本文详细介绍了一种简便的三维共培养方法，该方法通过重建的基底膜将两种细胞类型分隔开，所需专用设备较少，并可通过多种实验技术进行便捷分析。
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本文详细介绍了一种简便的三维共培养方法，该方法通过重建的基底膜将两种细胞类型分隔开，所需专用设备较少，并可通过多种实验技术进行便捷分析。
三维（3D）共培养是一种快速发展的技术，适用于研究人员精确研究细胞间相互作用 体外 实验。通过模拟细胞与细胞外环境之间的相互作用及细胞形态的变化，可克服单层细胞培养的局限性，包括细胞与细胞外环境间相互作用有限以及细胞形态受到干扰等问题。 体内 细胞环境。利用支架提供结构支持，并加入具有生物活性的细胞外基质成分，三维培养体系所呈现的细胞行为和形态更接近真实组织。将多种细胞类型整合到此类三维环境中，可在仿生模型系统中研究细胞间的相互作用。目前已有多种三维共培养技术，各自具有优势与挑战。这些技术通常需要专用设备、复杂的操作流程或特定的技术知识。此外，针对被重建基底膜分隔的两种细胞类型之间的间接细胞间相互作用，目前标准化的研究方法仍较为有限。本文介绍一种三维共培养方法，仅需基本实验技能，使用更广泛适用的材料，即可成功模拟跨越基底膜的间接细胞间相互作用。该方法首先将一层细胞覆盖于细胞外基质（以Matrigel形式）之上，随后在基质层上方接种第二类细胞。共培养体系维持培养五天，之后可通过免疫荧光分析细胞形态变化，或从共培养体系中提取细胞进行更深入的基因组、转录组或蛋白质组分析。该实验方案特别适用于研究当细胞间因基底膜阻隔而无法直接接触时，细胞通讯对细胞行为的影响。随着研究人员持续倾向于采用更 体内相关 细胞培养方法需要一种简化的途径，以避免过高的入门门槛。
体外 细胞培养是一种可靠、快速且广泛应用的研究技术。尽管传统的细胞培养方法功能强大，但其与真实生理环境存在显著差异 体内 环境。单层细胞培养的空间限制性会导致基因表达、形态学和生物化学的改变1,2,3三维（3D）培养技术可解决这一差异，细胞在模拟器官和组织中细胞外基质（ECM）的支架中生长。在3D培养中，细胞表现出的形态和行为更接近于体内所观察到的情况 体内4,5 然而，仅靠三维培养并不能完全重现一个组织的多种组分 体内 微环境，因为它缺乏其他细胞类型的贡献6.
细胞间的直接（细胞间接触）和间接相互作用在细胞行为中起着重要作用 在体内7,8. 要重现这些相互作用，需要采用三维共培养模型，即将多种细胞类型共同培养于三维环境中。利用这些技术，可实现 体内类生长环境可以被建立 体外，提高结果的生....
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本方案（图1A）介绍了一种三维共培养系统，旨在模拟细胞间通过基底膜基质的相互作用。该系统可进一步通过共聚焦显微镜进行下游分析（图1B），或从共培养体系中收获细胞进行分析（图1C）。本方案采用“三明治”结构，即将一层细胞外基质（ECM）凝胶置于两层细胞之间，无需特殊设备，仅需掌握现代细胞培养技术的基本知识即可操作。
1. 三维共培养体系的制备
注意：本方案旨在以3T3-L1脂肪细胞与MDA-MB-231乳腺癌细胞为例，展示三维共培养方法的代表性应用。若使用不同类型的细胞，则需优化细胞接种密度，并预先测试不同批次的细胞外基质（ECM）凝胶，以确保其有效性。本方案包含无脂肪细胞对照组和条件培养基对照组的设置。根据具体实验目的，可能还需增设其他对照组。
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为了证明本方案在研究跨越基底膜的细胞间相互作用效应方面的有效性，图2 和 图3 改编自先前发表的研究（Pallegar 等人16），用作代表性结果。图4 和 图5 为新获得的数据，生成目的在于展示本方案适用于非乳腺癌细胞，以及从共培养环境中收获细胞并用于后续实验的能力。
采用该方法成功进行共培养后，可获得清晰的图像，其中目标细胞类型的独特形态特征可被测量和分析（图2）。根据所选共培养细胞的类型及其细胞间相互作用的程度，形态学变化可能有所不同。形态学变化通过比较属于不同形态学类群的细胞数量来进行量化。在乳腺癌细胞与脂肪细胞共培养的情况下，观察到间充质-上皮转化（MET）现象，因此构建的形态学分类也反映了这一变化。简言之，使用ImageJ软件，.......
