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方法文章

基于FRET的生物传感器的定量比率分析 拟南芥 实现亚细胞区室中分析物的活体测量

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DOI：

10.3791/70028

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2026年2月24日

 , 
1Department of Biology, Texas A&M University

本文内容

摘要

我们提出了一种利用基于荧光共振能量转移（FRET）的生物传感器对活细胞中亚细胞区室内的分子或离子进行定量分析的实验方案。该方法包括标准化成像、二值化掩膜处理以及比率分析结合线性回归，以拟南芥（Arabidopsis thaliana，A. thaliana）中的磷酸盐分析为例，但同样广泛适用于其他生物传感器和生物体。

摘要

荧光生物传感器为监测活细胞内代谢物或离子浓度的动态变化提供了一种非侵入性且多功能的方法。特别是基于FRET的生物传感器，能够进行比率测量，报告亚细胞分析物水平，同时不受生物传感器表达水平的影响。本文描述了一种针对植物中基于FRET的生物传感器进行定量比率分析的全面且标准化的实验方案。该方案指导用户完成活体样品制备、供体、FRET和受体通道的共聚焦图像采集、亚细胞感兴趣区域的二值掩膜生成，以及基于回归的比率数据分析。主要输出结果为通过回归分析获得的比率读数，可用于不同基因型、组织、发育阶段和处理条件之间的定量比较。以用于无机磷酸盐检测的cpFLIPPi-5.3m生物传感器为例，我们展示了在叶绿体基质中测定无机磷酸盐水平的方法。 A. thaliana该分析框架可广泛适用于其他基于FRET的生物传感器和模型系统，能够对代谢物和离子进行精确的时空定量。 体内该策略可提供对代谢物和离子亚细胞动态的可量化洞察，支持在不同实验条件下进行比较分析。

引言

监测活体植物细胞中代谢物和离子的动态变化，对于理解代谢途径和信号网络如何在时空上协调以支持生长和发育至关重要1,2细胞代谢物水平会随着营养物质的可利用性、光照强度和胁迫等环境信号的变化而迅速波动3. 其中，水平 无机磷酸盐（Pi）在能量转移、信号传导和代谢调控中具有关键作用，因此尤为重要，但其亚细胞动态仍难以测量4.

标准比色法检测和磷-31核磁共振（³¹P-NMR）可估算总无机磷（Pi）或区室化Pi含量，但缺乏单细胞分辨率且时间精度有限5,6。同步辐射X射线光谱法和放射性示踪成像虽能提供亚细胞水平或通量信息，却难以可靠区分无机磷与磷酸化代谢物，且通常具有侵入性。非水性分级分离和基于酶的动力学检测可间接估算叶绿体基质和细胞质中的Pi，但这些方法操作繁琐且易受污染7,8。上述局限性共同凸显了对非破坏性、高时空分辨率方法的需求，以实现对Pi等代谢物的实时监测，例如基于FRET的生物传感器活体成像。

基于FRET的遗传编码生物传感器是用于分析细胞内离子和代谢物动态变化的有力工具。in vivo 早期研究已证明此类生物传感器可用于监测细胞内葡萄糖、蔗糖和ATP浓度9,10,11。近年来的技术进展进一步将该方法拓展至钙离子、硝酸盐、磷酸盐、生长素、脱落酸和赤霉素的监测，为营养物质和激素调控机制提供了重要见解12,13,14,15,16。

cpFLIPPi-5.3m 是一种基于 FRET 的 Pi 生物传感器，经优化用于监测植物细胞内的亚细胞 Pi 水平17。该生物传感器由一个来自蓝细菌的 Pi 结合蛋白构成，其两侧分别连接 FRET 供体（eCFP，增强型青色荧光蛋白）和 FRET 受体（cpVenus，一种改良型的 Venus 黄色荧光蛋白），在结合 Pi 后会发生构象变化。这一变化会改变依赖于 Pi 的 FRET 荧光信号，通过共聚焦成像捕获该信号，Pi 浓度升高会导致 FRET/供体比值下降。在图像后期处理中，通过比较受体和供体发射光的强度进行依赖于 Pi 的比率分析18。

