从绿藻Tetraspora sp. CU2551中纯化与鉴定抗菌蛋白

Tanaporn Klinsanit; Yothawut Tonawut; Natwikar Laokua; Rawirat Pansomsuay; Wanthanee Khetkorn; Cherdsak Maneeruttanarungroj

doi:10.3791/70066

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方法文章

从绿藻Tetraspora sp. CU2551中纯化与鉴定抗菌蛋白

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DOI：

10.3791/70066

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2026年2月17日

Tanaporn Klinsanit¹ , Yothawut Tonawut¹ , Natwikar Laokua¹ , Rawirat Pansomsuay¹ , Wanthanee Khetkorn² , Cherdsak Maneeruttanarungroj¹^,³

¹Department of Biology, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang, ²Division of Biology, Faculty of Science and Technology, Rajamangala University of Technology Thanyaburi, ³Bioenergy Research Unit, School of Science, King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用多种技术研究完整抗菌蛋白的工作流程，包括优化蛋白提取缓冲液、藻类细胞破碎、离子交换色谱法进行蛋白分级、SDS-PAGE进行蛋白分离以及抗菌活性检测。随后通过LC-MS/MALDI-TOF分析对活性蛋白进行验证和鉴定。

摘要

抗菌耐药性（AMR）是一种日益严重的全球健康威胁，亟需发现新型抗菌剂。藻类来源的蛋白质和多肽因其生物活性潜力而受到越来越多的关注；然而，针对绿藻（尤其是Tetraspora sp. CU2551）中抗菌肽（AMPs）研究的标准化方案仍十分有限。本方案详细描述了从绿藻Tetraspora sp. CU2551中分离、纯化和表征具有抗菌活性的完整蛋白质的逐步操作流程。该流程整合了优化的蛋白质提取、色谱分级分离、电泳分离、抗菌活性筛选以及蛋白质鉴定。首先优化蛋白质提取条件，以降低缓冲液组分带来的背景抑制效应。当活性肽的身份未知时，采用下拉实验评估蛋白质在不同离子交换树脂上的结合能力，从而指导选择合适的纯化介质。DEAE-Sepharose离子交换色谱法适用于富集抗菌蛋白组分。所有组分均系统地进行抗菌活性评估，并通过SDS-PAGE分析。对应于最高抗菌活性且具有独特电泳图谱的蛋白条带被切下，进行LC-MS/MALDI-TOF分析以实现蛋白质鉴定。该工作流程进一步结合in silico分析，利用公开可用的生物信息学工具预测与抗菌肽相关的性质。本方案为抗菌蛋白的发现提供了灵活的框架，可轻松适用于其他藻类物种及相关生物技术应用。

引言

抗菌耐药性（AMR）日益成为全球健康的重大挑战¹，凸显了持续探索从天然来源中发现新型抗菌剂策略的重要性。尽管目前针对藻类来源蛋白质和多肽的抗菌特性研究日益增多²^,³，但大多数研究集中于多肽或水解物为基础的方法⁴，而用于保持和评估完整藻类蛋白质活性的标准化方法仍较为有限⁵。本文介绍了一种旨在从绿藻Tetraspora sp. CU2551中分离、纯化并评估其完整蛋白质抗菌活性的方法。

本方案概述了一个逐步操作流程，涵盖全蛋白提取、离子交换色谱法分馏、抗菌特性评估、基于凝胶的蛋白质分离、质谱法进行蛋白质鉴定，以及利用生物信息学技术预测抗菌肽。抗菌剂的有效性通过标准琼脂扩散法和液体生长抑制试验，在典型的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌菌株上进行评估⁴^,⁶。该方法能够将鉴定出的抗菌活性与特定的蛋白质组分或电泳条带关联起来，而非依赖于肽段消化混合物或仅基于计算预测的结果，从而避免因经典数据库定义的局限而遗漏抗菌蛋白质或类似抗菌肽（AMP-like）序列的识别⁷^,⁸。

遵循本方案可使读者可靠地获得含有潜在抗菌蛋白序列的生物活性蛋白组分，适用于后续的验证和功能评估。代表性研究结果表明，已鉴定出包含已知和未知蛋白候选物的生物活性组分。本方案为从藻类及其他生物来源获得的完整蛋白质中鉴定抗菌物质提供了一个通用且实用的框架。

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方案

本研究未涉及人类参与者、动物或脊椎动物实验对象。所有实验操作均遵循泰国国王蒙古库特拉邦理工学院（King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang，KMITL）理学院的机构生物安全与科研伦理指南进行。所有微生物实验均在生物安全二级（BSL-2）实验室条件下进行，符合世界卫生组织（WHO）及国家生物安全标准⁹。

