利用细胞分离系统和液滴数字PCR分析循环稀有细胞中表皮生长因子受体DNA突变的分析

摘要

这里我们介绍一个方案，说明从含有全血和高峰肺癌细胞的人工样本中分离罕见癌细胞的方法。该协议采用半自动化、无标记细胞分离平台。随后利用液滴数字PCR分析富集细胞是否存在表皮生长因子受体突变。

摘要

表皮生长因子基因（EGFR）中的突变对于确定肺癌患者最有效的治疗方法至关重要。EGFR突变的常规检测可以采取肿瘤活检或肺癌患者血浆中的ctDNA分析。虽然常规检测肺癌患者的血液样本以了解肺癌的存在或复发情况，但通常不涉及对捕获细胞的后续分子分析。检测罕见循环肿瘤细胞（CTCs）中存在的EGFR基因中的单个突变，可以为靶向治疗的潜在疗效提供更多见解，更进一步地，尤其是在非小细胞肺癌（NSCLC）患者预后方面。不幸的是，此类循环肿瘤细胞的稀有性以及缺乏简化的基因组信息检测程序，带来了重大的检测挑战。

该方案的目标是展示从全血中捕获CTCs并利用ddPCR评估其分子成分的现实潜力。采用半自动化、基于大小的细胞分离平台捕捉循环肿瘤细胞，随后回收以进行下游分子分析。为确定捕获细胞基因组DNA中特定EGFR突变的存在，ddPCR采用EGFR pT790M和EGFR pL858R检测。

通过全血积极富集了两条不同的肺癌细胞系（A549和H1975），并利用ddPCR准确定量了H1975细胞系内存在的突变。

引言

随着液体活检价值的转化研究持续推进，以及近期专门阐明ctDNA监测在治疗选择^中的临床价值的出版物，液体活检正在逐渐成熟。与传统组织活检方法相比，液体活检为癌症监测和预后提供了一种更低创的替代方法。广泛的研究集中在血液中发现的片段DNA（游细胞DNA，cfDNA），特别是肿瘤衍生的亚区室，即循环肿瘤DNA（ctDNA）。过去二十年中，ctDNA已被广泛研究，显示其含有肿瘤特异性基因突变，如SNV和结构变异，以及甲基化标志和与非肿瘤cfDNA相比明显的片段模式。这些特定的ctDNA特征现已被用于监测癌症患者的分子状态，涵盖早期发现、治疗反应、最小残留病（MRD）及耐药性状态。同样，循环肿瘤细胞（CTCs）从原发肿瘤部位分离到血管，近年来被演化为有前景的生物标志物，其在血液中的存在和数量与疾病进展和复发潜力密切相关。虽然早期对CTCs的研究主要依赖其蛋白质标记的表达和枚举^2，但在分子层面研究CTC方面取得了显著进展，包括乳腺癌中雌激素受体1（ESR1）的基因组突变检测，以及多种癌症的表皮生长因子基因（EGFR）检测。

EGFR突变对于确定发病机制和预后至关重要，同时也对决定^肺癌患者最有效的治疗方案至关重要3。EGFR突变的常规检测可以表现为诊断或进展时的实体肿瘤活检，或最近的复发/难治性^肺癌患者血浆中的ctDNA采样。然而，与基于ctDNA的方法不同，CTC来源的基因组材料分析使得对完整肿瘤细胞及其突变谱进行了直接评估。除了ctDNA磁共振障碍研究外，罕见CTCs的EGFR基因突变检测还能进一步理解治疗方案的潜在疗效，进一步提升患者预后，尤其是在非小细胞肺癌（NSCLC）中。CTC的稀有性以及诊所缺乏使用用户友好工具的简化方案，构成了更广泛应用的严重障碍。这一局限凸显了需要一个标准化且易于获取的工作流程，既能高效地进行CTC分离，也能实现下游分子分析。因此，本研究的目标是通过结合细胞分离和数字PCR方法，提出一个可重复的循环肿瘤细胞富集及随后检测EGFR突变的工作流程。

Genesis细胞分离系统配备微流控细胞捕获载玻片，能够以半自动化工艺捕获CTCs，具有高活率和高捕捉效率，基于其体积较大且变形性低于原发白细胞和红细胞群体的特点^5,6。捕获的CTC随后可以通过逆流从载玻片回收，进行进一步的基因组分析。为确定捕获细胞基因组DNA中特定EGFR突变的存在，ddPCR通过EGFR T790M和L858R的检测对CTC衍生基因组DNA进行了检测。

