三维共培养方法，用于研究不同细胞类型在重建基底膜上的间接相互作用

Summary

本文详细介绍了一种简单明了的方法，用于三维共培养两种细胞类型，这些细胞被重建的基底膜分隔，几乎不需要专用设备，并且可以通过多种实验技术轻松分析。

Abstract

三维（3D）共培养是一种快速发展的技术，旨在通过 体外 实验准确研究细胞间相互作用的研究人员。通过模拟 体内 细胞环境，解决了单层细胞培养的局限性，包括细胞与细胞外环境相互作用有限以及细胞形态紊乱。利用支架提供结构支撑，并包含生物活性的细胞外基质成分，三维培养表现出更符合组织的行为和形态。将多种细胞类型纳入这种三维环境，可以研究仿生模型系统内的细胞间相互作用。各种三维共文化技术已经涌现，每种技术都有其优势和挑战。这些技术通常需要专用设备、复杂的设备或特定的技术知识。此外，存在一些标准化的方法用于研究两种细胞类型之间间接的细胞间相互作用，这些细胞类型被重建的基底膜分隔。本文介绍了一种仅需基础技术技能的三维共培养方法，并利用更广泛适用的材料成功复现基底膜间接细胞间的相互作用。一层细胞单层被一层细胞外基质（母三体胶）覆盖，并在其上播种第二种细胞类型。共培养结果会持续五天，之后通过免疫荧光分析细胞的形态变化，或从共培养中提取，进行更详细的基因组学、转录组学或蛋白质组学分析。该方案非常适合研究基底膜禁止物理接触时细胞间通信对细胞行为的影响。随着研究人员不断选择更 贴近体内的 细胞培养方法，采取简化的方法以避免高门槛进入。

Introduction

体外细胞培养是一种稳健、快速且广泛使用的研究技术。虽然传统的细胞培养方法很强大，但它们与体内环境有很大不同。单层细胞培养的空间限制性导致基因表达、形态和生物化学的变化 ^1,2,3。三维（3D）培养技术解决了这一差异，因为细胞在模拟器官和组织中存在的细胞外基质（ECM）支架中生长。在三维培养中，细胞表现出更接近体内观察的形态和行为 ^4,5 然而，单靠三维培养无法完全复现体内微环境的众多组成部分，因为它缺乏其他细胞类型的贡献⁶。

细胞间直接接触和间接细胞间相互作用在细胞体内行为中起着重要作用 ^7,8。重现这些相互作用需要三维共培养模型，即在三维环境中将多种细胞类型共同培养。利用这些技术，可以在体外建立类似体内的生长环境，从而提升结果的生物学相关性 ^9,10。然而，特定实验所需的环境越具体，方法论就越复杂。目前缺乏可用于研究细胞间相互作用的标准化模型系统，这些细胞被基底膜基质分隔。因此，该协议旨在以稳健且可重复的方式模拟基底膜基质上的细胞间相互作用。该技术基于先前建立的三维培养模型¹¹，利用一层三三凝胶（以下称为ECM凝胶）物理分离培养中的两种不同细胞类型，同时允许分泌的因子通过。它最初设计用于研究脂肪细胞对间充质乳腺癌细胞的间接影响，但可以轻易改造以适应多种细胞类型。应仔细考虑该方法是否适合特定实验设计。该方法不允许细胞间直接相互作用，因此应限于模拟细胞间通过基底膜基质间接通信的体内场景。例如，该系统并不适合模拟细胞毒性T细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，因为它们通常直接相互作用。相反，考虑生物学场景中，基底膜自然分隔了两种感兴趣的细胞类型。例如，该方法可应用于肿瘤细胞与血管内皮细胞在血管内皮细胞之间血管内渗入前的相互作用研究。