在所有实验操作过程中，均需佩戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套和口罩。化学废弃物及含银废弃物应按照机构的危险废物管理指南进行收集和处理，再交由有资质的废物处理公司处置。

在化学通风橱中配制危险化学品的高浓度储备液，包括十二烷基硫酸钠、β-巯基乙醇以及含甲醛的银染试剂。实验过程中应使用低工作浓度和小体积试剂，在实验台面上操作时须遵循标准实验室安全规范。

1. 藻类培养

注意：在整个藻类培养过程中需保持无菌条件。

起始培养物制备
1. 制备无菌TAP培养基（pH 7.0）¹⁰，分装150 mL至无菌500 mL锥形瓶中。
2. 在I级生物安全柜中采用无菌操作技术，以1%（v/v）接种量将Tetraspora sp. CU2551过夜培养物接种至培养基中。
3. 将培养物置于光照摇床中，在35 °C、120 rpm、光强45.9 µmol/m²/s条件下培养48 h。将完全生长的培养物作为扩大培养的起始种液。
扩大培养与细胞收获
1. 将25 mL起始培养物转移至275 mL新鲜无菌TAP培养基中，在相同条件下培养48 h。
2. 在25 °C下以3,800 × g离心15 min收集藻细胞。
3. 用无菌蒸馏水洗涤细胞沉淀一次，并在25 °C下以3,800 × g再次离心15 min。
4. 彻底移除上清液，将藻细胞沉淀于−20 °C保存，待后续处理。

2. 裂解缓冲液的配制与背景抑制效应筛查

注意：操作 SDS 和 β-巯基乙醇时需佩戴橡胶或腈类手套。浓 β-巯基乙醇试剂瓶应在化学通风橱中打开。

裂解缓冲液的制备
1. 制备参考裂解缓冲液¹¹，其成分为含0.1% w/v SDS和38 mM β-巯基乙醇的10 mM Tris-HCl（pH 9.0）。
  注意：关键步骤：优化SDS和β-巯基乙醇浓度，以避免出现假阳性抗菌活性。
2. 通过改变十二烷基硫酸钠（SDS）（0、0.01、0.05或0.1% w/v）和β-巯基乙醇（0、0.5、1或2 mM）的浓度，配制全因子组合的裂解缓冲液，共生成16种配方。
  注意：所有测试的裂解缓冲液配方组成汇总于表1。β-巯基乙醇需在使用前立即加入。
背景抗菌活性筛选
1. 使用打孔器从Whatman No. 42滤纸上制备直径6 mm的纸片。将每种裂解缓冲液配方各5 µL加至纸片上，并依据CLSI指南⁶进行纸片扩散法检测。将检测平板在37 °C下孵育20小时，并评估抑菌圈。
  1. 针对以下菌株进行测试：Bacillus subtilis TISTR 1248、Staphylococcus aureus TISTR 746、Escherichia coli TISTR 074 和 Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370。
2. 选择无抑制活性的配方用于后续蛋白质提取。

3. 蛋白质提取

注意：超声处理和离心过程中应保持样品处于低温环境。

在37 °C下解冻冷冻的藻类沉淀（来自步骤1.2.5），然后在−20 °C下重新冻结。重复冻融循环（-20 °C / 37 °C）3次。
加入最佳裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 9.0，0.01% SDS，2 mM β-巯基乙醇）至终体积为5 mL，并在后续处理过程中将样品保持在冰上。使用探头式超声处理（25 kHz，500 W，40%振幅，开1秒/关1秒，持续5分钟）破碎细胞。
根据制造商说明加入蛋白酶抑制剂混合物，并轻轻混匀。
在4 °C下以3,800 × g离心15分钟，收集上清液作为粗蛋白提取物。
在4 °C下以10,000 × g离心10分钟，进一步澄清提取物。收集上清液并储存在4 °C。