该方案使用模型CTC样本和商业化ddPCR检测方法，旨在为CTC中癌症相关突变的靶向检测提供切入点。该方案为检测循环肿瘤细胞中的癌症相关突变提供了实用方法，并可能支持液检应用的进一步研究。

方案

伦理声明：

血液样本从授权来源获取用于研究，采样前均获得所有捐献者的书面知情同意。所有涉及人体血液样本的实验方案均由血液供应商Discovery Life Sciences（美国阿拉巴马州）的机构审查委员会审核并批准。所有涉及人体血液样本的程序均按照机构研究委员会的伦理标准及《赫尔辛基宣言》进行。

1. 利用半自动细胞分离系统进行癌细胞富集

注： 本节介绍使用半自动细胞分离平台进行循环肿瘤细胞（CTCs）富集，随后通过液滴数字PCR检测EGFR突变。使用模型CTC样本来证明可行性，建议在临床应用前进行检测验证。使用了两种非小细胞肺癌（NSCLC）细胞系：NCI-H1975（EGFR L858R/T790M突变）和A549（EGFR野生型），作为突变检测的阴性对照。

1. 血液样本
   1. 确保在采血前获得献血者/患者的知情同意。如有需要，获得机构审查委员会（IRB）批准涉及人体标本的研究，包括血液。
   2. 可行性测试时，请从授权的第三方供应商处获取血液样本，仅供研究使用。
   3. 在乙二胺四醋酸（EDTA）管中采集外周血，并在48小时内通过Genesis富集方案处理样本。
      注意。在下游分析和Genesis富集方案中，建议使用EDTA管。Streck和EDTA管可用于使用Genesis枚举协议（直接/间接）进行切片上的免疫染色。
   4. 将采集的血液样本存放在EDTA管中，温度为2–8°C，等待使用。Genesis细胞分离无需预处理，富集方案可使用最高10毫升的全血。
2. 模型CTC样本/临床样本制备
   1. 在10微升的适当细胞培养基或磷酸缓冲生理盐水（PBS）缓冲液中，制备100–1000个细胞浓度的细胞库存溶液。如果正在使用临床样本，可以跳过这一步。
      注意：本研究中使用的峰值浓度高于临床观察到的CTC水平，仅用于方法演示目的。
   2. 将10微升细胞液加入健康供体最多10毫升的全血中，制备模型CTC样本。对于临床样本，患者全血样本中不应含有任何癌细胞。
   3. 将血样与等量的PBS（1x）混合，在室温下轻轻搅拌，直到使用。如果储存超过一小时，则保存温度为4°C。
3. CTC富缩
   1. 启动Genesis细胞隔离系统，等待系统初始化。这可能需要长达5分钟。
   2. 将废物罐放置在站点舱底部，并将废物罐管连接到废物罐上。
   3. 将管子按入夹阀，直到感觉卡住，然后将Genesis System管子连接到废物罐出口。
   4. 通过在主屏幕按下“开始”按钮，并点击屏幕上的“自我测试”来运行自我测试。
   5. 自我测试完成后，从选择方案选项中选择 “2.0试剂盒浓缩” 。