在活体植物组织中进行定量比率荧光共振能量转移（FRET）分析时，需要对供体（CFP）和受体（cpVenus）荧光团的光谱渗漏和交叉激发进行校正18。光谱渗漏是指CFP的发射光信号被检测到FRET通道中，而交叉激发则是在激发CFP时同时激发了cpVenus。这些光谱伪影在不同细胞及亚细胞区域中可能有所差异，尤其是在具有色素的植物组织中更为显著，因而会干扰比率测量结果。为了获得经校正或敏化的FRET发射信号，需从原始FRET信号中减去光谱渗漏和交叉激发的贡献，具体如下：

敏化FRET发射 = 原始FRET发射 - 串色 - 交叉激发

通过成像单独表达CFP或cpVenus的植物来确定渗漏和交叉激发的校正因子，其细胞和亚细胞位置与生物传感器相同18。随后按如下方式计算敏化FRET发射：

致敏的FRET发射 = 原始FRET发射 - (CFP发射 × 串扰校正因子) - (cpVenus发射 × 激发交叉校正因子)

致敏的FRET发射与供体发射的比值（FRET比值）可反映配体浓度的相对变化，且不受生物传感器表达水平的影响19。

cpFLIPPi-5.3m 生物传感器已成功靶向定位于拟南芥（A. thaliana）及其他物种的不同亚细胞区室，实现了对无机磷（Pi）动态的可视化18,20,21,22。该生物传感器揭示了细胞质中Pi分布和组织间转运的异质性，并将叶绿体基质中Pi的波动与转运蛋白活性及光合作用性能关联起来20,21。由于该生物传感器仅在特定的动态范围内报告变化，因此解释结果时需确保该范围涵盖稳定成像条件下体内的Pi水平。in vivo 成像中光照不均或生物传感器丰度过低可能影响比率测量，因此强调需采用标准化的采集参数，并设置适当的阴性对照，例如对Pi不敏感的对照传感器20。当感兴趣区域（ROIs）之间的FRET比率变化极小时，回归分析可能不适用，建议合并各ROI的均值进行分析。

本文介绍了一种对拟南芥（A. thaliana）中cpFLIPPi-5.3m进行定量比率分析的详细实验方案，包括共聚焦成像、利用二值掩膜进行图像分割，以及通过FRET比率计算实现对活细胞中无机磷（Pi）动态变化的监测。该方法提供了一个可重复的分析FRET生物传感器信号的工作流程，采用线性回归对比率数据进行分析，并在不同实验条件下进行统计学比较。代表性数据来自表达cpFLIPPi-5.3m传感器的叶绿体Pi转运蛋白 突变体pht2;1，其叶绿体基质中Pi积累发生改变21,23。本实验方案通过详述生物传感器的光谱校正、成像参数设置及定量分析步骤，有助于研究人员将基于FRET的比率成像技术应用于其他实验系统。通过在特定实验条件下标准化图像采集和基于回归的分析流程，该方法支持在相同条件下分析的样本之间对FRET响应进行一致性的比较。该方法适用于需要检测活体植物组织中快速且区室特异性的分析物浓度变化的研究，包括代谢物运输或代谢途径发生改变的突变体或转基因株系。这一标准化方法将促进植物生物学中定量活细胞成像研究的可重复性。除本文所述的叶绿体定位Pi生物传感外，只要建立了针对特定生物传感器的校准和对照测量，该分析策略还可推广应用于其他基于FRET的生物传感器及特定生物组织。

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方案

注意：先前已构建表达 cpFLIPPi-5.3m 和 cpFLIPPi-null（细胞质和质体靶向变体）的拟南芥转基因株系17,18，pht2;1-1（CS19883）购自拟南芥生物资源中心，MS 培养基、盖玻片、全氟十氢萘、共聚焦显微镜及 40 倍油镜物镜（数值孔径 1.3）、激发激光器（CFP/445 nm 和 cpVenus/515 nm 或仪器适配的发射波长）、CFP、cpVenus/FRET 和 cpVenus 受体的发射滤光片、相机或检测器、图像分析工作站、FIJI24 以及 Excel。