4. 抗菌活性评价

纸片扩散法
1. 在营养琼脂培养基中于 37 °C 培养致病菌（Bacillus subtilis TISTR 1248、Staphylococcus aureus TISTR 746、Escherichia coli TISTR 074 和 Pseudomonas aeruginosa TISTR 2370）16–18 小时。
2. 使用无菌铝环从琼脂表面刮取菌落，并重悬于 0.9% (w/v) NaCl 溶液中。将细菌悬液调整至 0.5 麦氏标准浓度，并均匀涂布于 Mueller-Hinton 琼脂平板上。
3. 将无菌纸片放置于接种后的琼脂表面，每张纸片上加入 5 µL 待测样品。于 37 °C 培养 16–20 小时后，使用游标卡尺测量抑菌圈直径。
  注意：所有纸片之间应保持等距。
最低抑菌浓度（MIC）与最低杀菌浓度（MBC）测定
1. 在 4 倍浓度 Mueller-Hinton 肉汤中制备浓度为 2 × 10⁶ CFU/mL 的细菌悬液。
2. 将 50 µL 细菌悬液和 100 µL 系列稀释的蛋白样品加入 96 孔板中，并用 10 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5）调节各孔终体积至 200 µL。
3. 以 5 µL 链霉素（50 µg）作为阳性对照；以 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）和 0.9% (w/v) NaCl 作为阴性对照。
4. 于 37 °C 培养 20 小时，以无可见细菌生长的最低浓度确定 MIC。
5. 将澄清孔中的等分样品接种至 Mueller-Hinton 琼脂平板，以确定 MBC。
细菌生长曲线测定
1. 在 2 倍浓度 Mueller-Hinton 肉汤中制备浓度为 1 × 10⁶ CFU/mL 的细菌悬液。
2. 在 96 孔板中，将 100 µL 细菌培养物与 100 µL 蛋白样品于 37 °C 共同孵育 20 小时。
3. 以 5 µL 链霉素（50 µg）作为阳性对照；以无菌蒸馏水、10 mM Tris-HCl（pH 7.5）以及含 500 mM NaCl 的 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）作为对照。
4. 使用酶标仪每隔 30 分钟测定一次 OD₆₀₀，测量前进行轨道式间歇振荡 2 分钟。
5. 绘制生长曲线并计算比生长速率。
  注意：高浓度蛋白可能干扰光密度测定结果。

5. 拉下实验与蛋白质纯化

拉下实验
1. 用 10 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）平衡 DEAE-Sepharose 树脂，或用 10 mM 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）平衡 CM-Sepharose 树脂。
2. 将 100 µL 平衡后的树脂与 500 µL 粗蛋白提取物混合，然后加入 100 µL 相应的平衡缓冲液（DEAE 使用 10 mM Tris-HCl，pH 8.0；CM 使用 10 mM 磷酸盐缓冲液，pH 7.0）。轻轻翻转混合（10 次翻转），进行孵育。
3. 短暂离心，收集上清液，并通过纸片扩散法检测其抗菌活性。
4. 选择工作树脂（DEAE-Sepharose）。为优化 pH，分别用 pH 7.0、7.5、8.0、8.5 或 9.0 的 10 mM Tris-HCl 缓冲液平衡树脂，并按步骤 5.1.1–5.1.3 操作。
5. 选择显示抗菌活性的 pH 条件用于离子交换色谱。
基于离子交换色谱的蛋白纯化
1. 将 DEAE-Sepharose 树脂装入玻璃色谱柱（柱床体积 16 mL），并在 25 °C 下用 10 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 7.5）平衡 10 个柱体积。
2. 以 8 mL/min 的流速上样 15 mL 粗蛋白提取物（第 3.6 节）。
3. 用平衡缓冲液洗涤柱子，直至 280 nm 处的吸光度低于 0.05。
4. 在 500 mL 体积内以 8 mL/min 流速，使用 10 mM Tris-HCl（pH 7.5）中线性 0–500 mM NaCl 梯度洗脱结合的蛋白。
5. 收集 5 mL 的组分，监测 280 nm 和 220 nm 处的吸光度，并将组分置于冰上。在进行抗菌筛选和蛋白分析前，将组分储存于 4 °C。

6. SDS-PAGE 和银染色

注意：请在化学通风橱中配制银染溶液，并穿戴适当的个人防护装备。所有溶液均需新鲜配制。

使用12% SDS-PAGE¹²分离蛋白质组分，并通过银染¹³显色观察条带。
切下目标蛋白质条带，送样进行MALDI-TOF MS分析。
通过在NCBInr数据库中搜索鉴定蛋白质。

7. 抗菌肽预测

从 NCBInr 分析中获取候选蛋白序列。
利用公开可用的抗菌肽预测工具（例如 DBAASP、APD3、AMPScanner、CAMPR4）和数据库评估抗菌潜力。
提取预测结果，包括抗菌概率评分、预测分类以及理化性质（净电荷、疏水性残基含量、GRAVY 指数 [ExPASy ProtParam] 和两亲性）。
整合多个平台的计算结果，优先选择候选抗菌蛋白用于后续验证。
注意：in silico 预测有助于候选蛋白的筛选，但不能作为抗菌肽的最终分类依据。

