小鼠社交行为网络的双色多光纤光度记录

摘要

光纤光度法是记录深部脑区神经元群体钙活动最常用的技术之一。本文介绍了一种可在小鼠深部脑区神经元群体中进行可定制、多部位、双色成像的实验方案，用于检测钙活动及其他动态荧光信号。

摘要

光纤光度记录技术通过光纤导线对信号进行大规模记录，是记录自由活动啮齿类动物神经元群体钙活动的有效方法。尤其对于脑内位置更靠腹侧且难以接近的区域中，特定基因标记的小型神经元群体，该方法使靶向记录成为可实现的方案，因为目前在细胞分辨率水平上的记录仍具有挑战性。该技术可通过多光纤束方法扩展至同时记录多个位点，并可在每个记录位点利用遗传学策略靶向多种不同类型的细胞。本文提供了一种定制化多光纤阵列构建与植入的实验方案，用于靶向小鼠社会行为神经网络（最多可达12个位点）。本方案详细描述了使用定制化多光纤阵列精确靶向多个脑区所需的外科手术操作步骤，以及通过病毒载体递送绿色和红色荧光钙指示剂的策略，以实现每个位点上两种基因型特异性神经元群体的同步成像。我们展示了如何在社会行为过程中，使用市售的互补金属氧化物半导体（CMOS）相机系统对这些脑区进行记录。此外，本方案还介绍了质量控制方法，并详述了用于噪声校正与标准化的预处理流程。最后，我们讨论了该工具的一些潜在应用，以揭示关于大脑大规模神经网络的新发现。

引言

光纤光度法是一种通过光纤电缆大规模记录荧光信号的技术，已成为测量深部脑区神经群体活动的有力手段。这些脑区通常难以通过微型内窥镜或传统的电生理方法进行有效探测^1,2,3。当前系统神经科学的一个重要目标是识别并解析大规模、细胞类型特异性的脑网络在行为产生过程中所采用的计算机制。Neuropixel探针和商业化的多光纤插针在记录线性排列的神经元群体方面表现出色^4,5,6,7，而大视野皮层成像则能很好地覆盖浅层皮层动态活动^8,9。然而，对空间上分散但功能上相互连接的皮层下神经元群体进行同步记录，仍面临较大的技术挑战^5,10,11,12。尽管可通过多个单光纤插针实现对多个深部脑结构的同时靶向记录，但该方法受限于各神经元群体之间必须足够分离，以便植入多个插针¹²。定制化的多光纤光度阵列填补了这一技术空白，能够在对自由活动动物施加最小限制的条件下，实现对多个皮层下区域的同步记录，为研究复杂行为过程中网络层面的协调机制提供了独特视角。

社会行为网络（SBN）是研究大脑大规模网络动态的理想系统。SBN是一组高度互联且在进化上保守的皮层下结构，参与社会行为的产生，并已在所有脊椎动物类别中被识别^13,14,15。这些结构传统上包括但不限于侧隔核、视前区、终纹床核、前腹内侧下丘脑核、内侧杏仁核、伏隔核以及导水管周围灰质^13,14,15。在SBN中，由分子标记定义的特定神经元群体在调节社会行为方面发挥关键作用。SBN中的γ-氨基丁酸能（GABA能）神经元（以囊泡GABA转运蛋白VGAT的表达为标志）和谷氨酸能神经元（以囊泡谷氨酸转运蛋白VGlut的表达为标志）代表了该网络中的主要兴奋性和抑制性细胞类型，可能在社会行为调控中发挥不同的作用^16,17,18,19。除了这些经典的神经递质系统外，性激素信号在该网络功能中也起着关键作用。例如，许多雄性和雌性社会行为需要雌激素受体α的表达，而表达这些受体的SBN神经元的活动可直接驱动这些行为^{16,20,21,22,23,24,25,26}。此外，SBN神经元群体富含多种神经调质系统的配体和受体，包括多巴胺、精氨酸加压素、催产素、阿片类物质、速激肽、神经肽Y、催乳素、食欲素、刺鼠相关肽、黑皮质素、吻素（kisspeptin）以及促性腺激素释放激素^{17,18,19,27,28,29,30,31}，而近年来基因编码传感器技术的进步使得能够追踪这些多样信号分子中的许多成分^{32,33,34,35,36,37,38}。由于SBN神经元群体在皮层下结构中空间分布广泛，传统的实验方法（例如，细胞外电生理记录、皮层表面成像以及早期的多光纤光度法）无法捕捉这一大规模脑网络的实时活动动态。然而，通过同时监测基因定义神经元群体中的钙动力学以及神经调质释放模式，定制化的多部位光纤光度平台可以揭示哪些特定细胞类型和信号分子编码了社会行为的特定特征，从而提供新颖的机制性见解。

本文中，我们开发了一种可定制的多部位双色光纤光度平台，能够对自由活动小鼠的多达12个脑区进行同步记录。利用该方法，我们对分布在11个社会行为网络（SBN）脑区中的22个已鉴定神经元群体进行了双色光度钙活动记录，同时使用基于G蛋白偶联受体激活的多巴胺传感器（GRAB-DA1m）³³测量了伏隔核中的多巴胺波动（表1）。本实验方案（图1）详细描述了定制化多光纤阵列的构建、靶向多个深部脑区的手术操作、表达两种钙指示剂（GCaMP³⁹和RCaMP⁴⁰）的病毒递送策略、使用商用基于CMOS相机的光纤光度系统进行数据采集、质量控制方法，以及用于噪声校正和信号标准化的预处理流程。关键的是，我们的预处理流程整合了等吸收点控制波长记录，从而实现运动伪影校正。我们采用基于回归的方法⁴¹校正运动伪影，确保在爬跨或打斗等剧烈社交行为期间信号的真实性。由于我们定制的多光纤光度法能够在通过基因靶向维持记录细胞类型特异性的同时，同步监测邻近和远端深部脑结构中的分散性活动^42,43，因此相较于其他记录深部脑区大规模脑网络神经活动动态的方法具有显著优势。

本方案特别适用于在自由活动的动物中，对空间上分散的皮层下脑区（≥4个位点）进行同步记录的实验，尤其适合研究跨越基因定义细胞类型的网络水平动态，或在监测神经活动的同时追踪神经调质的释放。该方法在研究涉及剧烈运动的自然行为（例如社交互动）时尤为有价值，因为我们的运动伪影校正流程可确保信号保真度。然而，若研究人员需要单细胞分辨率、区分胞体与轴突信号，或记录浅层皮层区域，则可能发现其他方法（例如微型显微镜、Neuropixels或宽场成像）更为合适。主要的实践考量包括手术复杂性、定制多光纤阵列的制备需求，以及建立必要的材料基础设施（如3D打印能力和光纤工具）。