   6. 按照屏幕上的说明操作，填写所需的数据输入字段，完成预热和组装流程。使用70%乙醇和1倍PBS成功引发，能获得最佳的细胞捕捉性能和DNA提取恢复率。底漆大约需要20分钟完成。
   7. 确保选择正确的浓缩方案（2.0 套件浓缩），并在开始运行前正确固定所有油管连接和滑套位置。在样品装载过程中避免引入气泡，因为这可能影响流动的一致性和捕获效率。
   8. 轻柔地将步骤1.2.3（模型CTC样本/临床样本制备）制备的样品注入入口漏斗，并按系统界面的“继续”继续浓缩方案。
   9. CTC捕获完成后，半自动隔层隔离系统会提示用户取出废罐并重新连接启动槽。
   10. 将Genesis系统管子从废水罐中取出，并将4毫升稀释缓冲液移入启动槽。
   11. 将回流适配器连接到启动油箱，重新连接Genesis系统的管路。在屏幕上按“继续”以继续浓缩方案。通过回流释放微流控滑台中捕获的细胞至入口漏斗。
   12. 通过从入口漏斗移液到5.0毫升的Eppendorf管收集回收的细胞。确保你收集所有水性样本都集中在入口漏斗中，漏斗通常超过4毫升。
   13. 将回收的样本以600 克 离心5分钟，沉淀捕获的细胞后再进行细胞裂解。
   14. 小心去除上清液，然后进行DNA提取方案（第1.4节）。
4. DNA提取
   注意：如果DNAzol BD接触皮肤或摄入，是有害的。避免接触皮肤和眼睛。只在化学排气罩环境下使用，且不要吸入任何雾气、蒸汽或喷雾。如果接触到皮肤，请立即用水洗面。
   1. 根据步骤1.3.14，将1毫升DNAzol BD直接加入试管。
   2. 将整个样本体积转移到新的Eppendorf DNA LoBind 1.5 mL微离心管中，并用力摇晃。
   3. 将试管在室温下孵育5分钟。用力涡旋管，并在室温下孵育至少4分钟。
   4. 确保在裂解和沉淀步骤中完全混合，以最大化DNA回收。如果担心RNA污染，可选地进行RNase处理。
   5. 直接向DNAzol BD细胞裂解液样品混合物中加入400微升异丙醇。
   6. 用10,000 克 离心机分离6分钟，以沉淀DNA。
   7. 离心后，去除上清液，轻轻向沉淀DNA中加入0.5毫升DNAzol BD。
   8. 对管子进行涡旋，直到DNA沉淀完全分散。
   9. 将混合物以10,000 克 离心5分钟。
   10. 去除上清液，并用1毫升75%乙醇移液管洗涤DNA沉淀。
   11. 重复第9至10步，共洗两次。
   12. 用微量移液器去除管底残留的乙醇。
       注意：确保颗粒不会完全干燥。
   13. 加入20微升DNase/RNase无离子水（DI）水，将CTC样品中的DNA溶解。
   14. 使用dsDNA定量测定套件/平台，如Qubit 1x dsDNA高灵敏度测定套件或生物分析仪高灵敏度DNA分析，定量样品中的双链DNA（dsDNA）。
   15. 提取的DNA样本保存在4°C或-20°C，以防止降解。
       暂停点：提取的DNA样本可存放于-20°C进行短期存储，或-80°C储存以进行后续分析。