一种常见的替代三维共培养方法是使用专用的微流控芯片，或称“有机芯片（OoC）”。OoC系统强大且可针对单个实验进行定制，但需要投入大量时间和资源进行芯片设计、材料选择、外设设备、优化和^{数据收集。}此外，目前尚无标准材料或方法能在不干扰微流^控流动的前提下，提供基底膜基体的生物和物理线索。因此，将OoC技术应用于细胞间基底膜相互作用的研究还面临更多挑战。本协议中提出的方法旨在提供一种标准化的替代方案，同时保持生物学相关性和可及性。

Protocol

该协议（图1A）概述了一种三维共培养系统，旨在重现基底膜基质上的细胞间相互作用。下游分析可通过共聚焦显微镜（图1B）或从共培养中采集细胞（图1C）进行。通过采用“夹心”结构，即将一层ECM凝胶夹在两个细胞群体之间，该方案无需专用设备，且可凭现代细胞培养技术的基础知识完成。

1. 3D 共培养制备

注：本方案旨在作为3D共培养方法的代表性应用，使用3T3-L1脂肪细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞。不同细胞类型的使用需要优化细胞播种密度，并对ECM凝胶批次进行预测试以确保有效性。该协议涉及无脂肪细胞控制和条件培养基控制的使用。根据实验目标，可能需要更多对照。

