基于行为学实验的MPTP诱导斑马鱼幼鱼帕金森病样行为表型分析

摘要

本方案建立了一种在MPTP处理的斑马鱼幼虫中进行行为表型分析的范式，用于评估类似帕金森病的运动和非运动功能缺陷。

摘要

本文介绍了一种独特的、多参数行为表型分析方案，用于研究MPTP诱导的斑马鱼幼鱼帕金森病（PD）。在斑马鱼中通过化学方法诱导类帕金森病病理，提供了一个高通量且遗传上易于操作的研究系统，然而大多数研究仅局限于基本的运动能力检测或简单的明暗转换实验。这类有限的方法无法全面捕捉与PD相关的广泛功能障碍，包括运动迟缓、感觉运动缺陷以及类似焦虑的行为和睡眠紊乱。为弥补这一空白，本研究开发了一套由6项互补实验组成的综合检测体系：运动能力测试用于评估总体运动和探索行为；趋壁性分析用于检测与焦虑相关的边缘偏好行为；惊跳反应测试用于记录运动迟缓和运动反应能力受损；明暗挑战实验用于评估冒险行为和应激反应性；光运动反应范式（包括频闪光刺激）用于量化感觉运动和反射性运动；以及睡眠-觉醒调控监测用于测量睡眠-觉醒行为。斑马鱼幼鱼从受精后第1天（dpf）至第5天持续暴露于亚致死浓度的MPTP中，并于4至6 dpf期间开始进行行为学评估。高分辨率自动化追踪系统为每项实验生成多个行为终点指标。该方法揭示了以往未被发现的类帕金森病改变，例如紊乱的睡眠结构、习惯化学习能力受损、感觉运动及反射性运动异常，反映了早期非运动症状。通过整合这些实验，研究人员可以获得更全面的行为症状谱，更真实地模拟人类帕金森病的复杂性。本方案拓展了研究帕金森病发病机制、筛选候选治疗药物以及探究环境调节因素的研究范式，体现了本系列致力于通过稳健、多维度的表型分析展示创新动物模型的目标。

引言

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是继阿尔茨海默病之后第二常见的神经退行性疾病¹。近年来，其患病率及受累人群数量持续上升，已成为全球重大的公共卫生挑战²。PD 的发病率随年龄增长显著升高^3,4。临床上，PD 的表现包括运动症状——如运动障碍、运动迟缓、静止性震颤和姿势不稳——以及多种非运动症状，包括认知功能障碍、焦虑和睡眠障碍⁵。目前，PD 的诊断主要依赖于运动症状的存在⁶；然而，当这些症状变得明显时，黑质中的多巴胺能神经元已丧失超过 60%⁷。尽管非运动症状常更早出现，但缺乏特异且客观的评估标准，使得早期诊断和干预变得复杂⁸。目前，PD 的主要治疗手段是给予左旋多巴⁹，该药物在脑内转化为多巴胺，从而补充纹状体中的多巴胺水平。虽然该治疗可暂时缓解症状，但并不能阻止疾病的进展¹⁰。因此，进一步开展 PD 发病机制研究和药物筛选至关重要。

建立合适的动物模型对于帕....

方案

本项涉及斑马鱼的研究严格遵循机构关于动物护理和使用的指导原则，并已获得山东大学药学院伦理委员会批准（编号：YXDW2025-0056）。所用试剂和设备列于材料表中。

1. MPTP 的制备

1. 通过将100× E3储存液与超纯水按1:100稀释来配制1× E3培养基（例如，将5 mL的100× E3与495 mL超纯水混合，得到500 mL的1× E3培养基）。
   注意：E3培养基需在使用当天新鲜配制。
2. 通过将5.0 mg MPTP粉末加入50 mL离心管中，并加入E3培养基至终体积为25 mL，配制1 mM MPTP储存液（可使用离心管作为混合容器，但无需离心）。将该溶液标记为1 mM MPTP储存液，并避光保存。
3. 配制50 µM MPTP溶液：取2.5 mL的1 mM MPTP储存液转移至洁净容器中，加入47.5 mL E3培养基稀释，最终体积为50 mL，终浓度为50 µM MPTP。剩余的储存液继续避光保存。
   警告：MPTP是一种强效神经毒素，操作时必须格外小心。务必穿戴适当的个人防护装备（PPE），包括手套、实验服和护目镜。MPTP废弃物应按照机构生物安全指南进行处理。

