本方案描述了一种利用多种技术研究完整抗菌蛋白的工作流程，包括优化蛋白提取缓冲液、藻类细胞破碎、离子交换色谱法进行蛋白分级、SDS-PAGE进行蛋白分离以及抗菌活性检测。随后通过LC-MS/MALDI-TOF分析对活性蛋白进行验证和鉴定。
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本方案描述了一种利用多种技术研究完整抗菌蛋白的工作流程，包括优化蛋白提取缓冲液、藻类细胞破碎、离子交换色谱法进行蛋白分级、SDS-PAGE进行蛋白分离以及抗菌活性检测。随后通过LC-MS/MALDI-TOF分析对活性蛋白进行验证和鉴定。
抗菌耐药性（AMR）是一种日益严重的全球健康威胁，亟需发现新型抗菌剂。藻类来源的蛋白质和多肽因其生物活性潜力而受到越来越多的关注；然而，针对绿藻（尤其是Tetraspora sp. CU2551）中抗菌肽（AMPs）研究的标准化方案仍十分有限。本方案详细描述了从绿藻Tetraspora sp. CU2551中分离、纯化和表征具有抗菌活性的完整蛋白质的逐步操作流程。该流程整合了优化的蛋白质提取、色谱分级分离、电泳分离、抗菌活性筛选以及蛋白质鉴定。首先优化蛋白质提取条件，以降低缓冲液组分带来的背景抑制效应。当活性肽的身份未知时，采用下拉实验评估蛋白质在不同离子交换树脂上的结合能力，从而指导选择合适的纯化介质。DEAE-Sepharose离子交换色谱法适用于富集抗菌蛋白组分。所有组分均系统地进行抗菌活性评估，并通过SDS-PAGE分析。对应于最高抗菌活性且具有独特电泳图谱的蛋白条带被切下，进行LC-MS/MALDI-TOF分析以实现蛋白质鉴定。该工作流程进一步结合in silico分析，利用公开可用的生物信息学工具预测与抗菌肽相关的性质。本方案为抗菌蛋白的发现提供了灵活的框架，可轻松适用于其他藻类物种及相关生物技术应用。
抗菌耐药性（AMR）日益成为全球健康的重大挑战1，凸显了持续探索从天然来源中发现新型抗菌剂策略的重要性。尽管目前针对藻类来源蛋白质和多肽的抗菌特性研究日益增多2,3，但大多数研究集中于多肽或水解物为基础的方法4，而用于保持和评估完整藻类蛋白质活性的标准化方法仍较为有限5。本文介绍了一种旨在从绿藻Tetraspora sp. CU2551中分离、纯化并评估其完整蛋白质抗菌活性的方法。
本方案概述了一个逐步操作流程，涵盖全蛋白提取、离子交换色谱法分馏、抗菌特性评估、基于凝胶的蛋白质分离、质谱法进行蛋白质鉴定，以及利用生物信息学技术预测抗菌肽。抗菌剂的有效性通过标准琼脂扩散法和液体生长抑制试验，在典型的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌菌株上进行评估4,6。该方法能够将鉴定出的抗菌活性与特定的蛋白质组分或电泳条带关联起来，而非依赖于肽段消化混合物或仅基于计算预测的结果，从而避免因经典数据库定义的局限而遗漏抗菌蛋白质或类似抗菌肽（AMP-like）序列的识别7
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本研究未涉及人类参与者、动物或脊椎动物实验对象。所有实验操作均遵循泰国国王蒙古库特拉邦理工学院（King Mongkut's Institute of Technology Ladkrabang，KMITL）理学院的机构生物安全与科研伦理指南进行。所有微生物实验均在生物安全二级（BSL-2）实验室条件下进行，符合世界卫生组织（WHO）及国家生物安全标准9。
在所有实验操作过程中，均需佩戴适当的个人防护装备，包括实验服、手套和口罩。化学废弃物及含银废弃物应按照机构的危险废物管理指南进行收集和处理，再交由有资质的废物处理公司处置。