1. 细胞培养与溶液制备
   1. 获取并建立3T3-L1前脂肪细胞和MDA-MB-231乳腺癌细胞系的培养物。在II类生物安全柜和标准相随^{细胞培养方法}中，使用无菌技术独立培养和维护所有细胞。在Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）中维持3T3-L1细胞，辅以10%（v/v）新生儿小牛血清（NBCS）和1%青霉素-链霉素（10,000 U/mL）。维持MDA-MB-231细胞在RPMI 1640中，辅以10%胎儿牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（10,000 U/mL）。
      注意：在维持期间切勿让3T3-L1细胞超过80%的汇聚度，且不要使用超过第20^传 代号的培养物。
   2. 获取或制备1x磷酸缓冲盐水（PBS）的库存溶液，含137 mM氯化钠、2.7毫米钾氯化油、10毫米钠_{2 HPO4}、1.8 mM KH₂PO₄、pH 7.4。
   3. 将50毫升PBS-甘氨酸洗涤液加入50毫升PBS，加入50毫升PBS，最终甘氨酸浓度为100 mM。溶液在4°C下保存长达12个月。
   4. 通过加入50微升Triton X-100到9.5毫升PBS中，制备10毫升渗透缓冲液。注满10毫升，最终浓度为0.5%（v/v）Triton X-100。保存温度为4°C，1个月内使用。
   5. 通过加入50微克牛血清白蛋白（BSA）、100微升Triton X-100和25微升Tween-20至45毫升PBS，制备50毫升免疫荧光缓冲液。填充至50毫升，最终浓度为0.1%（含水/v）BSA，0.2%（v/v）Triton X-100,0.05%（v/v）Tween-20。保存温度为4°C，1个月内使用。
   6. 将10毫升动物血清加入9毫升间歇缓冲液，最终浓度为10%血清。保存温度为4°C，1个月内使用。
      注意：血清的物种鉴定取决于所用次级荧光抗体的宿主物种（见2.2.4）。
   7. 将ECM凝胶（总蛋白浓度~9-9.5 mg/mL）在4°C下解冻过夜。将500微升的分量样品装入1.5毫升微型离心管，并在-20°C下储存。
      注意：ECM凝胶变异性较大，必须验证以诱导每种细胞类型的预期行为。不同细胞类型可能需要不同的蛋白质浓度或基质刚度。
      注意：处理ECM凝胶时，务必使用预冷移液器的吸头和容器，以避免室温下聚合。搬运时一定要保持ECM凝胶冰藏。
2. 脂肪细胞分化
   1. 将50,000至80,000个3T3-L1前脂肪细胞，用0.5毫升标准培养基播种到4孔腔腔载玻片的2孔中。空井将用于无脂肪细胞和调制培养基控制。
      注意：腔体滑动细胞培养容易受到机械破坏。避免滤质真空吸入，使用手动移液器温和移液技术。
   2. 将5万至8万个3T3-L1前脂肪细胞，种子在0.5毫升标准培养基中，放入24孔组织培养板的单一孔中。该设备将用于收集调质介质，以供调制介质控制。
   3. 让两种文化在24小时内达到100%的汇合。
   4. 通过用DMEM补充10% FBS、0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄基（IBMX）和1微米地塞米松的脂肪生成培养基替代培养基来启动脂肪生成。在5%二氧化碳培养箱中，细胞在37°C下孵育48小时。
   5. 48小时后，用新的脂肪生成进展培养基替换用过的培养基，该培养基包括DMEM和10% FBS和10 μg/mL胰岛素。在5%_CO2 培养箱中，37°C下再孵育48小时。
   6. 在继续进行三维共培养前，先目视确认>60%的细胞中存在脂滴。如果脂滴积累缓慢，应用DMEM替代进展培养基，辅以10% FBS，并每24小时监测一次脂质含量。
3. 三维共文化的叠加与维护
   1. 在4°C下解冻ECM凝胶一夜，然后继续覆盖。
      注意：为避免批次间差异影响，建议在同一研究中对所有实验使用相同批次的ECM凝胶。
   2. 成功分化3T3-L1后，去除用过的培养基，留下约50微升的小型缓冲液。
   3. 小心地向每个含有脂肪细胞的腔室切片孔添加110微升ECM凝胶，注意不要扰动脂肪细胞单层。
      注意：ECM凝胶在室温下凝固迅速。为避免基质过早聚合，应始终将ECM凝胶冰藏，并使用预冷至-20°C的试尖。
   4. 向空的无脂肪细胞对照槽加入110微升ECM凝胶。为了确保母三叶菌均匀分布，可以滴入井角和井中。用移液器尖端轻轻涂抹马特里格尔，避免刮擦。
   5. 将载玻片在37°C下孵育1小时，以便ECM凝胶聚合。
   6. 在此培养过程中，收集并计数MDA-MB-231细胞
      可选：详见第1.4步，了解如何荧光标记这些细胞。
   7. 制备稀释的MDA-MB-231细胞悬浮液，浓度为30,000细胞/mL，含含2%ECM凝胶（v/v）的乳腺生长培养基中。
      注意：最佳细胞播种密度因细胞类型而异，必须在实验前进行优化。注意：乳腺生长培养基是一种商业化的细胞培养基，专为乳腺上皮细胞优化。它含有0.4%牛垂体提取物、10 ng/mL表皮生长因子（重组人）、5 μg/mL胰岛素（重组人）和0.5 μg/mL氢化可的松。共培养基必须谨慎选择，以满足两种细胞类型的需求。
   8. ECM凝胶聚合后，轻轻向每个孔加入450微升MDA-MB-231悬浮液。这导致每孔总细胞计数为13,500个。
      注意：此阶段细胞悬浮液覆盖凝胶表面可能不均匀。目视检查弹室侧面，轻轻敲击弹室四侧以均匀分布。
   9. 在24孔板上的脂肪细胞培养液中，加入450微升含2%ECM凝胶（v/v）的乳腺生长培养基。每48小时采集并更换一次培养基。
   10. 共菌最多维持5天，培养基每48小时更换一次。
       注意：避免真空吸入，使用温和移液。ECM凝胶脱落是共培养维护过程中可能出现的问题。
   11. 仅在调控培养基中，稀释采集的脂肪细胞（步骤1.3.9）与新鲜培养基1：1调控，然后在第2天和第4天替换用过的共培养基。
       注意：此时共培养期结束，必须通过固定和染色培养物以确定形态和标记表达（见 第2节）或从共培养环境中提取细胞并准备下游分析（见 第3节）进行分析。
4. 荧光细胞标记（可选）
   注意：在第1.3.7步之前可以对覆盖细胞进行标记，以帮助在免疫荧光成像采集过程中识别覆盖细胞。
   1. 将10毫克CFSE溶解在4.22毫升DMSO中，制备5毫米的羧氟荧光素二醋酸琥珀酰胺酯（CFSE）库存溶液。储存在500微升的铝卷中，温度为-20°C，避免光照保护。
   2. 计数步骤1.3.6的细胞后，用5毫升PBS洗细胞一次。将所得沉淀在1x PBS中重新悬浮，最终浓度为1,000,000细胞/毫升。
   3. 每毫升细胞悬浮液加入1微升5 mM CFSE，以达到5微米的最终工作浓度。在室温下培养细胞悬浮液20分钟，避免光照保护。
   4. 通过添加5卷培养基来淬灭CFSE染色。在室温下再孵育5分钟。
   5. 用颗粒细胞并用PBS洗涤两次，以去除残留的CFSE。将细胞重新悬浮在预热的乳腺生长培养基中。在室温下再孵育10分钟，确保没有染料残留。
   6. 按照步骤1.3.7描述的荧光标记细胞种子。协议的其余部分可以按描述方式执行。