2. 利用ddPCR进行EGFR突变分析

数字PCR是一种适合检测罕见突变且高灵敏度和精度的方法。ddPCR突变检测测定法通常包含一个FAM标记的探针靶向突变等位基因和第二个带HEX标记的探针靶向野生型等位基因。

1. 反应装置与液滴生成
   1. 解冻ddPCR超级混合液，ddPCR突变检测法在冰上进行。
   2. 通过涡旋每个管子确保内容物均匀，因为在-20°C储存期间可能形成浓度梯度。
   3. 短暂离心，将管底的沉积物移至底部，然后将管子置于冰上。
   4. 在准备反应混合物前，按照 表1的配方，先将提取的DNA样本调制到所需浓度。
   5. 制作含有超级混合液、检测法和限制酶，以及所有检测样本的水预混合液，并单独添加DNA作为最后的反应组分。确保DNA样本的最终浓度为50 fg–100 ng。
      注意：建议在液滴生成前通过限制性消化进行DNA断片，以提高准确性、降低粘度并增强模板的可及性。建议在ddPCR设置过程中使用2–5微量限制性内切酶进行直接消化。对于EGFR点突变检测（T790M/L858R），推荐使用MseI;在定制前，请参考兼容酶的检测数据手册。Bio-Rad数字检测门户（Bio-Rad滴滴数字PCR检测 |首页）
   6. 为至少一口井准备负对照，仅含有野生型模板，浓度与未知样品浓度相近。
   7. 涡旋反应管充分混合，并短暂离心将所有样品沉积到每个反应管底部。让反应管在室温下平衡2分钟。
   8. 将每种反应混合物20微升装入微流控油筒（DG8筒）样品井，随后注入75微升液滴生成油，用于探针进入油井。
   9. 用密封圈覆盖弹头，放入QX200液滴发生器中。
   10. 按下液滴发生器顶部的按钮关闭盖子。盖子合上后，液滴生成会自动开始。该工艺将样品和油脂结合在微流控筒的微通道中，为每个样品生成约20,000纳米级液滴的乳剂。
2. PCR扩增（热循环条件）
   1. 按照表2建议，编程热循环机的热循环条件
   2. 当液滴生成完成后，仪器上的所有指示灯都是恒亮的绿色。再次按下液滴发生器上的按钮打开仪器，取出弹匣架和弹匣。
   3. 取下一次性垫圈，从滤芯中抽取45微升液滴，注意确保移液器尖端有轻微角度，以防止液滴被撕碎。
   4. 将液滴注入ddPCR 96孔板，并使用PX1 PCR板封闭器进行PCR板热封密封。
   5. 密封含液滴的96孔板后，小心将96孔板转移到步骤2.2.1中准备的热循环器，开始热循环。
3. 液滴读出与数据分析
   1. 启动ddPCR滴滴读取仪（QX200滴滴读器或QX600滴滴读器）和连接的计算机，该计算机上安装并配置了QX管理软件。
   2. 热循环步骤完成后，将密封的96孔板移至液滴读取仪。
   3. 打开QX管理器软件，基于实验设计配置新的板板布局。点击“添加车牌” 标签，软件将启用“配置车牌”按钮。点击“配置板” 将样本细节分配到板上。
   4. 填写板材和井的信息详情，选择孔，指定样品条件、实验类型、靶标名称、靶标类型及参考：第1章代表FAM，第2章表示HEX颜色。
   5. 点击“应用” 加载井，完成后选择“确定”。
   6. 当所有样品的板块布局完成后，选择“运行”开始液滴读取过程。
   7. 数据采集后，在“分析”下选择孔中样本，并设置适当的ddPCR突变检测检测阈值，以区分突变型和野生型信号。
   8. 对于该协议中使用的双工突变检测，阈值可通过QX管理器软件的默认设置自动设置（参考结果中的图表）。
   9. 或者，阈值可以通过十字线或套索方法手动设置，确保阈值或套索边界将正负簇分隔开来，并根据每次运行中包含的正负对照定义的簇位置进行定位。
      注意：在一批样本中，阈值应一致设置，使用正负对照，以确保突变调用的可重复性。
   10. 报告的浓度为最终1xdPCR反应的拷贝数每μL。

结果

Genesis细胞分离系统采用微流控细胞捕获载玻片，在25–250细胞·^mL-1 浓度下，平均分离出84%的尖峰癌细胞（见图3A）。这种高捕获效率证明了富集步骤在从全血样本中分离罕见循环肿瘤细胞的有效性。使用系统列举协议对微流控细胞捕获载玻片捕获的细胞进行可选免疫染色，展示了通过两种针对细胞角蛋白的阳性抗体、DAPI识别有核细胞和一种针对CD45的阴性抗体（该抗体表达于大多数白细胞，但通常不表达于CTCs）进行罕见细胞鉴定（见图3B）).这种染色模式确认了在排除背景白细胞的情况下成功识别出循环肿瘤细胞。

ddPCR突变检测测定法使得富集癌细胞中的EGFR突变的识别和分析成为可能。本研究通过ddPCR和突变检测测定，展示了细胞中最初由Genesis平台富集的gDNA突变的检测能力。ddPCR图（见图4）对癌细胞系A549（EGFR野生型）和H1975（L858R/T790M）进行的两种检测EGFR突变显示，ddPCR能够敏感检测H1975细胞系中突变，这些突变在通过Genesis平台激增至全血后进行富集。H1975细胞中观察到阳性突变信号，而A549细胞中未检测到突变信号，证实了检测特异性。与对照细胞系A549交互的样本显示无突变，存在滴滴，证实L858R和T790M突变的检测与H1975细胞系特异性相关。在Genesis平台上进行CTC分离的演示，随后利用ddPCR进行分子分析，能够为液体活检和临床前研究提供强大的分子诊断工具，利用临床样本监测疾病进展和个性化治疗。总体而言，这些结果表明富集与ddPCR结合流程能够可靠地检测和定量循环肿瘤细胞中的EGFR突变。