1 . 样品制备

  1. 转基因动物的制备 A. thaliana 线条
    1. 克隆cpFLIPPi-5.3m生物传感器、Pi不敏感对照（cpFLIPPi-Null）、仅供体对照（CFP）以及仅受体对照（cpVenus）至植物表达载体中17.
    2. 用于稳定表达，进行转化 拟南芥 植物中的 sgs3-13 通过突变背景 Agrobacterium tumefaciens 花浸法，收获T1代种子，并在0.5x Murashige培养基上筛选转化子 & 含适当选择剂（如膦丝菌素，10 µg/mL）的Skoog（MS）琼脂平板
    3. 灭菌 A. thaliana 将表达生物传感器的种子浸入70%乙醇中1分钟，转移至50%次氯酸钠溶液中1分钟，然后用无菌水冲洗6–10次。
      警告：乙醇和次氯酸钠溶液（漂白剂）具有刺激性，操作时应佩戴适当的个人防护装备（PPE）。种子灭菌过程应在化学通风橱或通风良好的区域进行，以避免吸入挥发性气体；切勿将漂白剂与乙醇直接混合。废液应根据机构化学品安全指南进行处置。
    4. 将种子在4°C避光条件下进行2-3天的分层处理以同步萌发，随后将种子转移至含有0.25%蔗糖和目标Pi浓度（250 µM）的0.5x MS培养基（琼脂固化或液体形式）中，根据实验设计进行培养。若需筛选转化子，则在培养基中加入相应的筛选试剂。
    5. 将培养皿转移至设定为21°C、16小时光照：8小时黑暗光周期、光照强度120 µmol·m⁻²·s⁻¹、相对湿度约60%的可控生长室中。幼苗培养4–7天后用于根部成像，或转移至土壤中生长21天后用于叶片成像。
    6. 若测试不同Pi处理，将幼苗转移至目标Pi培养基（例如，Pi充足条件为250 µM Pi；Pi缺乏条件为10 µM Pi），并维持处理指定时间（例如，急性Pi缺乏处理48 h）。
    7. 若可能，使用荧光体视显微镜（7–10倍放大倍数），通过观察供体或受体荧光（低强度激发）来筛选表达传感器水平足够的植株。
    8. 在相同遗传背景下，评估表达cpFLIPPi-null的品系作为配体不敏感型对照。

2 . 共聚焦成像

  1. 对于根部，将幼苗连同其生长培养基或无菌水置于载玻片上，轻轻覆盖一小块盖玻片，使根部展平但不被压紧，立即进行成像。
  2. 对于叶片，切取目标叶片（例如21天龄植株的第3或第4片叶），将近轴面朝下放置于载玻片上。
  3. 如需去除空气间隙，可加入10–15 µL全氟十氢萘，并轻轻覆盖一小块玻璃压片以展平样品，立即进行成像。
  4. 选用适合活细胞成像的高数值孔径物镜（例如40× / 1.2–1.3 NA），所有样品使用同一物镜以保证可比性。
  5. 使用Metamorph软件设置激发和发射通道并采集图像（图1）。
    注意：采集供体（CFP）发射信号时，可采用约445 nm（或仪器适配的CFP谱线）激发，并收集供体发射光（例如470–500 nm带通滤光片）。例如，使用445 nm激光在70%功率（图1A）下，曝光时间为1000 ms（图1B）采集CFP发射信号。采集FRET信号（敏化受体发射）时，使用供体波长（445 nm）激发，并收集受体发射波段（例如530–560 nm）。采集直接受体通道时，使用受体激发波长（例如500–515 nm）激发，并收集与FRET检测相同的受体发射波段。
  6. 按顺序采集图像：依次采集供体激发/供体发射、供体激发/FRET发射，然后是受体激发/受体发射。每个视野的成像时间应尽量短，以减少光漂白（500–1000 ms）。
    ​注意：针对每个细胞定位（根细胞质、叶肉细胞质、叶绿体基质），需确定最佳激光功率、探测器增益和曝光时间（图1），使平均像素强度高于局部背景但低于探测器饱和水平。对于特定位置，供体激发相关的通道（供体和FRET）应保持完全相同的采集参数。成像参数取决于样品、显微镜、光源和检测系统，因此必须通过实验确定，并按照本方案所述，通过回归分析评估和记录可接受范围。本实验所用图像采集软件为Metamorph 7版本。
  7. 针对目标定位的所有图像，使用相同的探测器灵敏度（例如，此处使用2.4倍增益且偏移量为零）。若使用多个探测器，需表征每个探测器的光谱响应并予以记录。
  8. 为每种目标组织/基因型采集对照图像。
    1. 对未转化的野生型组织进行成像，以确定各通道的背景自发荧光水平。
    2. 在相同采集参数下，对表达仅含供体（CFP）或仅含受体（cpVenus）的植株进行成像，以获得光谱校正系数（串色和交叉激发）。需从多个个体（≥6–8个）采集图像，并涵盖不同发射强度范围。