2. 免疫荧光

1. 固定
   注意：为避免ECM凝胶脱聚和洗涤过程中样品损失，使用前应让所有试剂在室温下平衡~30分钟。
   1. 共培养5天后，用500微升PBS替换培养基。
      注意：步骤2.1.2至2.3.7可在非无菌条件下执行。
   2. 去除PBS，并用2%对甲醛（PFA）替换在室温下浸泡10分钟的PBS（新鲜处理）。
      注意：ECM凝胶对PFA敏感，可能导致凝胶层脱落。
      注意：PFA会随着时间分解成甲醛。处理PFA时，避免吸入烟雾，确保充足通风，并始终佩戴适当的个人防护装备（如手套、实验服、护目镜）。
   3. 去除PFA，并用500微升PBS-甘氨酸洗涤液在室温下轻轻搅拌15分钟清洗井。
      注意：使用PBS-甘氨酸洗涤剂对于防止游离醛产生背景荧光至关重要。不要用不含甘氨酸的PBS洗脸。
   4. 重复步骤2.1.3两次，共洗三次。关于存储条件，请参见2.1.5，如果不需要，可以跳到2.2.2步骤。
   5. 此时，该方案可暂停最长1周，切片可保存至4°C。 储存载玻片时，所有孔中注满1毫升PBS，并用细带防腐胶封住腔室载玻片的盖子。将载玻片平放在防光容器中，放在湿润的细腻组织上，以确保培养物不会干燥。
2. 抗体染色
   1. 将先前储存的玻片移至室温，取出PBS，并用500微升新鲜PBS轻轻搅拌清洗井体15分钟。如果直接从步骤2.1.4继续，可以跳过这一步。
   2. 在室温下，使用500微升渗透缓冲液浸15分钟无搅拌。
   3. 用500微升PBS冲洗井，轻微搅拌15分钟。重复两次，总共洗3次。
   4. 向每个孔槽加入500微升阻断缓冲液，并在室温下轻微搅拌下孵育1小时。
      注意：确保阻断缓冲液中的血清来源与宿主二级抗体物种匹配。在该方案中，我们使用驴血清和驴二级抗体。
   5. 根据制造商建议，稀释IF缓冲液中感兴趣的一级抗体。移除阻塞缓冲液，向每个孔加入300微升稀释抗体溶液。
   6. 用防腐胶封住腔室滑套，并将滑套放入防光容器中。在4°C下温和搅拌，隔夜孵育。
   7. 用500微升间歇性间歇缓冲液冲洗井，轻微搅拌15分钟。重复两次，总共洗3次。
   8. 根据制造商建议，在IF缓冲液中稀释适当的荧光标记二级抗体。每个孔槽加入300微升二级抗体稀释液，并在室温下轻微搅拌下培养1小时。
      注意：此步骤后避免长时间暴露于光线下，以减少光漂白。
   9. 重复步骤2.2.7。
   10. 将300微米的4'，6-二酰胺-2-苯吲哆酮（DAPI）1：800 p_bs稀释液。每孔加入300微升，并在室温下轻轻搅拌，培养20分钟。
   11. 用500微升PBS洗细胞5分钟，轻轻搅拌。重复一次。
3. 滑套安装
   1. 尽量去除残留PBS，同时不干扰培养物。更换盖子，使用腔室滑套制造商提供的工具将腔体与玻璃滑片分离。
   2. 使用精致的任务组织擦拭载玻片边缘，去除残留的PBS，同时不扰动ECM凝胶。
   3. 用注射器和18克针头慢慢将硅胶密封剂绕过滑套边缘。让硅胶静置3分钟。
   4. 硅胶凝固期间，每个凹槽滴1-2滴防褪色装载介质。避免气泡。如果形成气泡，请用移液器小心地去除，避免损伤培养物。
   5. 硅胶凝固后，轻轻放下玻璃盖套，角度较浅。在放下盖套时，使用产钳或移液器头排出气泡。用轻柔的压力避免打碎封面。
   6. 将滑套放入室温的防光容器中，静置一夜。切片可保存至4°C，方案暂停最长1周。
      注意（可选）：为了更好地密封滑套，滑套后1小时在封面滑动后在封面贴片边缘涂抹透明指甲油。
   7. 使用共聚焦荧光显微镜拍摄10-20倍放大的图像载玻片。捕捉五个随机视场以最大限度减少算子偏差。

