本方案描述了建立乳腺球形成实验的方法，用于研究凋亡抑制因子5（Api5）在非致瘤性乳腺上皮细胞中诱导的癌症干性。收集第一代乳腺球的裂解液，分析多种干性标志物，以评估干细胞样特性的获得情况。
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摘要
摘要
乳腺癌仍是全球女性中最常见的癌症，其年龄标准化发病率和死亡率均居首位。尽管针对乳腺癌的治疗手段已取得进展，但仍有20%的患者会出现疾病复发，这可能归因于一群具有治疗抵抗性的癌症干细胞（CSCs）。这些癌症干细胞可通过处于静止状态而存活于常规治疗中，或因肿瘤组织切除不完全而持续存在，最终导致后期复发。因此，近期研究集中于识别、分离并靶向这一具有抗性的细胞群体。体外实验中，乳腺球形成实验是一种可靠的三维悬浮培养系统，可用于富集和扩增乳腺上皮细胞群体中的干细胞样细胞。本文介绍了一种利用乳腺球形成实验评估非致瘤性乳腺上皮细胞在过表达凋亡抑制因子5（Api5）后获得癌症干细胞样表型的方法。该方案包括通过连续传代培养乳腺球，以评估其形成效率和自我更新能力。此外，从乳腺球中提取的蛋白裂解液可通过免疫印迹法检测已知的干性标志物。该实验可用于研究乳腺上皮细胞群体中癌症干细胞样特性的新型调控因子（如Api5）。所述方法可适用于分子干预的比较研究，或用于体外筛选靶向癌症干细胞的治疗药物。
引言
化疗耐药性乳腺癌的增加，使得人们越来越重视识别和靶向治疗耐药及复发的根本原因——即一类被称为癌症干细胞的细胞群体。这些细胞的特点是能够逃避分化并保持静息状态，从而抵抗多种癌症治疗方式1,2。目前可采用多种方法来鉴定乳腺癌干细胞，包括乳腺球形成实验3,4,5、基于细胞表面标志物的细胞分选6,7、基于外排特性的分离、体内致瘤性实验7，以及对干细胞核调节因子（如Oct48、Nanog9、Sox210 和Bmi11）的检测。通常，识别和分离癌症干细胞需要结合上述一种或多种方法。
凋亡抑制因子5（Api5）是一种抗凋亡蛋白，在多种癌症中被发现表达上调，包括乳腺癌12,13,14、宫颈癌15,16,17、B细胞慢性淋巴细胞性白血病18以及非小细胞肺癌19。高水平的Api5已被发现与宫颈癌16 和三阴性乳腺癌12的化疗耐药性相关。越来越多的证据表明，治疗耐药性和复发通常由癌症干细胞驱动20,21。Song等人的一项有趣研究22 揭示，在宫颈癌细胞中Api5的过表达会导致Nanog水平升高，从而促进癌症干性增强。我们实验室先前的研究表明，Api5的过表达可导致在Matrigel支持的三维培养中生长的非致瘤性乳腺上皮细胞发生转化。这些转化后的细胞表现出极性破坏、增殖增加、锚定非依赖性生长以及部分上皮-间质转化（EMT）样表型。在三维培养中因Api5过表达所观察到的表型变化，在将球状体解离为单层培养后仍得以维持14。鉴于Api5在化疗耐药的三阴性乳腺癌中表达上调，我们推测Api5可能也在乳腺上皮细胞中调控癌症干性特征。
在此背景下，我们描述了一种乳腺球形成实验方法，用于从因Api5过表达而发生转化的三维解离非致瘤性乳腺上皮细胞中鉴定癌症干细胞，随后通过蛋白质印迹法检测干细胞标志物，以确认这些细胞的身份。乳腺球实验通过在非黏附、非分化条件下培养乳腺上皮细胞，从而富集具有干细胞样/前体细胞特性的细胞，形成称为乳腺球的三维结构。不具备干细胞样特性的乳腺上皮细胞通常会发生失巢凋亡；然而，具有干细胞样特性的细胞则能够形成乳腺球4,5。该方法最初由Dontu等3 建立，其灵感来源于神经球实验，后者用于研究和鉴定神经干细胞及前体细胞23。本文所述的乳腺球实验可在仅添加B27（不含维生素A）和重组人表皮生长因子（EGF）的最低培养基中评估干细胞活性及自我更新能力。将过表达Api5的三维解离细胞以低密度接种于聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）（pHEMA）包被的培养板上，使细胞在非黏附条件下生长，从而确保每个后续形成的乳腺球均为克隆来源。乳腺球培养至第7天后，计算乳腺球形成效率。为了区分真正的干细胞与随时间推移失去增殖能力的非干细胞，需进行后续多代乳腺球形成实验。连续传代乳腺球的过程包括将从第一代收集的乳腺球解离为单细胞，再重新接种以形成第二代（及后续）乳腺球。该过程用于判断细胞是否能够反复启动球体形成，并以细胞的自我更新能力进行量化5。