方案

注意：本方案使用 8–25 周龄的成年小鼠进行测试和验证。小鼠饲养环境为 21–26 °C，湿度 30%–70%，光照周期为 12 小时反转明暗循环（关灯：上午 10:00；开灯：晚上 10:00）。实验仅在主观活跃期（暗期）进行。食物和水自由供应。所有动物实验均经普林斯顿大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院标准。

1. 多光纤阵列与光纤跳线的制备（图1A）

1. 制备光纤跳线（图2A）。
   1. 获取一根12芯分支光纤跳线，并使用树脂（抗拉强度：8.7千磅/平方英寸[ksi]，弹性模量：377 ksi，热变形温度：138 °F，延伸率：8%）打印所提供的光纤跳线连接器及立体定位钻孔附件（补充文件1、补充文件2、补充文件3）。
   2. 使用直径为2英寸的不锈钢棒制作所提供的抛光夹具（补充文件4），并在夹具中心加工出与多光纤阵列尺寸相匹配的凹槽。
   3. 使用1.22 mm × 11 mm的钻头手动清除多光纤阵列销钉通孔中的多余树脂。即使采用高精度3D打印，销钉孔仍可能略小于销钉直径，导致销钉无法顺利穿过。
   4. 钻制光纤通孔。
      1. 将合金钢销钉（1.19 mm × 12.7 mm）插入立体定位钻孔附件的全部4个销钉孔中，并将光纤跳线连接器底面朝上放入立体定位钻孔附件，使销钉穿过多光纤阵列的销钉通孔。
      2. 拧紧M4尺寸的紧定螺钉至螺纹孔中，以固定光纤跳线连接器，并将立体定位钻孔附件固定在立体定位架上。
      3. 将0.25 mm × 5.5 mm的钻头插入立体定位钻机，并将其安装到立体定位架上。使用该钻头调整多光纤阵列的偏航、俯仰和滚动，使其最大偏差容差不超过±0.03 mm。
         注：在3D打印件最前部和最后部位置校准偏航和俯仰，在多光纤阵列的四个角校准滚动。
      4. 将钻头中心对准其中一个3D打印的光纤孔上方，并将立体定位架的X/Y坐标设置为对应脑区的ML（X）和AP（Y）坐标（表1）。将钻头移至立体定位架上的新(0, 0)坐标，使钻头中心对准前部销钉通孔上方。
      5. 使用0.25 mm × 5.5 mm的钻头，在立体定位定义的坐标处（表1）钻制每个光纤通孔，深度为5.5 mm。
         注：在将多光纤阵列从立体定位架上取下之前，使用一段较长的多余光纤检查所有孔是否已完全清通。这将减少因需重新校准和钻孔以清理通孔而重复操作的次数。
   5. 连接光纤跳线连接器与分支跳线
      1. 暴露光纤跳线光纤约>10 cm长度。使用光纤刻划刀修剪光纤，确保其长度一致。然后，在跳线的12根光纤上分别套入一段3/16”和5/16”的热缩管。
         注：当光纤被粘接到连接器后，热缩管可保护暴露的光纤部分。
      2. 将每根光纤插入光纤跳线连接器的一个通孔中，使光纤底面露出约0.3 mm。插入所有光纤后，使用21–27 G针头在光纤跳线连接器顶面涂抹瞬干胶，以固定光纤位置。
      3. 在光纤跳线连接器顶面涂上环氧树脂，形成高度为0.5–1 cm的锥形结构。确保环氧树脂仅覆盖光纤插入区域的顶面，不覆盖其他区域。在室温下静置过夜使其完全固化。
      4. 使用最低档位的热风枪加热热缩管，使其收缩并包裹住上方的环氧树脂及暴露的光纤（<3–5 cm）。
         注：操作时避免触碰热缩管，以防烫伤。
      5. 截取一段内径为3 mm的软塑料管，长度与剩余暴露的光纤一致，在管壁边缘切开一条缝隙，并将剩余暴露的光纤包裹于该管内。
      6. 使用不透明黑色记号笔为透明管着色，确保光纤不再可见，从而在成像实验中最小化暴露光纤产生的照明干扰。
   6. 抛光光纤跳线。
      1. 将光纤跳线连接器底面朝下固定在定制抛光夹具中。依次使用6 µm、3 µm、1 µm和0.01 µm粒度的抛光片进行抛光，每次抛光动作约10–20次，呈无穷符号（∞）轨迹。在使用1 µm和0.01 µm粒度抛光片前，先滴加5滴去离子水。
      2. 擦拭连接器表面以去除多余的去离子水。使用明场显微镜检查光纤跳线连接器抛光面是否存在瑕疵或裂纹，如有则需重复抛光步骤。
   7. 检测光纤跳线输出。
      1. 将光纤跳线的SMA（Sub-miniature version A）连接器端接入基于CMOS相机的光纤光度成像系统。使用可视化编程软件，按照光度成像系统的操作手册，将CMOS相机对焦于跳线的SMA端。
         注：该手册会定期更新以适配软件升级。由于光度系统所用的可视化代码常随新软件版本发布而变化，因此本手册提供的是当前软件版本的最新信息。
      2. 使用光功率计测量跳线在20%功率下的470 nm输出。若跳线输出<2.5 mW，则重复步骤1.1.7。
2. 制备多光纤阵列。
   1. 使用符合步骤1.1.1所述技术参数的树脂打印所提供的多光纤阵列（补充文件5、补充文件6）。
   2. 准备多光纤阵列。
      1. 将M0.6黄铜六角螺母插入多光纤阵列侧角的四个槽口中，并将六角螺母的孔对准开口中心。
      2. 使用21–27 G针头从每个六角螺母槽口侧面滴加一滴瞬干胶，必要时可额外添加以增强固定效果。胶水在室温下干燥5分钟后，再进行下一步操作。
      3. 使用剃刀片刮除多光纤阵列侧面多余的胶水，确保其能顺利装入抛光夹具。
      4. 若瞬干胶残留在多光纤阵列表面，使用定制抛光夹具和30 µm粒度抛光片进行抛光，直至去除胶水并使阵列表面平整。
      5. 使用1.22 mm钻头手动清除多光纤阵列销钉通孔中的多余树脂。
   3. 钻制光纤通孔（图2B-C）。
      1. 将合金钢销钉（1.19 mm × 12.7 mm）插入立体定位钻孔附件的全部4个销钉孔中，并将多光纤阵列表面（平面）朝上放入立体定位钻孔附件，使销钉穿过阵列的销钉通孔。
      2. 重复步骤1.4.2至步骤1.4.5。
   4. 准备用于多光纤阵列的光纤。
      1. 使用光纤剥线钳剥离一段200 µm、数值孔径0.39的光纤塑料护套。用乙醇清洁光纤。
      2. 使用光纤切割器将光纤切割成约3–5 cm长的段落，再使用光纤刻划刀将其进一步切成两半。使用明场显微镜检查，确保至少一端无缺口或瑕疵。仅使用至少一端完好的光纤。
      3. 在明场显微镜下放置一段长度至少为15 mm的精密标尺。将光纤无瑕疵端对准标尺的0 mm位置（图2D）。根据各目标区域要求裁剪光纤至所需长度（表1）。
         注：光纤长度计算方法为：将最深光纤对应的立体定位D/V坐标加6 mm，再根据其他光纤与最深光纤之间的D/V坐标差值调整各光纤长度。
   5. 将光纤插入多光纤阵列。
      1. 将多光纤阵列表面朝下放入制作夹具中，并使用销钉对齐并固定。
      2. 根据光纤长度对应目标位点（表1），将切割好的光纤插入多光纤阵列相应的通孔中，确保无瑕疵端朝上。在进行下一步前，确认所有光纤均已完全插入。
      3. 使用21–27 G针头涂抹瞬干胶，将所有光纤固定到位。在室温下静置至少30分钟，待胶水完全干燥后再继续操作。
   6. 重复步骤1.1.6，对多光纤阵列进行抛光，抛光时阵列表面朝下（图2E）。
   7. 检测多光纤阵列效率。
      1. 用乙醇清洁多光纤阵列的抛光面，然后涂抹折射率匹配凝胶。将4根销钉插入光纤跳线连接器，并使用G5驱动螺丝及配套螺丝刀将多光纤阵列固定于连接器上（图2F）。
      2. 使用光功率计测量多光纤阵列发出的470 nm和560 nm LED光输出。使用以下公式计算效率：
         