3. 采集共培养物进行下游分析

注意：采集细胞或生物分子与免疫荧光不兼容。建议在标准24孔培养皿中培养用于其他下游分析的共培养物，使用与第1和2节所述相同的细胞浓度和体积。

1. 细胞提取
   1. 去除用过的培养基，用冰冷的PBS轻轻清洗井口。重复一次，总共洗两次。
   2. 使用宽口径移液器尖端，加入1毫升冰冷细胞回收液，以下称为回收液。轻轻上下移液器，破坏ECM凝胶层。将液体转移到1.5毫升的微离心管中。
      注意：细胞回收溶液是一种商业化的非酶类溶液，旨在温和地释放嵌入ECM凝胶中的细胞。这是一种专有组合，可能与某些单元类型不兼容。作为替代方案，可以使用像Dispase或Accutase这样的温和蛋白酶对ECM凝胶进行酶促脱聚。这将需要37°C的孵育时间，并优化培养时间。
   3. 每口井加入250微升冰冷回收液以收集剩余细胞。转移到相应的微型离心管中。
   4. 倒置管4-5次来混合。
   5. 将试管转移到冰上，轻轻搅拌后孵育60分钟。每10分钟倒置2-3次，防止管内内容沉降。
   6. 离心管在300 x g 下4 °C下加热5分钟
   7. 确认是否有可见的细胞颗粒。小心取出上清液，加入1毫升冰冷的1xPBS。离心机在300 x g 下，4°C下离心5分钟。 重复一次，总共洗两次。预计沉淀中初始播种细胞的比例约为80-90%，且每种细胞类型的比例保持不变。
      注意：此时，细胞沉淀可以被裂解以收集蛋白质或核酸。溶解颗粒可在-80°C下储存，且该方案可暂停3个月。溶解与3.2不兼容。
2. 单电池悬浮液制备
   1. 将沉淀液置于200微升，含0.25%胰蛋白酶-EDTA。然后在37°C下孵育3-4分钟。
   2. 加入600微升完全生长培养基以抑制胰蛋白酶消化。
   3. 在室温下以300 x g 离心机离心5分钟。去除上清液，加入500微升室温PBS。
   4. 在室温下以300 x g 离心机离心5分钟。重复一次，总共洗两次。
   5. 将沉积物重新悬浮于80微升PBS中，含0.04% BSA，使用40微米滤芯悬浮液。
   6. 将5微升悬浮液稀释于5微升的锥蓝中。计数细胞并用血细胞计评估存活能力。单元现已准备好进行下游分析。

Results

为证明该方案在研究细胞间基底膜相互作用效应中的有效性， 图2 和 图3 被重新利用自之前的文献（Pallegar 等¹⁶）作为代表性结果。 图4 和 图5 是新颖数据，展示了该方案对非乳腺癌细胞的适应性，以及从共培养环境中采集细胞以供下游使用的能力。