该方法可用于在致瘤性或转化的乳腺上皮细胞中鉴定乳腺癌干细胞。该方法也可经调整后用于从患者样本中分离乳腺癌干细胞。该体系有助于发现与化疗耐药性相关的乳腺癌干细胞新靶点。
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方案
1. 使用聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）pHEMA 包被组织培养板
- 在65 °C下，将1.2 g pHEMA（分子量约300,000）溶于100 mL 95%乙醇中，持续搅拌，配制1.2%的pHEMA溶液（见材料表）。
- 使用6孔板，每孔加入1 mL pHEMA溶液，对标准组织培养板进行包被。可根据组织培养容器的大小调整pHEMA溶液的用量。
- 将培养板置于40 °C烘箱中，在无菌条件下干燥。
- 使用前，将培养板暴露于紫外光下15分钟，随后用Dulbecco磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤三次，再用于建立乳腺球形成实验。
2. 接种原代乳腺球
- 在生长培养基中重悬第16天3D培养物获得的3D解离MCF10A细胞（对照组和Api5过表达组）进行培养14。
注意：生长培养基的组成：高糖DMEM（不含丙酮酸钠），添加5%马血清、10 µg/mL胰岛素、0.5 µg/mL氢化可的松、20 ng/mL重组人表皮生长因子（EGF）、100 ng/mL霍乱毒素和200单位/mL青霉素-链霉素（参见材料表）。 - 吸除废弃培养基，用1 mL DPBS洗涤细胞，然后加入500 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育12–15分钟，直至所有细胞完全消化。
- 待所有细胞脱落后，加入2 mL重悬培养基以中和胰蛋白酶活性，并在室温下以112 × g离心10分钟收集细胞悬液。
注意：重悬培养基的组成：高糖DMEM（不含丙酮酸钠），添加20%马血清和200单位/mL青霉素-链霉素。 - 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL乳腺球培养基中。将细胞悬液通过25 G针头吹打，获得单细胞悬液。
注意：乳腺球培养基的组成：DMEM/F12培养基，添加20 ng/mL表皮生长因子（EGF）、1 ×不含维生素A的B27补充剂和200单位/mL青霉素-链霉素（参见材料表）。 - 使用血细胞计数板计数细胞数量，并计算每孔接种0.2 × 104个细胞所需的细胞悬液体积。
注意：保持较低的接种密度，以准确测定乳腺球形成效率，从而最小化细胞聚集的影响。若用于免疫印迹分析的蛋白裂解液收集，可将细胞密度提高至每孔2.5 × 105个细胞。 - 将所需体积的细胞悬液加入2 mL乳腺球培养基中混匀，接种至6孔板的每一孔中。每种条件设三个重复孔。
- 于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养7天。
- 培养7天后，使用配备目镜测微尺的显微镜或在光学显微镜下利用象限网格，手动计数每孔中直径大于50 µm的乳腺球数量。
- 使用连接数字相机的光学显微镜在20倍放大倍数下拍摄乳腺球图像。
- 使用以下公式计算乳腺球形成效率（MFE）5
3. 接种继代乳腺球
- 将第一代形成的乳腺球收集至15 mL离心管中，在室温下以300 × g离心10分钟。
- 吸除上清液，保留乳腺球沉淀。
- 用DPBS洗涤沉淀。
- 向乳腺球沉淀中加入200 µL 0.05%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中孵育2–3分钟。将胰蛋白酶溶液中的乳腺球通过25 G针头吹打三次，以获得单细胞悬液。
- 加入0.5 mL重悬培养基以中和胰蛋白酶活性，并将细胞悬液在室温下以112 × g离心10分钟。
- 吸除上清液，将细胞沉淀重悬于0.5 mL乳腺球培养基中。
- 使用血细胞计数板对细胞数量进行计数，并计算每孔接种0.2 × 104个细胞所需的细胞悬液体积。
注：保持较低的细胞密度以评估自我更新能力，从而最小化细胞聚集的影响。 - 将所需体积的细胞悬液用2 mL乳腺球培养基稀释后，接种至6孔板的每一孔中。每种条件设三个重复孔。
- 在37 °C、含5% CO2的湿润培养箱中培养7天。