3 . 图像处理

  1. 在 FIJI 或 ImageJ 等分析软件中打开供体通道（表示为 CC，对应供体激发/发射）、FRET 通道（表示为 CY，对应供体激发/受体发射）和受体通道（表示为 YY，对应受体激发/发射）的原始图像。（图 2）。
  2. 通过在使用相同成像参数拍摄的未转化植株中选取多个（5–10 个）相同位置的感兴趣区域（ROI）来确定每个通道的平均背景强度。将每个通道图像减去相应的平均背景值。
  3. 在 FIJI 中的操作步骤
    1. 点击 分析选项卡> 设定测量值 > 选择平均灰度值。通过选择特定 ROI 或整幅图像的平均值来测量背景强度。
    2. 点击 分析选项卡> 测量。将数值保存至 Excel 表格，并计算每个通道的平均背景值。对供体（CFP）图像进行阈值处理以定义生物传感器的空间边界（通常供体信号最弱）。将阈值化后的供体图像转换为二值掩膜（图 3 A）。
    3. 点击 图像选项卡> 调整> 阈值。
    4. 将打开阈值设置窗口。选择 最大熵 方法进行阈值分割。确定空间边界（本例中为叶绿体基质），并应用阈值。这将生成一幅黑白二值图像（图 3 B）。
    5. 点击 数学选项卡> 除法> 输入数值 255。图像将变为全白色。将此二值掩膜图像保存为 .tiff 文件。
    6. 将该二值掩膜与三个已减去背景的图像相乘，生成用于分析的掩膜图像（图 3C）。
    7. 在 FIJI 中打开二值掩膜文件。
    8. 点击 处理选项卡> 数学> 乘法。
    9. 选择二值掩膜图像和已减去背景的 CC 图像作为两个输入图像。
    10. 对 CY 和 YY 通道重复上述步骤。
    11. 在掩膜图像上根据所研究结构绘制适当的感兴趣区域（ROI）（如整个细胞、细胞质、叶绿体基质等）。对每个 ROI，提取供体、FRET 和直接受体通道的平均像素强度。保存 ROI 元数据（图像名称、坐标、实验条件、重复编号），用于后续统计分析。
    12. 打开 CC、CY 和 YY 图像。
    13. 点击 数学选项卡> 减法> 输入平均背景值。或者，也可在 Excel 中计算敏化 FRET 前进行此操作。
    14. 打开掩膜处理后的 CC 文件。
    15. 点击 处理选项卡 > 图像计算器。将 CC 与掩膜处理后的 CC 图像文件相乘。这将生成一个新的 32 位图像文件。
    16. 使用 FIJI 主工具栏中的适当工具绘制 ROI。例如，此处使用“椭圆”ROI 工具选择叶绿体基质。将 ROI 添加到 ROI 管理器（ctrl+T）。每个图像选择 5–10 个 ROI。勾选“显示全部”。这些 ROI 可保存为单独的元文件（图 3D）。请勿关闭 ROI 管理器。
    17. 点击 分析选项卡> 设定测量值> 选择平均灰度值。
    18. 点击 ROI 管理器中的“测量”按钮。
    19. 所选 ROI 的平均像素值将以列表形式出现在新窗口中。
    20. 将这些数据复制到 Excel 中。请勿关闭 ROI 管理器。
    21. 重复将掩膜处理后的 CC 文件与 CY 和 YY 图像相乘的操作，利用 ROI 管理器在各个独立通道中对相同 ROI 进行测量。将数值保存至 Excel。