8. 统计学检验

所有实验均需进行三次生物学重复。采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行邓肯多范围检验（Duncan's multiple range test）或适当的事后检验，置信水平为95%。

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结果

该基于完整蛋白质的工作流程结合了优化的蛋白质提取、离子交换分级分离、抗菌活性筛选及蛋白质鉴定，成功实现了对中国台湾绿藻Tetraspora sp. CU2551中生物活性蛋白组分的检测。本方案旨在最大限度减少背景干扰，同时保持天然蛋白质的完整性，从而可将抗菌活性直接关联至特定的色谱组分和电泳条带。

裂解缓冲液的优化对于获得可解读的结果至关重要。原始缓冲液表现出内在的抗菌活性（表2），导致出现假阳性抑制结果。通过对16种配方进行系统性测试，确定了一种优化缓冲液，其成分为0.01%（w/v）SDS和2 mM β-巯基乙醇（表1），可消除背景干扰效应。拉下实验表明，抗菌活性仅与结合于DEAE-Sepharose的带负电荷蛋白质相关（表3）。随后的DEAE离子交换层析共收集到90个组分，根据280 nm和220 nm处的吸光度检测，蛋白质在第4至第20组分中被洗脱（图1）。纸片扩散法仅在第11组分中检测到抑制作用...

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讨论

为使用本方案获得可靠的抗菌读数，必须严格控制若干关键步骤，尤其是在蛋白质提取和早期生物活性筛选过程中。优化裂解缓冲液至关重要，因为缓冲液组分引起的背景抑制是抗菌蛋白筛选中假阳性结果的常见来源。原始缓冲液配方¹¹所观察到的抗菌活性凸显了这一问题，因为SDS可通过插入磷脂双分子层破坏细菌膜¹⁴，而高浓度的β-巯基乙醇可能通过干扰氧化还原平衡并破坏与细胞包膜相关的蛋白质，从而影响细菌活力¹⁵^,¹⁶。因此，将SDS降低至0.01%（w/v）、β-巯基乙醇降低至2 mM是一项关键的改进，可在维持高效藻细胞破碎和蛋白质稳定性的前提下，消除可检测的背景抑制。这些步骤强调了在从复杂生物提取物中筛选抗菌活性时，验证试剂与下游生物测定兼容性的重要性。

除了缓冲液优化外，还引入了方法学改进和故障排除策略，以确保实验的稳健性和可重复性。在进行柱层析之前，拉下实验（pull-down assay）...