- 培养7天后，使用配备目镜测微尺或象限网格的显微镜，计数每孔中直径大于50 µm的乳腺球数量。
- 使用连接在光学显微镜上的数码相机，在20倍放大倍数下拍摄乳腺球图像。
- 使用以下公式计算自我更新能力5
4. 蛋白质印迹法检测Api5过表达对多能性标志物的影响
- 收集第一代形成的乳腺球至15 mL离心管中，在室温下以300 × g 离心10分钟。
- 吸除上清液，保留乳腺球沉淀。
- 用DPBS洗涤沉淀。
- 将沉淀收集于预冷的RIPA缓冲液中以提取蛋白裂解物，并按照标准方案进行免疫印迹分析24。
注意：RIPA缓冲液的组成：50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、1% Triton X-100、0.5% 脱氧胆酸钠、0.1% 十二烷基硫酸钠（SDS）、1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）、10 mM 氟化钠、1 mM 正钒酸钠。 - 检测干性标志物Oct3/4、Nanog、Sox2和Bmi1，以及上样对照GAPDH（抗体稀释比例见材料表）。
- 使用ImageJ软件对蛋白条带进行密度分析。在Western blot图像上选定感兴趣区域，为每一泳道生成密度分布图谱。
- 将各泳道目标蛋白的相对密度值归一化至GAPDH的密度值，并计算每种蛋白的倍数变化。
- 使用任意绘图软件绘制蛋白水平的倍数变化图。
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结果
为了评估非黏附条件下乳腺球形成效率，根据实验方案将对照组和过表达Api5的三维解离MCF10A细胞接种于聚HEMA包被的培养板中。与对照组相比，Api5过表达细胞的平均乳腺球形成效率提高了1.58倍（图1B，C）。该结果表明，Api5的高表达可增加在非黏附、无血清条件下存活并增殖的类干细胞前体细胞的比例，从而形成克隆来源的球形结构。
收集原代乳腺球，经解离后重新接种以形成第二代乳腺球。Api5过表达细胞的平均自我更新能力约为对照细胞的2.5倍（图1D，E）。该结果表明，Api5的过表达可增加具有干细胞样特性的自我更新细胞群体，从而支持这些细胞在连续传代过程中的维持。
通过免疫印迹法检测从第一代乳腺球中提取的蛋白裂解液，评估干细胞核调节因子的表达。Api5 过表达导致 Oct3/4、Nanog、Sox2 和 Bmi1 水平升高（
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讨论
尽管已建立的癌细胞系或肿瘤来源细胞的单层培养可为研究调控癌症表型的多种分子通路提供见解，但针对癌症干细胞的研究无法在二维培养体系中开展。由于癌症干细胞被认为是在现有治疗策略后导致复发的主要因素之一，因此有必要建立可靠的检测方法以深入研究这类细胞1,20,21尽管研究肿瘤干细胞活性最可靠的检测方法是在小鼠体内进行的移植实验，但仍需要更高效且成本较低的方法 体外 检测方法。乳腺球培养为研究癌症干细胞群体提供了一种简洁且经济有效的替代方案。
通过初代乳腺球的形成效率来评估早期干细胞活性。为了评估干细胞的自我更新能力，必须进行乳腺球的连续传代。后续传代接种的细胞数量应与初代培养时的细胞数量相同。如果观察到的次级乳腺球数量过少或没有形成，应确保用于连续传代的初代乳腺球收获数量足够（约100个乳腺球），以弥补传代过程中不可避免的细胞损失。
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披露
作者声明不存在潜在的利益冲突。
致谢
本研究得到了CSIR-ASPIRE（37WS(0078)/2023-24/EMR-II/ASPIRE）和SERB-POWER（SPG/2021/002661-G）的资助，以及印度浦那IISER核心资金的部分支持。S.B. 受UGC-SRF博士后奖学金资助。我们感谢美国斯克里普斯研究所的Raymond C. Stevens教授慷慨提供MCF10A细胞，以及Ahammune Biosciences Pvt. Ltd公司的Abhijith K博士对本文手稿提出的宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶 EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| 37 °C 恒温培养箱（带湿度控制） | New Brunswick | Galaxy 170 R | |