4. 比值分析

  1. 打开 Microsoft Excel 以执行以下操作（图 4）。
  2. 校正系数的计算。
    1. 针对每个细胞定位，将仅含供体植株的 FRET 通道强度（Y 轴）对供体强度（X 轴）作图。拟合线性回归，其斜率即为供体渗漏系数（记为 a）。
    2. 将仅含受体植株的 FRET 通道强度（Y 轴）对直接受体强度（X 轴）作图，重复上述步骤。其斜率即为受体交叉激发系数（记为 b）。
    3. 使用来自多个植株的 ≥15–20 个 ROI 以获得稳健的系数。对于叶绿体基质，选择 50–60 个叶绿体。
  3. 计算每个 ROI 的敏化 FRET：
    敏化 FRET = 原始 FRET - (a × 供体) - (b × 受体)
    其中 a 和 b 为上述所得的定位特异性系数（图 4）。
  4. 将合并的 ROI 数据以敏化 FRET（Y 轴）对供体通道强度（X 轴）作图。拟合线性回归，Excel 将提供形如 y = mx + c 的拟合结果，其中 y 对应敏化 FRET 强度，x 对应供体强度，c 为 Y 轴截距，m 为回归斜率。记录拟合回归的 R² 值。通常 R² 范围为 0.8–1，表示拟合良好（图 4）。
  5. 对于细胞质和基质的测量，将 FRET/供体的斜率（敏化 FRET ÷ 供体）作为比值型读数，也称为 FRET 比值。
    ​注意：回归拟合的误差代表斜率的标准误差（在 Excel 中使用 LINEST 函数）。在所有样本和目标基因型中应一致地使用定位特异性选择。对来自多个 ROI 和独立植株的数据应用线性回归，可证实 FRET 比值与传感器丰度无关。
  6. 校准、对照及区分非特异性效应。
    1. 并行表达并以相同方式处理 cpFLIPPi-null（配体不敏感变体），以区分 FRET 比值中潜在的非特异性变化（如 pH、离子强度、光物理效应）与 Pi 特异性变化。
    2. 汇总 ROI 水平的数据，字段包括：基因型、区室、重复植株编号、ROI 编号、供体、受体、原始 FRET、敏化 FRET、拟合比值（如适用）。保留原始强度数据。
    3. 在群体比较中，使用回归所得斜率作为主要统计量；报告斜率 ± 标准误及相对误差百分比。
    4. 对回归导出的参数应用适当的推断统计方法（例如，Student t 检验或 ANOVA）。若数据分布不符合正态性，使用非参数检验。在适用情况下校正多重比较。
  7. 质量控制清单（在接受数据前确认）
    1. 确认每幅图像的三个通道均未超过探测器饱和水平，且信噪比足够高（> 背景的 2–10 倍）。
    2. 确认供体和受体单荧光蛋白对照在相同成像条件下获取，且能产生线性关系以推导校正系数 a 和 b。
    3. 确认图像配准准确，且掩模正确定义了含生物传感器的区域。
    4. 确认 cpFLIPPi-null 对照显示预期的无 Pi 敏感性。
  8. 代表性质量控制指标，用于辅助排除图像
    1. 饱和率：少于 1–2% 的像素达到 16 位图像的最大强度（65,535）。
    2. 背景水平：无细胞区域的平均强度范围约为 50–200 单位。
    3. 像素强度范围：平均强度显著高于背景但仍低于饱和水平（约 2,000–20,000 单位）。
    4. 信噪比（SNR）：数值应超过 2–10。