      3. 若效率<75%，则重复步骤1.2.7.1–1.2.7.2。
         注：若重新抛光后效率仍未提升且光纤表面无瑕疵，则可能是多光纤阵列上的光纤与跳线连接器未对准。
   8. 准备多光纤阵列以供使用（图2G）。
      1. 将4根销钉插入多光纤阵列的通孔中。确保销钉从阵列脑侧伸出长度不超过1 mm。
      2. 在销钉的脑侧涂抹瞬干胶。在室温下干燥至少10分钟后，方可使用多光纤阵列。

2. 手术（图1B）

1. 准备手术空间和器械。
   1. 清洁立体定位仪，确保工作区域无菌。
   2. 获取无菌可吸收缝合线。
   3. 将一对精细镊子、精细剪刀和两个血管夹进行高压灭菌。
   4. 确保异氟烷挥发罐已加满异氟烷。确认异氟烷、真空和氧气管路的管道已牢固连接至挥发罐、诱导室和立体定位仪的鼻罩。
2. 获取 jRCaMP1b、GCaMP6f 和 GRAB-DA1m 腺相关病毒。
   注意：操作病毒时务必穿戴个人防护装备。
   1. 如有必要，将病毒稀释至工作浓度为 1×10¹³ 至 4×10¹³ 个颗粒/毫升。
   2. 制备 jRCaMP1b 与 GCaMP6f 腺相关病毒的 1:1 混合液。
   3. 将一份 1:1 的 jRCaMP1b:GCaMP6f 病毒混合液和一份 GRAB-DA1m 病毒分装样品置于冰上，保持温度在 4 °C。
3. 诱导麻醉。
   1. 将小鼠放入诱导室并关闭室门。以 1 L/min 的流速向挥发罐通入氧气。
   2. 将气体导入诱导室，并打开真空管路以清除室内多余气体。将挥发罐设置为异氟烷浓度 3%–5%。
4. 将小鼠转移至立体定位仪。
   1. 当小鼠呼吸减慢至每秒 1 次时，将其移至立体定位仪上。将小鼠的前门齿钩入鼻罩口件的凹槽中，并拧紧鼻罩覆盖其鼻部。
   2. 将气体切换至立体定位仪，异氟烷浓度设为 1%–2%，以维持麻醉状态。切换真空管路以清除鼻罩内的气体。
      ​注意：在整个手术过程中监测小鼠呼吸，并根据需要调整异氟烷浓度，以维持深度麻醉（呼吸频率为每秒 1 次）。应通过定期检查小鼠对脚趾夹捏无反应来确认其处于深度麻醉状态。
   3. 设置加热系统以维持小鼠体温在 35 °C，并在其眼睛上涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。
   4. 插入立体定位耳棒，使其轻压颅骨两侧，位置略偏耳道的背侧和前侧。拧紧耳棒，并通过轻轻按压小鼠头部顶部确认颅骨已固定。
5. 准备头皮切口。
   1. 修剪或剃除小鼠头顶的毛发，直至毛发变短。在小鼠头顶涂抹脱毛凝胶，静置约 1 分钟。用干净的棉签清除残留凝胶。
   2. 根据需要重复步骤 2.5.1，直至头顶所有毛发均被去除。
   3. 使用棉签依次涂抹碘伏（10% 聚维酮碘溶液）和 70% 乙醇溶液，对头部皮肤进行消毒。
6. 暴露颅骨。
   1. 沿颅骨中线做切口，从略位于人字缝后方延伸至略位于嗅周嗅静脉前方。
      注意：嗅周嗅静脉是位于大脑背侧表面、嗅球与前额叶皮层之间的血管。
   2. 剪除并移除切口周围已剃除毛发的皮肤，形成泪滴状切口，暴露顶骨、顶间骨的前缘以及位于嗅周嗅静脉前方的鼻骨部分（图 2H）。
   3. 用 0.9% 生理盐水溶液和干净棉签轻轻清洁颅骨表面。
7. 调平颅骨。
   1. 定位嗅周嗅静脉与矢状缝交汇处。用无菌手术刀片标记该点。
   2. 将 #92 碳化钻头装入立体定位钻机，并将钻机安装在立体定位仪上。使用立体定位操纵器将钻头尖端定位在标记点处的颅骨表面，并将钻机的 X、Y 和 Z 坐标归零。
   3. 通过测量标记点及其后方 -8.25 mm 处的 Z 深度来调平颅骨俯仰角；通过测量标记点与后方 -8.25 mm 位置之间的横向距离来调平偏航角；通过测量相对于标记点在 -2.0、-4.5 和 -7.0 mm 位置处距中线 ±2.0–2.5 mm 范围内的 Z 深度来调平滚转角。
8. 进行颅骨开窗和硬脑膜切开。
   1. 更换钻头为 #76 或 #78 碳化钻头。在矢状缝、嗅周嗅静脉与颅骨表面交界处的标记点重新将钻头归零。
   2. 将钻头移至各脑区的前后（A/P）和内外（M/L）坐标（表 1）。在每个位点钻出颅骨开窗，并使用 27G 或更小的空注射器针头小心移除各开窗处的硬脑膜。
9. 注射病毒。
   1. 拉制玻璃微电极，使其尖端至少有 7 mm 的锥形部分，尖端开口为 10–30 µm。
      注意：若在后续任一步骤后微电极内出现气泡，则需重新开始步骤 2.9.2–2.9.12。
   2. 用矿物油反向填充空的玻璃微电极尖端。将微电极插入并固定于纳升注射仪中。使用纳升注射仪界面尽可能排出微电极中的矿物油。
   3. 将纳升注射仪安装到立体定位仪上。剪下一小块石蜡膜并放置于小鼠头部。
   4. 吸取 1 µL 的 jRCaMP1b:GCaMP6f 病毒混合液滴加到石蜡膜上。降低纳升注射仪的尖端，使玻璃微电极浸入病毒混合液中，并通过注射仪界面反向填充病毒至微电极内。
   5. 重复步骤 2.9.4，直至所有待用病毒均转移至纳升注射仪中（表 1）。取出石蜡膜并丢弃至生物危害废物容器中。
   6. 在矢状缝、嗅周嗅静脉与颅骨表面交界处的标记点，将注射仪微电极尖端归零。
   7. 从最腹侧至最背侧的注射位点依次进行（表 1），将微电极尖端移至每个位点，降低至接触脑表面，并在立体定位仪上将 Z 坐标归零。
   8. 在每个位点，将微电极尖端插入脑组织，直至其位于注射位点腹侧 0.1 mm 处，然后将微电极上提 0.1 mm 至最终注射位置。让周围组织在微电极周围稳定 30 秒。
   9. 使用纳升注射仪界面，以 1–2 nL/s 的速率在当前注射位点注入 300 nL 的 1:1 jRCaMP1b:GCaMP6f 病毒混合液，使混合液在该位点充分扩散。
   10. 注射完成后，让微电极尖端在注射位点停留至少 5 分钟。缓慢将微电极从脑组织中提起，以减少病毒沿注射轨迹向背侧扩散的风险。
   11. 在所有位点完成 1:1 jRCaMP1b:GCaMP6f 病毒混合液注射后，使用纳升注射仪界面将注射器活塞复位至初始位置。取下微电极并丢弃至生物危害锐器废物容器中。
   12. 如有必要，针对表达 GRAB-DA1m 的每个目标脑区重复步骤 2.9.2–2.9.11。在每个目标位点注射 150 nL，而非用于病毒混合液的 300 nL。
10. 植入多光纤阵列。
    1. 使用可将多光纤阵列通过销钉固定的任意附件，将其牢固固定在立体定位仪上，确保植入过程中保持稳定（图 2I）。
    2. 调整多光纤阵列的位置，使每根光纤与相应颅骨开窗的中心对齐，且最长光纤末端位于脑表面。在此位置将立体定位操纵器归零，并缓慢降低多光纤阵列，使其位于最深病毒注射位点的 D/V 位置上方 0.25 mm 处（表1，图 2J）。
    3. 将一个冷混合皿置于冰上，加入 1 勺水泥粉、4 滴液体基质和 1 滴催化剂，混合 20 秒。
       注意：每次使用液态水泥且需要补充时，均需重复此步骤。
    4. 使用注射器和 23–31 G 针头将液态水泥注入多光纤阵列与颅骨之间的空隙。
    5. 使用细塑料涂布器或注射器针头将液态水泥完全覆盖多光纤阵列的四个侧面，从颅骨向上形成类似金字塔的结构（图 2K）。让水泥至少干燥 15 分钟。
    6. 沿切口缝合皮肤，确保无颅骨暴露。
11. 让小鼠恢复。
    1. 将异氟烷浓度降至 0。
    2. 将小鼠从立体定位仪转移至加热垫，待其清醒并能自主活动后，再将其转移回笼中。
    3. 让小鼠至少恢复两周后再开始实验。