图1：用于分析肺癌EGFR DNA突变的液体活检工作流程。 （A）肿瘤异质性示意，展示了通过传统组织活检和液体活检中循环肿瘤细胞（CTCs）检测到的不同EGFR突变谱。（B）利用液体活检进行循环肿瘤细胞EGFR DNA突变分析的示意工作流程。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：利用人工样本进行EGFR DNA突变剖析的演示。 （A）通过将具有明确EGFR突变状态的肺癌细胞系掺入健康供体全血中，制备模型CTC样本。（B）利用商业平台展示循环肿瘤细胞中EGFR DNA突变检测的工作流程。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：循环肿瘤细胞的无标记分离与鉴定。 （A） 利用半自动化罕见细胞分离平台，从健康捐献者中获得肺癌细胞系（A549和H1975）的捕获效率飙升。（B）对显示细胞角蛋白阳性肿瘤细胞的捕获细胞进行免疫染色。比例杆 = 10微米。请点击此处查看该图的放大版本。

图4。利用基于滴滴的数字PCR进行EGFR突变分析。 二维振幅图，显示细胞溶解和DNA提取后富集癌细胞中EGFR突变的检测。A549细胞（野生型）缺乏突变特异性信号，而H1975细胞则表现出EGFR L858R和T790M突变的阳性信号。该检测能够灵敏地检测和定量突变型和野生型DNA群体。请点击此处查看该图的放大版本。

组成部分	每次反应体积（μl）	最终集中
2个ddPCR超级混合探针（无dUTP）	10	1次
20x靶标（FAM）和野生型（HEX）引信/探针	1	1次
稀释限制酶（Msel）	1	2-5 U/反应
目标样品和/或无DNase水（NTA）	变量	变量
总量	20	-

表1：基于液滴的数字PCR突变检测反应设置。 用于检测癌细胞来源DNA样本中罕见EGFR突变的试剂成分及最终浓度。

热循环*步骤	温度	时间	爬坡率	循环次数
	（ºC）		（ºC/sec）
酶激活	95	10分钟	2	1
变性	94	30秒	2	40
退火/延伸	55	1分钟	2	40
酶失活	98	10分钟	2	1
冷却	4	30分钟	2	1
保持（可选）	4	∞（无限）	1	1
使用加热盖子，温度设定为105ºC，样品体积设为40μl，使用C1000 Touch热循环器 配备96口深井反应模块。

表2：数字PCR扩增的热循环条件。 利用96孔反应模块的热循环仪放大EGFR突变靶点的热循环参数。

讨论

实体肿瘤患者血液中循环肿瘤细胞的存在已被研究超过60年^，并自2010年首次纳入集体活检前即被认可为主要液体活^检。然而，CTCs较为罕见，且难以从^全血中选择性分离。然而，捕获和富集CTC的方法多种多样，正如以下综述^10,11所示，涵盖了物理/微流控方法以及细胞表面标记选择方法。这些方法中许多耗时且劳动密集，且通常涉及多个步骤或系统以实现所需的选择性。

本方案中从全血捕捉CTCs依赖于其大小（> 8微米）以及通过微流控细胞捕捉载玻片中微流控孔的表型正常红细胞和白细胞背景中是否存在畸形。因此，正确的样品装载、正确的载玻片底漆和防止堵塞是保持捕获效率和样品回收的关键步骤。

为了使工作流程成功，血液样本管理是关键因素;确保新鲜血液用于样本处理，并保持正确的运输和储存条件，以防止溶血。红细胞或白细胞的降解分别会影响CTC捕获的质量以及对任何罕见基因组变异的检测灵敏度。如果观察到溶血、凝固或可见的样品降解，不应处理该样本，因为这些情况可能降低CTC的恢复率和下游突变检测的敏感性。

由于CTC在全血中每千万个白细胞中含量可低于1个CTC，因此捕捉尽可能大的体积以进行富集至关重要。微流控细胞捕获载玻片可容纳10毫升血液，与标准的Streck和EDTA等血液捕获管相同，通常容量为7.5–10毫升。采集的血容量减少将直接影响CTC捕获敏感性及随后的基因组变异检测。从接受治疗的患者那里获得超出常规的量，在临床和伦理上都具有挑战性。除了将体积增加超过10毫升或利用诊断性白细胞分离样本增加白细胞/CTC群体^外，随着体积增加敏感性目前超出了Genesis平台的范围。

该方案按照标准标准操作程序（SOP）中规定执行，但谨慎确保血液采集新鲜，采集时将EDTA与血液全面混合，并在使用前仔细储存收集的血液，展示了该方案在重视常规标准操作程序的临床环境中的潜力。然而，由于该方案是通过人为样本演示的，因此在常规临床实施前，必须先与临床患者样本进行验证。