5. 两个回归斜率之间差异的统计检验

  1. 确定两条斜率（来自两种基因型或处理的回归导出的FRET比率斜率）是否存在显著差异25.
  2. 按如下方法计算检验统计量和自由度
    t-test formula for comparing means; statistical analysis equation; educational use.
    自由度 df = n1 + n2 - 4。m1 和 m2 对应线性回归的斜率， sb1 和 sb2 参考每条斜率的标准误（由 LINEST 或回归输出结果获得）以及 n1 和 n2 为样本量（用于拟合每条回归线的感兴趣区域数量）。
  3. 获取双尾 p 值 t 自由度为 df 时（例如，使用 t 分布表或在线计算器）26）。当使用在线计算器时（图5C），输入 sb1 和 sb2 和 n1 和 n2 在上一步中获得的结果用于计算 p 值和检验统计量。
  4. 若 p 值小于显著性水平，则拒绝零假设（斜率无显著差异）。 < α（例如，α = 0.05）。报告 b1，b2，sb1，sb2，t，df， 和 p.

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结果

共聚焦成像

利用共聚焦显微镜和 Metamorph 软件，分别采集了野生型（WT）和A.thaliana的pht2;1叶绿体无机磷转运蛋白突变体叶片组织中FRET供体和受体信号的独立通道图像（图2）。代表性图像清晰展示了磷酸盐生物传感器的亚细胞定位，叶绿体不仅在单个细胞内，而且在不同组织类型之间均易于分辨（图3）。这些图像证实了生物传感器的成功表达与靶向定位，并表明所获得的信号质量足以进行定量的比率分析。信噪比较低等质量不佳的图像被排除在外，突显了适当样品制备和成像参数设置的重要性。尽管在表皮细胞的叶绿体中也能观察到生物传感器的定位信号，但通过设定阈值并仅选择栅栏状叶肉细胞内的感兴趣区域（ROI），这些表皮信号在分析中被排除（图3D，插图）。

野生型与

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讨论

本方案提供了一种利用基于FRET的生物传感器对活细胞内代谢物或离子进行定量分析的标准化方法。其主要优势包括非侵入性的比率测量，以及适用于多种亚细胞区域17,20,21,22。通过使用二值掩模和线性回归分析，可提高测量的精确性和可重复性。尽管本研究以拟南芥（A. thaliana）亚细胞内的无机磷酸盐（Pi）为例进行演示，但该框架可适用于其他分析物、植物种类及实验条件。

实验方案中的关键步骤包括仔细的样品制备以确保生物传感器的表达，选择健康且自发荧光最小的组织，以及精确设置共聚焦成像参数以防止光漂白和探测器饱和。准确的感兴趣区域二值掩膜至关重要，因为误差会直接影响FRET比率计算和回归分析结果。还需正确采集仅含供体和仅含受体的对照样本图像，以计算光谱校正系数，并对串扰和交叉激发伪影进行后续校正。

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披露

作者声明本工作不存在利益冲突。

致谢

我们感谢W.K.V.实验室以往成员的贡献，他们的努力支持了本实验方案的开发。本研究获得了美国能源部科学办公室生物成像技术项目（DE-SC0014037）和基础能源科学项目（DE-FG02-04ER15559）的经费支持。A.S.R.部分受德克萨斯农工大学哈格勒高等研究所基金资助。&M 大学

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
40倍油浸物镜 Olympushttps://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4P用于成像的物镜 
盖玻片VWR48393-081用于样本放置的盖玻片
FIJI（ImageJ）开源2.9.0图像分析软件
倒置型奥林巴斯IX81显微镜Olympushttp://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdf共聚焦成像系统
iXon3 897 EMCCD 相机 Andor Technologyhttps://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897共聚焦成像系统的一部分
MetaMorph 软件 V7分子设备有限责任公司版本 7图像分析工作站
Microsoft Excel Microsoft 套件v16.68数据分析软件
穆拉希吉 & 斯科格（MS）培养基 沉箱MSP11-10LT植物生长培养基
全氟十氢萘（Acros Organic）Acros OrganicsP9900-25G成像培养基
草铵膦Sigma77182-82-2抗生素
植物生长培养箱Conviron自定义生长室
Yokogawa CSU-X1 转盘共聚焦成像系统横河https://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/共聚焦成像系统的一部分

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