3. 多位点双色钙成像（图1C）

1. 配置数据采集设备（DAQ）。
   1. 使用电线将 GND 连接到 Ch7 端口上方的 AGND 端口。
   2. 使用电线将 DIO0 连接到 DAQ 的 Ch0 端口。
2. 将光度测量系统连接至 DAQ。
   1. 将一分二 BNC 电缆（一端为 BNC 接头，另一端为红色和黑色电线）的 BNC 接头端连接到光度测量系统的输入端口；将另一根一分二 BNC 电缆的 BNC 接头端连接到光度测量系统的输出端口。
   2. 取连接至光度测量系统输入端口的一分二 BNC 电缆，将其红色电线端连接至 DAQ 的 DIO1 端口；取连接至光度测量系统输出端口的一分二 BNC 电缆，将其红色电线端连接至 DAQ 的 Ch1 端口。
   3. 将两根一分二 BNC 电缆的黑色接地线均连接至 DAQ 的 GND 端口。
3. 同步行为学与光度测量摄像机。
   1. 将多个行为学摄像机串联，以实现从多个角度同步记录行为。
      1. 使用一个 3.3 KΩ 电阻，将主行为学摄像机的光隔离输出端（第 4 脚，白色电线）连接至次级摄像机的非隔离输入端（第 1 脚，绿色电线）；将主摄像机的 3.3 V 输出端（第 3 脚，红色电线）连接至同一 3.3 KΩ 电阻，并连接至 DAQ 的 Ch2 端口。
      2. 使用 3.3 KΩ 电阻，将每个次级摄像机的光隔离输出端连接至其自身的 3.3 V 输出端。
      3. 将主摄像机的地线（第 6 脚，棕色电线）连接至每个次级摄像机的地线；将所有摄像机的地线连接至 Ch2 端口上方的 DAQ AGND 端口以及光度测量系统的输出地线。
4. 使用配套成像软件配置行为学摄像机设置。
   1. 将“采集帧率”设置为 45 Hz，增益设置为 1。
   2. 将曝光时间设置为 2998 µs，曝光下限设置为 100 µs，曝光上限设置为 150000 µs。
      注： “采集帧率”可能并非实际捕获的帧率。根据曝光时间和所需数据带宽，该值可能需要设置得高于最终成像频率。如有必要，调整“采集帧率”，使显示的“实际帧率”为 40 Hz。
5. 配置 DAQ 软件（补充文件 7）。
   1. 在 DAQ 软件中，将 DAQ 添加为“设备”，并切换至“配置面板”。
   2. 在“通道”选项卡下的“模拟输入”部分，激活通道 0–2；在“数字”部分，激活通道 0。
      注：Ch0 对应晶体管-晶体管逻辑（TTL）信号，Ch1 对应光度测量系统，Ch2 对应串联连接的摄像机。
   3. 在“模拟输入”部分，将通道 0 命名为“TTL”，通道 1 命名为“Photometry_system”，通道 2 命名为“Behavior_cameras”，其中“TTL”代表“晶体管-晶体管逻辑”。在“数字”部分，将通道 0 命名为“TTL_trigger”。
   4. 在“触发”选项卡中，将触发模式设为手动；在“采样率”选项卡中，将采样率设置为 350 Hz。
   5. 切换至“显示面板”，并将“Strip”、“Scalar”和“Output”窗口添加至图形用户界面。
6. 配置光度测量系统软件（补充文件 8）。
   1. 在可视化编程软件中建立工作流程，以接收 5 V TTL 脉冲来触发记录，并保存每一帧的时间戳、每根光纤红绿通道的荧光发射信号以及原始视频，具体操作详见光度测量系统手册。
   2. 在工作流程中使用光度测量系统的节点，确保系统设置为以 120 Hz 交替记录 560 nm、470 nm 和 415 nm LED 的帧，从而实现 40 Hz 的功能性帧率。
      注：这种时分复用（TDM）方法通过在时间上分离 GCaMP 和 RCaMP 的激发，解决了两者之间的光谱重叠问题，确保每个指示剂在连续帧中独立激发。本研究所采用的记录系统配备了优化的带通发射滤光片（绿色通道：500–530 nm；红色通道：>580 nm 长通），进一步限制了检测到的光子波长，使其主要来自各指示剂的发射波段，从而最小化光谱串扰。415 nm 等吸收波长对 GCaMP 和 RCaMP 的激发程度相同，但产生的钙依赖性荧光变化极小，因此可提供用于运动伪影校正的对照信号。结合 TDM 激发与光谱滤波，470 nm 帧主要捕获 GCaMP 活性（图 3A），560 nm 帧主要捕获 RCaMP 活性（图 3B），而 415 nm 帧则提供钙离子无关的参考信号，用于运动校正。