使用该方法成功共培养可获得清晰图像，能够测量和分析感兴趣细胞类型的明显形态特征（见图2）。根据选择共培养的细胞身份以及细胞间相互作用的程度，形态变化可能有所不同。形态变化通过比较属于形态不同群体的细胞数量来量化。在乳腺癌与脂肪细胞共培养的情况下，观察到间充质到上皮的转变（MET），并构建了形态组以反映这一变化。简而言之，通过使...

Discussion

传统细胞培养中缺乏复杂的细胞间相互作用，凸显了需要改进器官和组织模型，以更准确地研究体内药物反应和疾病进展。三维共培养系统的发展通过无需体内研究即可研究细胞间相互作用的后果，填补了这一空白 ^9,12。然而，许多方法在机械上较为复杂，需要大量资源、时间和技术经验来设置^10,12。相比之下，我们的方案采用标准化的实验室技术，所需的具体技术经验极少。此外，该协议所需的材料更为通用，且很可能在该方法之外也有用。

该方案的关键在于通过物理屏障分隔两种细胞类型，这一屏障同时也是生物学意义上的三维基质。该基质提供结构支持和多种生长信号，同时有利于间接的细胞间^{相互作用9.}许多此类矩阵存在，蛋白质组成和基质刚度各异。为...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
24孔组织培养板	科宁	3524
24 x 60毫米封面玻璃	Ultident 科学	170-C2460
PBS中4%对甲醛	Invitrogen	J61899。AK	稀释至2%浸泡在1xPBS中
4孔腔室培养玻片	猎鹰	354114
Alexa Fluor 647 AffiniPure Fab 片段驴抗山羊 IgG （H+L）	杰克逊免疫研究实验室公司	705-607-003
明亮线血细胞计	豪瑟科学	3120
CellTrace CFSE 增殖套件	Invitrogen	C34570
细胞恢复解决方案	科宁	354253
达皮	Sigma-Aldrich 加拿大公司	D9542
驴类抗小鼠IgG（H+L）交叉吸附二级抗体，DyLight 594	Invitrogen	SA5-10168
驴子抗兔IgG（H+L）高度交叉吸附的二级抗体，Alexa Fluor 647	Invitrogen	A31573
DMEM/F-12，不含酚红	吉布科	21041025
杜尔贝科改良鹰介质，高葡萄糖，丙酮酸	吉布科	11995-065
胎牛血清，加拿大起源	吉布科	12483-020
Flowmi 细胞滤网，40 & micro;M	贝尔-阿尔特	136800040
GE先进硅胶窗户和门，透明	亨克尔国际	2811093
山羊多克隆抗ZO-1	圣克鲁斯生物技术	SC8146	原版抗体，已停用
大鼠单克隆抗ZO-1	圣克鲁斯生物技术	SC33725	替代原一抗抗体以替代已停用的SC8416抗ZO-1抗体
乳腺上皮细胞基础培养基	Promocell	C-21210
三色凝胶、无红酚、生长因子减少、无LDEV	科宁	356231	蛋白质浓度：9-9.6 mg/mL
小鼠单克隆抗维甲素	Sigma-Aldrich 加拿大公司	V2258	一级抗体
新生儿小牛血清，新西兰起源	吉布科	16010159
青霉素-链霉素	吉布科	15140-122
磷酸盐缓冲盐水，pH值7.4	吉布科	10010023
ProLong 金色防褪色装配剂	Invitrogen	P36934
纯化小鼠抗E-Cadherin	BD生物科学	610181	一级抗体
兔子多克隆抗克劳丁7	阿布卡姆	AB27487	一级抗体
RPMI 1640，谷氨酰胺	吉布科	11875-093
补充混合	Promocell	C-39115
锥虫蓝染（0.4%）	吉布科	15250-061
胰蛋白酶 0.25%-EDTA	吉布科	25200056