2. 斑马鱼胚胎的制备与分组

结果

睡眠-觉醒调节监测
52小时的睡眠-觉醒调节监测从受精后4天（4 dpf）开始，使用96孔板进行。与野生型（WT）组相比，MPTP处理组斑马鱼的睡眠结构表现出显著紊乱。图2展示了代表性的睡眠曲线、觉醒活动图谱及平均活动轨迹。斑马鱼幼鱼睡眠-觉醒调节分析的各项参数见图3。MPTP组的总睡眠时间较WT组显著增加（p < 0.01，Student's t检验）。MPTP组的睡眠片段数量较WT组减少（p < 0.001），而平均睡眠片段持续时间则显著延长（p < 0.0001）。两组间的睡眠潜伏期无显著差异。MPTP组的觉醒活动也受到显著影响（p < 0.01），平均活动水平降低（p < 0.01）。

光运动反应范式
在5 dpf时，采用96孔板光运动反应实验评估恒定光照和频闪光照条件下感觉运动门控功能。图4A

讨论

本研究建立并验证了一种全面的实验方案，用于评估和分析MPTP诱导的帕金森病样行为表型。该方案整合了6种不同的测试方法：运动能力评估、趋壁行为检测、惊吓反应测试、光运动反应范式（包括频闪光刺激）、明暗挑战实验以及睡眠-觉醒调节监测，以系统评价和描述帕金森病的运动与非运动功能缺陷。结果表明，与野生型（WT）组相比，经MPTP处理的斑马鱼幼鱼表现出运动和非运动相关的行为改变，包括活动减少、感觉运动反应受损以及睡眠-觉醒节律紊乱，这些均类似于帕金森病样症状。这些发现证明了斑马鱼模型的可靠性，以及该多行为测试方法在捕捉帕金森病样症状方面的可行性与实用性。

实验从1 dpf的斑马鱼胚胎制备开始。幼虫分别暴露于50 µM MPTP（MPTP处理组）或E3胚胎培养基（WT组），随后在4至6 dpf期间进行行为学评估。以下是各项测试的具体结果与解释：

睡眠-觉醒调节监测
从受精后第4天开始，使用96孔板对斑马鱼幼鱼持续监测52小时，以测量其睡眠-觉醒节律。结果显示，暴露于MPTP的幼鱼表现出紊乱的睡.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100× E3 储存液	上海飞兮生物科技有限公司	N/A	每升含 34.8 g NaCl、1.6 g KCl、5.8 g CaCl2·2H2O 和 9.78 g MgCl2·6H2O
12 孔细胞培养板	NEST 生物科技	712011	未经处理、无热原、无菌、聚苯乙烯材质。用于斑马鱼幼鱼行为学检测
24 孔细胞培养板	NEST 生物科技	702011	未经处理、无热原、无菌、聚苯乙烯材质。用于斑马鱼幼鱼行为学检测
3 mL 巴斯德吸管	Biologix	30-0238A1
6 孔细胞培养板	NEST 生物科技	703011	未经处理、无热原、无菌、聚苯乙烯材质。用于斑马鱼幼鱼行为学检测
96 孔细胞培养板	NEST 生物科技	701011	未经处理、无热原、无菌、聚苯乙烯材质。用于斑马鱼幼鱼行为学检测
MATLAB R2020a	MathWorks, USA	N/A	MATLAB R2020a，通过山东大学软件门户（softms.sdu.edu.cn）获取的校园范围许可证。用于斑马鱼幼鱼行为数据的统计分析。
Microsoft Excel	Microsoft	N/A	Microsoft Excel（Microsoft Office 组件之一），通过山东大学授权软件门户（softms.sdu.edu.cn）安装的版本。
MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）	Beyotime	41125281	5 mg
培养皿	NEST 生物科技	704202	100 mm，无菌，带易握手柄，TC 处理
次氯酸钠溶液	麦克林	S817439	市售漂白剂原液（有效氯含量 6–14%），稀释至 ≥10% v/v 用于表面和废弃物去污；也按 1:5（6% 漂白剂 : 水）稀释用于安乐死处理 MPTP 处理的斑马鱼幼鱼。
体视显微镜	Olympus	SZX2 系列
Zebrabox 高分辨率视频追踪系统	Viewpoint, France	N/A
Zebralab 软件	Viewpoint, France	N/A	版本 (3,52,3,87)