7. 进行 in vivo 光度测量记录。
   1. 获取已完成病毒注射和多光纤阵列植入的小鼠，具体操作见步骤 2。
   2. 使用乙醇和棉签清洁光纤跳线和植入式多光纤阵列的连接面。在可视化编程工作流程中使用光度测量系统节点，并结合光度计，将 415 nm、470 nm 和 560 nm LED 的功率水平调节至光纤跳线输出约 1.2 mW 的光照强度。
   3. 在光纤跳线的连接面上涂抹折射率匹配凝胶。将光纤跳线与小鼠植入的多光纤阵列上的定位销对齐，并滑动光纤跳线直至其表面与多光纤阵列表面齐平。
   4. 拧紧光纤跳线的固定螺丝，以将多光纤阵列牢固固定于光纤跳线中。让小鼠适应环境后再开始实验（图 2L–M）。
   5. 设置文件名。
      1. 对每台行为学摄像机，在行为学摄像机记录软件中点击红色圆形“录制”按钮，打开其录制窗口并指定文件名。
      2. 打开 DAQ 软件程序，点击齿轮按钮，进入“日志选项”，并指定文件名。
      3. 点击光度测量系统可视化编程工作流程中的“PhotometryWriter”节点，以指定文件名。
   6. 在行为学摄像机软件的录制窗口中，点击“开始录制”以启动各摄像机；随后，在光度测量系统的可视化编程工作流程中点击播放按钮，并在 DAQ 软件中点击录制按钮。
   7. 点击 TTL 开关，以在所有摄像机上同步开始记录。
   8. 结束记录。
      1. 点击 TTL 开关以结束摄像机的同步录制
      2. 在光度测量系统的可视化编程工作流程中点击停止按钮，在行为学摄像机软件的录制窗口中点击“停止录制”。
   9. 重复步骤 3.7.5–3.7.8，直至实验结束，然后断开小鼠连接。
      注：实验结束后，可使用 DAQ 软件的输出数据，通过自定义代码对光度测量和行为学摄像机的数据流进行对齐。具体而言：（1）TTL 电压的变化指示 TTL 开始和结束的时间；（2）行为学摄像机电压的变化指示摄像机快门开启和关闭以捕获每帧行为视频的时间；（3）DAQ 记录的光度测量系统电压的初始变化可与 TTL 起始时间以及可视化编程软件输出的光度测量摄像机时间戳进行比对，从而确定光度测量摄像机的时间戳。

4. 数据处理（图1D，补充文件9）

1. 预处理钙成像数据。
   1. 对钙成像数据的帧进行去交错处理，以生成分别对应于415 nm、470 nm和560 nm LED刺激响应的独立信号流。
   2. 使用自适应迭代重加权惩罚最小二乘算法（airPLS）⁴⁴ 校正基线漂移。
   3. 使用以下公式计算 ΔF/F：
      
      注意：基线期应选择在实验干预前的一段稳定时期（例如，在引入社交伙伴之前）。如果基线期过短（<2–3 分钟）或存在较大波动，可能受到运动伪影污染，则可考虑使用整个记录时段的平均荧光信号进行归一化，而非限定于较短的基线期。
2. 校正运动伪影（图 4A）。
   1. 采用基于回归的方法，尽管其他替代方法也可适用（见 表 2）。
   2. 使用中位数对 ΔF/F 信号进行Z分数标准化，以归一化不同脑区间的信号幅度：
      
   3. 应用带有L1正则化的Lasso回归。Lasso（最小绝对收缩与选择算子）通过将无信息性预测变量的系数向零收缩，实现自动特征选择。
      1. 在正则化参数范围内进行网格搜索（α = 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1, 10, 100）。网格搜索用于确定模型复杂度与过拟合之间的最佳平衡。此步骤可利用标准机器学习库中提供的交叉验证程序（如Python中的scikit-learn）完全自动化完成。
      2. 对于双色光度法（我们推荐的方法），使用12个记录区域中所有可用的415 nm等吸收波长对照通道作为预测变量（参见 图 4B–C 及 结果 部分的原理说明）。对于单色光度法（仅GCaMP或仅RCaMP），则将预测矩阵限制为仅使用与待校正钙信号来自同一光纤的等吸收波长信号。
      3. 选择预测信号与观测信号之间均方误差最小的模型。
   4. 从原始信号中减去预测的运动成分，得到校正后的神经活动信号。
3. 使用窗口宽度为725 ms的Savitzky-Golay滤波器对信号进行平滑处理。