| 抗 Bmi1 兔多克隆抗体 | ABclonal | A13472 | 1:1000 稀释，4 °C 过夜孵育 |
| 抗 GAPDH 抗体 | Sigma | G9545-200UL | 1:10000 稀释，室温孵育 1 小时 |
| 抗 Nanog 兔单克隆抗体 | ABclonal | A22625 | 1:5000 稀释，4 °C 过夜孵育 |
| 抗 Oct3/4 抗体 (C-10) | Santa Cruz | sc-5279 | 1:300 稀释，4 °C 过夜孵育 |
| 抗 Sox2 抗体 (E-4) | Santa Cruz | sc-365823 | 1:300 稀释，4 °C 过夜孵育 |
| B-27 添加剂（50 倍浓缩液），不含维生素 A | Invitrogen | 12587010 | |
| 离心机 | Beckman Coulter | Allegra X-15R | |
| 霍乱毒素 | Sigma | C8052-1MG | 溶于 dH₂O 配制成 1 mg/mL 储存液 |
| DMEM/F12 培养基 | Thermo | 11330032 | |
| 杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS） | Invitrogen | 14190-144 | |
| 表皮生长因子（EGF） | Sigma | E9644-0.2MG | 溶于 dH₂O 配制成 100 mg/mL 储存液 |
| 无水乙醇（99.9%） | Jebsen & Jessen GmbH & Co. Germany | 58051 L05 | |
| 乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA） | SRL | 43272 | |
| 高糖 DMEM 培养基（不含丙酮酸钠） | Invitrogen | 11965126 | |
| 马血清 | Invitrogen | 16050122 | |
| 盐酸（HCl） | Qualigens | Q29145 | 用于调节 Tris-HCl 的 pH 值（pH 8.0） |
| 氢化可的松 | Sigma | H0888 | 溶于乙醇配制成 1 mg/mL 储存液 |
| ImageJ | 图像处理软件 | ||
| ImageQuant LAS 4000 | Cytiva | ||
| Immobilon Western 化学发光 HRP 底物 | Merck | WBKLS0500 | |
| 胰岛素 | Sigma | I1882 | 溶于 1% 冰醋酸配制成 10 mg/mL 储存液 |
| Nikon Eclipse TS-100 显微镜 | Nikon | BM-1919 | |
| MCF10A 细胞 | 由美国斯克里普斯研究所 Raymond C. Stevens 教授惠赠 | ||
| 青霉素-链霉素 | Lonza | 17-602E | |
| 苯甲基磺酰氟（PMSF） | Sigma | 78830-5G | |
| 绘图软件 | GraphPad Prism 10 | ||
| 聚（2-羟乙基甲基丙烯酸酯）（pHEMA） | Santacruz | sc-253284 | 溶于 95% 乙醇配制成 1.2% 溶液 |
| 氯化钠（NaCl） | SRL | 41721 | |
| 脱氧胆酸钠 | Amresco | 0613-100G | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | SRL | 54468 | |
| 氟化钠（NaF） | HiMedia | RM1081-500G | |
| 正钒酸钠 | Sigma-Aldrich | S6508-10G | |
| Tris 缓冲液 | SRL | 71033 | |
| 吐温 X-100 | Sigma | T8787-250ML |
参考文献
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