、Nanog、Sox2 和 Bmi1 水平升高（

讨论

尽管已建立的癌细胞系或肿瘤来源细胞的单层培养可为研究调控癌症表型的多种分子通路提供见解，但针对癌症干细胞的研究无法在二维培养体系中开展。由于癌症干细胞被认为是在现有治疗策略后导致复发的主要因素之一，因此有必要建立可靠的检测方法以深入研究这类细胞^1,20,21尽管研究肿瘤干细胞活性最可靠的检测方法是在小鼠体内进行的移植实验，但仍需要更高效且成本较低的方法 体外 检测方法。乳腺球培养为研究癌症干细胞群体提供了一种简洁且经济有效的替代方案。

通过初代乳腺球的形成效率来评估早期干细胞活性。为了评估干细胞的自我更新能力，必须进行乳腺球的连续传代。后续传代接种的细胞数量应与初代培养时的细胞数量相同。如果观察到的次级乳腺球数量过少或没有形成，应确保用于连续传代的初代乳腺球收获数量足够（约100个乳腺球），以弥补传代过程中不可避免的细胞损失。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.05% 胰蛋白酶 EDTA	Invitrogen	25300062
37 °C 恒温培养箱（带湿度控制）	New Brunswick	Galaxy 170 R
抗 Bmi1 兔多克隆抗体	ABclonal	A13472	1:1000 稀释，4 °C 过夜孵育
抗 GAPDH 抗体	Sigma	G9545-200UL	1:10000 稀释，室温孵育 1 小时
抗 Nanog 兔单克隆抗体	ABclonal	A22625	1:5000 稀释，4 °C 过夜孵育
抗 Oct3/4 抗体 (C-10)	Santa Cruz	sc-5279	1:300 稀释，4 °C 过夜孵育
抗 Sox2 抗体 (E-4)	Santa Cruz	sc-365823	1:300 稀释，4 °C 过夜孵育
B-27 添加剂（50 倍浓缩液），不含维生素 A	Invitrogen	12587010
离心机	Beckman Coulter	Allegra X-15R
霍乱毒素	Sigma	C8052-1MG	溶于 dH₂O 配制成 1 mg/mL 储存液
DMEM/F12 培养基	Thermo	11330032
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）	Invitrogen	14190-144
表皮生长因子（EGF）	Sigma	E9644-0.2MG	溶于 dH₂O 配制成 100 mg/mL 储存液
无水乙醇（99.9%）	Jebsen & Jessen GmbH & Co. Germany	58051 L05
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）	SRL	43272
高糖 DMEM 培养基（不含丙酮酸钠）	Invitrogen	11965126
马血清	Invitrogen	16050122
盐酸（HCl）	Qualigens	Q29145	用于调节 Tris-HCl 的 pH 值（pH 8.0）
氢化可的松	Sigma	H0888	溶于乙醇配制成 1 mg/mL 储存液
ImageJ			图像处理软件
ImageQuant LAS 4000	Cytiva
Immobilon Western 化学发光 HRP 底物	Merck	WBKLS0500
胰岛素	Sigma	I1882	溶于 1% 冰醋酸配制成 10 mg/mL 储存液
Nikon Eclipse TS-100 显微镜	Nikon	BM-1919
MCF10A 细胞			由美国斯克里普斯研究所 Raymond C. Stevens 教授惠赠
青霉素-链霉素	Lonza	17-602E
苯甲基磺酰氟（PMSF）	Sigma	78830-5G
绘图软件	GraphPad Prism 10
聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）（pHEMA）	Santacruz	sc-253284	溶于 95% 乙醇配制成 1.2% 溶液
氯化钠（NaCl）	SRL	41721
脱氧胆酸钠	Amresco	0613-100G
十二烷基硫酸钠（SDS）	SRL	54468
氟化钠（NaF）	HiMedia	RM1081-500G
正钒酸钠	Sigma-Aldrich	S6508-10G
Tris 缓冲液	SRL	71033
吐温 X-100	Sigma	T8787-250ML