结果

为同时记录多达12个SBN脑区的活动，我们根据上述方案构建了一种可定制的多光纤阵列。小鼠术后恢复后，在其进行社交互动期间进行记录（图5）。在所有实验中，允许雄性CD1实验小鼠与其家笼中的雄性Balb/c小鼠进行互动。我们使用了 Vgat-Cre 小鼠以表达 jRCaMP1b⁴⁰ 在11个SBN脑区的GABA能神经元中以Cre依赖的方式表达GCaMP6f³⁹ 以非GABA能细胞中排除Cre的方式⁴⁵ 在相同的脑区，以及 GRAB-DA1m³³ 在伏隔核中⁴² (表1组织学上对纤维投射的确认可参见我们之前发表的文献。^42,43在此，我们旨在检验不同运动伪影校正方法的性能。具体而言，我们比较了以下方法的有效性：（1）仅使用中值滤波；（2）仅使用同光纤等吸收信号（单预测因子方法）进行L1正则化的Lasso回归¹¹ 以及（3）使用所有光纤的等吸收点信号作为预测变量的Lasso回归（多预测变量方法）^41,42 (图 4A关键在于，基于Lasso的方法利用等吸收波长（415 nm）LED激发产生的与活动无关的荧光信号来校正原始信号，而中值滤波平滑则未考虑与活动无关的信号。

我们采用两种不同指标评估运动校正效果：绝对高频噪声和抖动。高频噪声定义为信号一阶导数的标准差，反映快速信号波动的幅度。抖动定义为信号导数的变异系数，反映相对于信号导数均值的帧间信号变异性。我们发现，基于Lasso的两种方法（单预测因子和多预测因子）在降低高频噪声和抖动方面均显著优于中值滤波，其中多预测因子校正略优于单预测因子校正（图4C–D；高频噪声，共18个记录会话中的23个信号，n=414：Kruskal-Wallis检验，H = 501.9420，p < 0.001；事后Mann-Whitney U检验，Bonferroni校正：平滑处理 vs 单位点回归 ***p < 0.001，平滑处理 vs 多位点回归 ***p < 0.001，单位点 vs 多位点 **p = 0.0073；抖动：Kruskal-Wallis检验，H = 495.6685，p < 0.001；事后Mann-Whitney U检验，Bonferroni校正：平滑处理 vs 单位点回归 ***p < 0.001，平滑处理 vs 多位点回归 ***p < 0.001，单位点 vs 多位点 ***p = 0.0006）。具体而言，多预测因子方法（使用所有光纤等吸收点）在红通道（RCaMP）信号中表现出优势：在12个红通道信号中，有5个在残余噪声方面显著低于单预测因子校正（n = 18个记录/脑区）。在抖动方面，BNST（t检验，t = 5.42，***p < 0.001）、POA（t检验，t = 2.68，*p = 0.011）、AH（t检验，t = 2.66，*p = 0.012）和PAG（Mann-Whitney U检验，U = 279，***p < 0.001）显示出多预测因子方法的优越性。在高频噪声方面，BNST（Mann-Whitney U检验，U = 285，***p < 0.001）、POA（Mann-Whitney U检验，U = 292，***p < 0.001）、AH（t检验，t = 7.10，***p < 0.001）、PAG（t检验，t = 13.72，***p < 0.001）和LHb（t检验，t = 5.47，***p < 0.001）显示出多预测因子方法的优越性。绿通道（GCaMP）信号在所有12个脑区中，两种Lasso方法在抖动和高频噪声指标上均无显著差异（所有p>0.05，完整统计检验列表见表3）。这表明，在双色光度测量中，引入跨通道等吸收点信息可改善红通道信号的运动校正，可能是因为绿通道等吸收点提供了更干净的运动信息。这些数据表明，基于等吸收点回归的运动伪影校正方法显著优于简单的滤波方法，而多通道回归在双色记录中具有特定优势。

图1．使用多通道双色光纤光度法记录社会行为网络。 (A) 构建多光纤阵列的示意图。(B) 手术流程示意图。(C) 双色钙成像实验示意图。(D) 使用等吸收点信号计算运动校正后信号的示例。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2．制作与手术关键步骤的图像。（A） 制作完成的光纤跳线，准备用于记录。（B） 多光纤阵列置于定制的立体定位夹具中，0.25 mm × 5.5 mm 钻头位于光纤通孔上方。（C） 多光纤阵列的所有光纤通孔均已清理，六角螺母已用胶固定。（D） 使用光纤刻划刀切割光纤。（E） 所有光纤已用瞬干胶固定，并安装至定制的抛光托盘上。（F） 放大图示如何对齐并拧紧光纤跳线连接器至多光纤阵列。（G） 完全组装好的多光纤阵列，定位销已用胶固定到位。（H） 小鼠固定于立体定位仪框架上，头皮已切开以暴露颅骨。（I） 制作完成的多光纤阵列连接至立体定位操纵器，以便在手术过程中操控多光纤阵列。（J） 多光纤阵列被缓慢插入脑组织的放大视图。（K） 多光纤阵列已完全插入并用牙科水泥固定于颅骨上。（L） 多光纤阵列已牢固连接至动物体，并在记录前与光纤跳线可靠连接。（M） 动物在笼中时的远距离视图，光纤跳线在记录前和/或记录期间保持连接。请点击此处查看该图的放大版本。

图3光谱分离 钙指示剂间光谱串扰极小的示例信号。GCaMP6f（蓝色）信号在470 nm激发下表现出显著激活，而在560 nm激发下响应可忽略不计。jRCaMP1b（红色）信号则呈现相反模式，在560 nm激发下强烈激活，但在470 nm照射下响应极弱。 （A） 同步记录 仅使用470 nm光照下的GCaMP6f和jRCaMP1b信号。B）与（a）相同，但仅使用 560 nm 照明。 请点击此处以查看此图的放大版本。

图 4．多光纤信号处理不同方法的比较。（A） 基于多部位回归的光度信号校正示意图。该方法包括一系列处理步骤，其中所有可用的415 nm等吸收点信号被线性映射到每个钙依赖性信号上。从该信号中减去预测的运动成分，以生成最终的活动读数。来自两个具有明显运动伪影信号的z分数标准化ΔF/F信号。（B） 从上到下：显示运动伪影的同一光纤/成像通道的等吸收点信号、仅经平滑处理的RCaMP（左侧）或GCaMP（右侧）信号（中值滤波，绿色）、同一光纤/成像通道经单光纤回归校正后的信号（青色）、多光纤回归校正后的信号（蓝色）。（C）左侧：每个记录信号的高频噪声评分均值（n = 21次记录）。高频噪声计算为各信号一阶导数的标准差。图中展示了以下四种情况的噪声评分：1）基线校正但未经其他校正的原始信号（灰色），2）基线校正并经中值滤波的信号（粉红色），3）经基线校正和单光纤回归校正并结合Savitsky-Golay平滑的信号（青色），以及4）经基线校正和多光纤回归校正并结合Savitsky-Golay平滑的信号（蓝色）。中间：仅使用平滑、单光纤回归或多光纤回归方法去除噪声的平均百分比，汇总自全部23个信号。去除噪声的百分比定义为校正后高频噪声相对于原始基线校正信号总噪声水平的减少比例。数据以均值±标准误（SEM）表示（Kruskal-Wallis检验，H = 501.9420，p < 0.001；事后Mann-Whitney U检验，采用Bonferroni校正：平滑 vs 单部位回归 ***p < 0.001，平滑 vs 多部位回归 ***p < 0.001，单部位 vs 多部位 **p = 0.0073）。右侧：在单光纤与多光纤回归校正后，高频噪声在统计学上存在显著差异的信号所占百分比，按信号类型分类。对于23个信号中的每一个，使用独立样本t检验（若数据呈正态分布）或Mann-Whitney U检验（非参数替代方法）比较单部位校正与多部位校正后的噪声水平。蓝色段表示多部位校正显著降低噪声的信号（p < 0.05）；灰色段表示两种校正方法之间无显著差异的信号；青色段表示单部位校正显著降低噪声的信号。E：Vgat- GCaMP6f。DA：GRAB-DA。I：Vgat+ jRCaMP1b。（D） 与（C）相同，但展示的是帧间变异性（抖动），计算方式为每个信号变异系数的一阶导数（Kruskal-Wallis检验，H = 495.6685，p < 0.001；事后Mann-Whitney U检验，采用Bonferroni校正：平滑 vs 单部位回归 ***p < 0.001，平滑 vs 多部位回归 ***p < 0.001，单部位 vs 多部位 ***p = 0.0006）。 完整的统计检验及结果列表见表3。请点击此处查看此图的放大版本。