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传统细胞培养中缺乏复杂的细胞间相互作用，凸显了建立更优的器官和组织模型的必要性，以更准确地研究药物反应和疾病进展的体内情况（in vivo）。三维共培养系统的发展在一定程度上弥补了这一不足，使得无需开展体内（in vivo）研究即可探究细胞间相互作用的后果9,12。然而，许多此类方法在机械上较为复杂，建立过程需要大量资源、时间以及专业技术经验10,12。相比之下，本方案采用标准化的实验技术，所需特定技术经验极少。此外，本方案所需的材料具有更广泛的适用性，很可能在本方法之外也具有应用价值。
该实验方案的关键在于利用一种具有生物学相关性的物理屏障——三维基质，将两种细胞分隔开来 。该基质不仅提供结构支持和多种生长信号，还有利于细胞间的间接相互作用9。目前已有多种.......
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作者声明无利益冲突。
该方法的开发部分由癌症研究协会资助。GRK 获得了加拿大癌症协会通过比阿特丽斯·亨特癌症研究所癌症研究培训项目提供的卡罗尔·安·科尔研究生奖学金的资助。PMMB 获得了巴利阿里群岛健康研究所（IdISBa）MOBILITAS 项目资助（2024 年）。图 1 使用 BioRender 制作。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔组织培养板 | Corning | 3524 | |
| 24 × 60 mm 盖玻片 | Ultident Scientific | 170-C2460 | |
| PBS中4%多聚甲醛 | Invitrogen | J61899.AK | 用1×PBS稀释至2% |
| 4孔腔室载玻片 | Falcon | 354114 | |
| Alexa Fluor 647标记的AffiniPure Fab片段驴抗山羊IgG（H+L） | Jackson Immunoresearch Laboratories Inc. | 705-607-003 | |
| 亮线血细胞计数板 | Hausser Scientific | 3120 | |
| CellTrace CFSE细胞增殖检测试剂盒 | Invitrogen | C34570 | |
| 细胞回收溶液 | Corning | 354253 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich Canada Co. | D9542 | |
| 驴抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二抗，DyLight 594标记 | Invitrogen | SA5-10168 | |
| 驴抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647标记 | Invitrogen | A31573 | |
| DMEM/F-12，无酚红 | Gibco | 21041025 | |
| 杜尔贝科改良伊格尔培养基（高糖型，含丙酮酸钠） | Gibco | 11995-065 | |
| 胎牛血清，加拿大来源 | Gibco | 12483-020 | |
| Flowmi细胞筛，40 µM | Bel-Art | 136800040 | |
| GE高级硅胶门窗密封胶，透明 | Henkel International | 2811093 | |
| 山羊多克隆抗ZO-1抗体 | SantaCruz Biotechnology | SC8146 | 一抗，已停产 |
| 大鼠单克隆抗ZO-1抗体 | SantaCruz Biotechnology | SC33725 | 替代一抗，用于替代已停产的SC8416抗ZO-1抗体 |
| 乳腺上皮细胞基础培养基 | Promocell | C-21210 | |
| Matrigel，无酚红，生长因子减少型，无LDEV | Corning | 356231 | 蛋白浓度：9–9.6 mg/mL |
| 小鼠单克隆抗波形蛋白抗体 | Sigma-Aldrich Canada Co. | V2258 | 一抗 |
| 新生牛血清，新西兰来源 | Gibco | 16010159 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂 | Invitrogen | P36934 | |
| 纯化的小鼠抗E-钙黏蛋白抗体 | BD Biosciences | 610181 | 一抗 |
| 兔多克隆抗Claudin 7抗体 | Abcam | AB27487 | 一抗 |
| RPMI 1640培养基（含谷氨酰胺） | Gibco | 11875-093 | |
| 补充剂混合液 | Promocell | C-39115 | |
| 台盼蓝染液（0.4%） | Gibco | 15250-061 | |
| 胰蛋白酶0.25%-EDTA | Gibco | 25200056 |
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