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披露

作者声明无任何利益冲突。

致谢

本研究得到了来自拉姆康恒国王理工学院理学院向 C. Maneeruttanarungroj 提供的研究资助（RA/TA-2566-M-013）以及拉姆康恒国王理工学院向 Y. Tonawut 提供的研究资助（KREF016329）。质谱分析由泰国玛希隆大学医学技术学院蛋白质组学服务单元完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名	公司	目录编号	评论
丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液	伯乐实验室	1610156	用于 SDS-PAGE 凝胶制备化学类
酒精灯 / 本生灯	多种	—	无菌操作技术仪器类
AMPScanner	乔治·梅森大学（Veltri 等）	—	基于深度学习的抗菌肽预测工具类别：软件 / 数据库
抗菌肽预测工具（DBAASP, APD3, AMPscanner, CAMPR4）	多种学术资源	—	体外生物信息学抗菌肽分析类别：软件 / 数据库
APD3	Wang 实验室，内布拉斯加大学	—	抗菌肽数据库类别：软件 / 数据库
高压灭菌	Tomy	—	培养基与材料的灭菌仪器类
I/II级生物安全柜	多种	—	无菌操作仪器类
BioTool 2.0	布鲁克道尔顿公司	—	质谱图与肽段可视化工具类别：软件
Bradford 试剂	默克	B6916	蛋白质定量化学类
CAMPR4	印度理工学院孟买分校	—	抗微生物肽的收集类别：软件 / 数据库
离心机，Eppendorf 5415R 制冷微量离心机	Eppendorf	—	微量离心仪器类别
离心机，Thermo Scientific Megafuge 8R	Thermo Fisher Scientific	—	大体积离心仪器类别
色谱柱（玻璃）	多种	—	离子交换层析类别：玻璃器皿
CM-Sepharose 树脂	默克	CEF100	阳离子交换树脂类别：化学（树脂）
棉签	多种	—	细菌接种类别：塑料器皿
比色皿，石英	Hellma Analytics	—	紫外分光光度法类别：玻璃器皿
DBAASP	俄罗斯生物有机化学研究所	—	抗菌活性与肽结构数据库类别：软件 / 数据库
DEAE-Sepharose 树脂	默克	DEFF100	阴离子交换树脂类别：化学（树脂）
锥形瓶，100 mL	多种	—	藻类培养类别：玻璃器皿
500 mL 锥形瓶	多种	—	藻类培养类别：玻璃器皿
Escherichia coli TISTR 074	泰国TISTR	—	测试微生物类别：生物材料
ExPASy ProtParam	瑞士生物信息学研究所	—	用于计算蛋白质理化性质的在线工具类别：软件 / 数据库
甲醛	默克	1.04002	银染类别：化学
冷冻柜（-20 °C)	多种	—	样品保存仪器类
凝胶电泳系统（Mini-PROTEAN Tetra）	伯乐实验室	—	SDS-PAGE 仪器类
玻璃试管（16 × 150 mm	派热克斯 / 德兰	—	样品处理类别：玻璃器皿
丁腈手套	多种	—	个人防护类别：塑料器皿
蛋白酶抑制剂混合物（100倍浓缩液）	Thermo Fisher Scientific	87786	蛋白酶抑制化学类
培养箱	多种	—	细菌培养仪器类
摇床培养箱	多种	—	藻类培养仪器类
接种环	任何实验室供应商	—	微生物转移类别：耗材
KCl	默克	P5405	缓冲液制备类别：化学
MALDI-TOF 质谱仪（Reflex IV）	布鲁克·达洛尼克公司	—	蛋白质鉴定仪器类别
MASCOT	Matrix Science	—	通过质谱数据鉴定蛋白质的搜索引擎类别：软件 / 数据库
MASCOT 2.2	Matrix Science	—	蛋白质鉴定类别：软件
量筒	Pyrex	—	体积测量类别：玻璃器皿
微量离心管（1.5 mL）	-	—	样品处理类别：塑料器皿
微量离心管（2.0 mL）	-	—	样品处理类别：塑料器皿
微量移液器（100–1000 µL)	-	—	液体处理仪器类别
微量移液器（1–10 µL)	-	—	液体处理仪器类
微量移液器（1–5 µL)	-	—	液体处理仪器类
微量移液器（1–5 mL	-	—	液体处理仪器类
微量移液器（20–200 µL)	-	—	液体处理仪器类别
酶标仪	BioTek	—	OD600 测量仪器类别
穆勒–欣顿琼脂/肉汤	多种	—	抗菌活性检测类别：培养基
Nanodrop / Biodrop 分光光度计	多种	—	蛋白质测定仪器类别
NCBInr 数据库	国家生物技术信息中心	—	非冗余蛋白数据库类别：软件 / 数据库
营养琼脂	-	—	细菌培养类别：培养基
纸片（6 mm）	沃特曼 No.42	—	纸片扩散法类别：塑料器皿
培养皿	多种	—	微生物培养类别：塑料器皿
pH计	Mettler Toledo	—	pH 调节仪器类别
磷酸盐缓冲液（10 mM，pH 7.0）	-	—	色谱缓冲液类别：缓冲液
Probe Sonicator (VCX500)	Sonics & 材料公司 Inc.	—	细胞破碎，500 W，20 kHz，使用探头仪器类
冰箱（4 °C)	多种	—	样品保存仪器类别
硝酸银	Sisco Research Laboratories	94118	银染化学类
氯化钠 (NaCl)	默克	S9888	洗脱缓冲液化学类
十二烷基硫酸钠（SDS）	伯乐实验室	11667289001	裂解与聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）类别：化学
分光光度计	岛津	—	吸光度测定仪器类
离心沉淀	Eppendorf	—	快速离心仪器类别
金黄色葡萄球菌 TISTR 746	TISTR，泰国	—	测试微生物类别：生物材料
链霉素	默克	S9137-25G	阳性对照化学类
Tetraspora sp. CU2551	KMITL 藻种保藏中心	—	藻株类别：生物材料
Tris乙酸盐磷酸盐（TAP）培养基	-	—	藻类培养类别：培养基
Tris-HCl	默克	—	缓冲液制备类别：缓冲液
游标卡尺	多种	—	区域测量仪器类
水浴	多种	—	温度控制仪器类别
XMASS	布鲁克道尔顿公司	—	MALDI-TOF 质谱软件类别：软件
α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）	Bruker Daltonics	—	MALDI基质化学类别

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