图5．双色光纤光度法的多部位展示。 在社交行为期间（居民-入侵者测试，入侵者进入阶段），同时记录多种指示剂类型的代表性信号。图中显示了同一动物社交行为相关脑区中未经归一化、已减去基线但未校正运动伪影的GCaMP6f（Cre阴性神经元）、jRCaMP1b（GABA能Vgat-Cre+神经元）和GRAB-DA1m（伏隔核中的多巴胺传感器）信号轨迹。请点击此处查看该图的放大版本。

表1. 针对每个目标社会行为网络脑区的病毒坐标及纤维长度。 请点击此处下载该表格。

表2. 多部位光纤光度法中运动伪影校正方法的比较。 以下运动伪影校正方法的基本原理、最佳适用场景、优势与局限性：简单线性回归、采用L1正则化的Lasso回归（使用多预测因子方法）、贝叶斯生成模型、基于频率的缩放法以及迭代重加权最小二乘法。请点击此处下载该表格。

表3. 图4中所用统计检验的详细信息与结果。 请点击此处下载该表格。

补充文件 1。 光纤连接器的 3D 打印文件。请点击此处下载该文件。

补充文件2：无通孔式光纤跳线连接器的3D打印文件。请点击此处下载该文件。

补充文件3。立体定向钻孔附件的3D打印文件。请点击此处下载该文件。

补充文件4. 定制抛光夹具蓝图。请点击此处下载该文件。

补充文件5：用于靶向12个SBN位点的多部位光度测量阵列的3D打印文件。请点击此处下载该文件。

补充文件6. 用于多部位光度测量阵列的3D打印文件，不包含穿孔以靶向特定部位。请点击此处下载该文件。

补充文件7. 数据采集软件的DAQ配置文件。请点击此处下载该文件。

补充文件8. 光度测量系统的视觉编码文件。请点击此处下载该文件。

补充文件9：在方案步骤4中使用以及用于校正运动伪影比较的Python代码。请点击此处下载该文件。

讨论

光纤光度法是一种有用且经济高效的技术，可用于记录自由活动动物深部脑区或特定细胞类型的群体钙活动³。同时记录多个脑区的信号，可使研究者在自然行为或固定头部的实验条件下，比较不同脑区或投射通路之间的动态变化^5,7,12。本文详细描述了利用定制的光纤阵列和商用相机系统，在全脑皮层下“社会行为网络”中最多12个脑区进行双色记录的方法。下文将讨论实施该方法的关键步骤、可能的改进方案与故障排除策略，以及该方法相对于现有技术的优势与局限性。

该方案包含三个主要阶段。首先，多光纤阵列和光纤跳线的制备需要使用定制的3D打印部件，并在立体定位坐标处进行钻孔，随后插入光纤、抛光并进行质量控制，以确保光传输效率≥75%。精确的钻孔对准（±0.03 mm公差）和充分的抛光至关重要。常见的失败情况包括光传输效率低（<75%）以及光纤通孔堵塞。低效率通常源于光纤切割过程中的表面瑕疵或抛光不当。解决方案包括在插入前通过明场显微镜检查每根光纤端面是否无瑕疵（步骤1.1.6.2），使用完整的研磨粒径递进流程重新抛光（6 µm → 0.01 µm，步骤1.1.6.1），并确保光纤切割刀片锋利。为提高通量，实验室可采用工作流程改进措施，例如使用精密平移台或基于激光的切割系统定制光纤切割夹具（步骤1.2.4）。具备高精度系统的商用3D打印制造商可减少手动钻孔需求（步骤1.1.3–1.1.4，步骤1.2.3），但不同批次间的尺寸精度可能存在差异。

其次，手术植入包括颅骨调平（±0.03 mm 公差）、在11–12个位点进行病毒注射，以及多光纤阵列植入，随后用牙科水泥固定。当颅骨调平超出公差范围时，靶向精度会受到影响。可通过在前后方向上相距8.25 mm的多个点测量俯仰角，并在±2.0–2.5 mm的侧向位置测量横滚角来缓解该问题，同时确保耳杆完全稳定颅骨。病毒注射微量移液管中的气泡会影响递送准确性，必须重新准备微量移液管（步骤2.9）。在多光纤阵列植入过程中，应从颅骨表面向上构建水泥锥体（步骤2.10.3–2.10.5），避免水泥接触光纤尖端，并确保足够的干燥时间（≥15分钟）。

第三，记录与数据处理包括通过DAQ系统进行相机同步、LED功率校准（每根光纤输出0.1 mW，12根光纤束输出1.2 mW）以及使用等吸收点信号进行信号预处理。本文介绍的运动校正流程采用Lasso回归方法，该方法非常适合多通道预测变量配置，因为它能自动将无信息量的预测变量收缩至零，仅保留对伪迹校正具有实际贡献的变量。这一特性使其在双色光度测量中具有显著优势：通过将红、绿双通道的等吸收点信号均作为预测变量输入，Lasso可选择性地利用携带真实运动信息的通道，从而在红通道（RCaMP）信号中实现比仅使用同光纤校正更显著的噪声抑制效果（图4C–D）。由于Lasso能够自动识别最具信息量的预测变量，因此强烈建议将所有可用的等吸收点通道信号作为输入。需要指出的是，Lasso回归只是多种有效校正方法之一；其他可选方法包括贝叶斯生成模型⁴⁶、基于频率的比例缩放⁴⁷以及迭代重加权最小二乘法（IRLS）⁴⁸，这些方法均可能实现相当的伪迹抑制效果，具体实施建议详见表2。若在优化预处理后信号质量仍持续不佳，则很可能提示存在硬件或手术操作问题，应重新检查步骤1–2。