CTC群体中突变检测的敏感性取决于标准全血样本中CTC的存在以及该CTC群体内体细胞突变的后续检测，后者又取决于突变在CTC亚群中的频率。这两个混杂因素最终会限制捕获CTC群体中突变检测的整体敏感性;相比之下，后期样本可能拥有更高的CTC计数和携带突变的CTC群体，对早期检测样本的影响更大。

目前基于血液的液体活检研究严重偏向于将血浆中肿瘤DNA作为肿瘤存在的指示。通常，ctDNA的检测基于肿瘤特异性基因组标记的存在，如SNV、结构变异、MSI-H、TMB和CGP。CTC作为液体活检中较少使用的但同样有效的生物标志物，已知会因肿瘤生长和可能转移而排出到血液^中8。CTC的分析主要集中在用于捕获或利用既有或定制抗体面板（如泛细胞角蛋白、维氏蛋白、PD-L1、EpCAM等）进行捕捉后验证的细胞表面标志物。相比之下，CTCs的分子分析在应用上有限，主要由于选择性富集和捕获全血CTCs以及对CTC亚群的精确分析存在挑战。当前方法采用标准化工作流程，结合既定的CTC采集方案，随后使用ddPCR分子分析，并采用现成检测法，检测已知病理相关的基因组突变，样本是人工整血样本中的。该方法重要之处在于它能够直接从富集CTC进行突变分析，补充基于血浆ctDNA的液体活检方法。

利用现有方法，可以研究捕获的罕见CTC是否存在于全血中，以及CTC群体中是否存在病理相关的基因组标记。研究表明，评估癌症患者的ctDNA谱以及与ctDNA¹³并行循环的CTC储库具有价值，同时评估突变源的两者可扩展个体患者的整体分子结构。这有可能在转化研究范围内发展病理检测范式，最终进入临床环境。新范式将结合CTC存在作为癌症存在/进展的指示，以及CTC捕获细胞内可能提示克隆扩增或治疗耐药性的病理突变¹⁴。这意味着转移和克隆扩增的发生，随后的耐药性可以在ctDNA和CTC水平同步监测，直接影响晚期癌症的治疗选择。

未来的应用可能包括将该工作流程调整至更多癌症相关突变，并在纵向临床样本中测试其表现。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Genesis 细胞分离系统	Bio-Rad Laboratories	12019822	仪器（称为“半自动细胞分离系统”）
QX200 液滴生成器	Bio-Rad Laboratories	1864002	仪器
QX200 液滴读取仪或 QX600 液滴读取仪	Bio-Rad Laboratories	1864003 或 12013328	仪器（称为“液滴读取仪”）
PX1 PCR 板封口器	Bio-Rad Laboratories	1814000	仪器
C1000 Touch 热循环仪及 96-深孔反应模块	Bio-Rad Laboratories	1851197	仪器
Qubit 4 荧光分光光度计	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226	仪器
Celselect 载玻片			耗材（称为微流控细胞捕获载玻片）
Celselect 载玻片富集套件 2.0	Bio-Rad Laboratories	17009455	耗材
DNAzol BD	Molecular Research Center, Inc.	DN129	试剂
MseI 限制性内切酶	New England Biolabs	R0525S	试剂
ddPCR 突变检测试剂盒: EGFR T790M	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010019	试剂盒
ddPCR 突变检测试剂盒: EGFR L858R	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010021	试剂盒
Qubit 1X dsDNA 高灵敏度试剂盒	Invitrogen	Q33230	试剂盒
用于 QX200 液滴生成器的 DG8 弹药架	Bio-Rad Laboratories	1864008	耗材
用于探针的液滴生成油	Bio-Rad Laboratories	1863005	耗材
用于探针的自动液滴生成油	Bio-Rad Laboratories	1864110	可选耗材
用于探针的 ddPCR 超级混合物（不含 dUTP）	Bio-Rad Laboratories	1863023	试剂
PCR 板热封	Bio-Rad Laboratories	1814040	可穿孔箔封口
DNA LoBind 微离心管, 1.5 ml	Eppendorf	022431021	耗材
ddPCR 96-孔板	Bio-Rad Laboratories	12001925	耗材