除了这些操作上的考虑之外，双色光度测量还带来了与光谱分离相关的额外技术挑战。在双色光度测量中，一个关键问题是管理绿色和红色钙指示剂之间的光谱重叠。尽管由于GCaMP和RCaMP的发射光谱存在重叠，完全消除光谱串扰具有挑战性，但我们采用时间复用方法，结合交错式LED激发（GCaMP使用470 nm，RCaMP使用560 nm，等吸收点为415 nm）以及优化的带通发射滤光片，已显著缓解了这一问题。在实际应用中，我们观察到串扰极小：470 nm激发在红色通道中引起的信号可忽略不计，同样，560 nm激发在绿色通道中也几乎不产生响应（图3）。对于关注残余光谱重叠的研究人员，还可通过根据其特定的指示剂组合选择具有最大光谱分离度的窄带发射滤光片，进一步优化系统性能。

与其他大规模神经记录方法相比，定制的双色多通道光纤光度法具有诸多显著优势。首先，与单根光纤光度法相比^1,2,3，现代细胞外记录^4,6或皮层表面成像方法^8,9 局限于单个或空间上受限的一组脑区（例如，在大脑皮层表面），我们在此分享的可定制3D打印设计可利用200 µm光学纤维靶向全脑任意位置的多达12个脑区。相比之下，市面上可购得的多光纤插芯^5,7 仅支持100 µm光纤，且同样受限于套管线性排列正下方的有限脑区。在针对特定脑区进行靶向和记录时，主要的权衡在于光纤直径与光度测量系统视场范围之间的关系。配备200 µm光纤的3D打印多光纤阵列，相较于 commercially available 多光纤套管，可在每个记录位点覆盖更大的区域。在本实验方案中，光度测量系统的相机视场限制了最多只能记录12根200 µm光纤。这一限制可通过将光纤直径减小至100 µm（最多支持60根光纤）或构建配备更大相机物镜的定制化光度测量系统来克服。

最后，这一可定制的双色多部位光纤光度测量平台已被用于纵向追踪11-12个脑区中两个遗传上不同的神经元群体的神经活动动态。在Vgat-cre小鼠中，利用Cre导入/Cre排除策略，在SBN神经元群体中分别表达依赖Cre的RCaMP和排除Cre的GCaMP，研究发现攻击性经历和观察行为均可在未来的防御性社交互动中促进全SBN范围活动动态的共通模式⁴²。在Esr1-cre小鼠中采用相同的病毒策略，记录雌激素受体α表达与非表达神经元，发现特定领地的社交行为模式与全SBN范围内社交行为编码的快速、激素敏感性重标度相关，从而在个体所属领地内增强与行为相关的神经活动⁴³。这些与领地相关的行为了异及网络编码差异依赖于雄性小鼠体内循环的睾酮。尽管这些研究采用了病毒方法和单一Cre品系，未来的研究可通过交叉病毒策略、基因编码的钙指示剂，或神经调节剂与神经肽信号的荧光报告系统进一步拓展这些方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#76 钻头	Drill Bit City	#76
#78 钻头	Drill Bit City	#78
#92 钻头	Drill Bit City	#92
0.01 μm 研磨膜片	ThorLabs	LFCF2
0.25 mm x 5.5 mm 钻头	Drill Bit City	定制产品	0.25 x 5.5 mm 钻头，已联系公司定制
1 μm 研磨膜片	ThorLabs	LF1D
12 通道光纤分束连接线	Doric Lens	CustomBBP(12)_200/220/3000-0.37 _5m_SMA-12xCL_LAF
200 μm 光纤	ThorLabs	FT200UMT
3 μm 研磨膜片	ThorLabs	LF3D
30 μm 研磨膜片	ThorLabs	LF30D
6 μm 研磨膜片	ThorLabs	LF6D
可吸收缝合线	Ethicon	J421H
自适应迭代重加权惩罚最小二乘法文档	Google	N/A	https://code.google.com/archive/p/airpls/
合金钢定位销	McMaster-Carr	98381a983
行为记录摄像头	Teledyne FLIR	Blackfly S
Bonsai	Bonsai Software Foundation	版本 2.9.0
明场显微镜	Leica	ES2
血管夹	FineScienceTools	18038-45
数据采集设备（DAQ）	Measurement Computing	MC USB-200 系列 DAQ
数据采集软件	Measurement Computing	DAQami
钻孔机	Kopf Instruments	Model 1911 立体定位钻孔机
光纤切割器	ThorLabs	XL411/CLVB
光纤光度测量系统	Neurophotometrics	FP3002
光纤光度测量系统说明书	Neurophotometrics	N/A	设备说明书网页：https://neurophotometrics.com/documentation
光纤刻痕器	ThorLabs	S90C
光纤剥线器	ThorLabs	T10S13
精细镊子	FineScienceTools	11252-00
精细剪刀	FineScienceTools	14084-08
G5 驱动螺钉	Open Ephys Production Site	OEPS-7105
G5 螺丝刀	Open Ephys Production Site	OEPS-7121
GCaMP6f	PNI Viral Neuroengineering Lab	EF1a-Cre out-GCaMP6f-WPRE-hGHpA
GRAB-DA	Addgene	hSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
加热垫	Adroit Medical Supplies	HTP-1500
加热系统	Kent Scientific	RT-0515
异氟烷	Covetrus	29405
jRCaMP1b	Addgene	pAAV.Syn.Flex.NES-jRCaMP1b.WPRE.SV40
M0.6 黄铜六角螺母	MetricScrews.us	21614
Metabond 水泥试剂与工具	Parkell	S380
MicroFine ABS 类树脂 3D 打印件	ProtoLabs	定制产品	参见补充代码文件 1-3、5、6
纳升注射器	Drummond Scientific Company	Nanoject II	纳升注射器
石蜡膜片	Amcor	ParaFilm M 通用实验室膜
移液器	ThermoFisher Scientific	4641310N
抛光夹具（Polishing Puck）	普林斯顿大学物理系机械车间	定制产品	参见补充代码文件 4
光功率计	ThorLabs	PM100D
Puralube 光学润滑软膏	Dechra	P1490-1
Python	Python Software Foundation	N/A
用于连接线的软塑料管	McMaster-Carr	3774N4
SpinView	Teledyne FLIR	版本 1.25.0.52	控制行为摄像头的成像软件
立体定位仪	Kopf Instruments	Model 1900
TMAC 文档	N/A	N/A	TMAC 代码：https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
立体定位仪用管路	Saint-Gobain	E-3603
麻醉蒸发器	Kent Scientific	VetFlo 麻醉蒸发器