在化学通风橱中配制危险化学品的高浓度储备液，包括十二烷基硫酸钠、β-巯基乙醇以及含甲醛的银染试剂。实验过程中应使用低工作浓度和小体积试剂，在实验台面上操作时须遵循标准实验室安全规范。
1. 藻类培养
注意：在整个藻类培养过程中需保持无菌条件。
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该基于完整蛋白质的工作流程结合了优化的蛋白质提取、离子交换分级分离、抗菌活性筛选及蛋白质鉴定，成功实现了对中国台湾绿藻Tetraspora sp. CU2551中生物活性蛋白组分的检测。本方案旨在最大限度减少背景干扰，同时保持天然蛋白质的完整性，从而可将抗菌活性直接关联至特定的色谱组分和电泳条带。
裂解缓冲液的优化对于获得可解读的结果至关重要。原始缓冲液表现出内在的抗菌活性（表2），导致出现假阳性抑制结果。通过对16种配方进行系统性测试，确定了一种优化缓冲液，其成分为0.01%（w/v）SDS和2 mM β-巯基乙醇（表1），可消除背景干扰效应。拉下实验表明，抗菌活性仅与结合于DEAE-Sepharose的带负电荷蛋白质相关（表3）。随后的DEAE离子交换层析共收集到90个组分，根据280 nm和220 nm处的吸光度检测，蛋白质在第4至第20组分中被洗脱（图1）。纸片扩散法仅在第11组分中检测到抑制作用.......
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为使用本方案获得可靠的抗菌读数，必须严格控制若干关键步骤，尤其是在蛋白质提取和早期生物活性筛选过程中。优化裂解缓冲液至关重要，因为缓冲液组分引起的背景抑制是抗菌蛋白筛选中假阳性结果的常见来源。原始缓冲液配方11所观察到的抗菌活性凸显了这一问题，因为SDS可通过插入磷脂双分子层破坏细菌膜14，而高浓度的β-巯基乙醇可能通过干扰氧化还原平衡并破坏与细胞包膜相关的蛋白质，从而影响细菌活力15,16。因此，将SDS降低至0.01%（w/v）、β-巯基乙醇降低至2 mM是一项关键的改进，可在维持高效藻细胞破碎和蛋白质稳定性的前提下，消除可检测的背景抑制。这些步骤强调了在从复杂生物提取物中筛选抗菌活性时，验证试剂与下游生物测定兼容性的重要性。
除了缓冲液优化外，还引入了方法学改进和故障排除策略，以确保实验的稳健性和可重复性。在进行柱层析之前，拉下实验（pull-down assay）.......
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作者声明无任何利益冲突。
本研究得到了来自拉姆康恒国王理工学院理学院向 C. Maneeruttanarungroj 提供的研究资助（RA/TA-2566-M-013）以及拉姆康恒国王理工学院向 Y. Tonawut 提供的研究资助（KREF016329）。质谱分析由泰国玛希隆大学医学技术学院蛋白质组学服务单元完成。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 | 伯乐实验室 | 1610156 | 用于 SDS-PAGE 凝胶制备 化学类 |
| 酒精灯 / 本生灯 | 多种 | — | 无菌操作技术 仪器类 |
| AMPScanner | 乔治·梅森大学（Veltri 等） | — | 基于深度学习的抗菌肽预测工具 类别：软件 / 数据库 |
| 抗菌肽预测工具（DBAASP, APD3, AMPscanner, CAMPR4） | 多种学术资源 | — | 体外生物信息学抗菌肽分析 类别：软件 / 数据库 |
| APD3 | Wang 实验室，内布拉斯加大学 | — | 抗菌肽数据库 类别：软件 / 数据库 |
| 高压灭菌 | Tomy | — | 培养基与材料的灭菌 仪器类 |
| I/II级生物安全柜 | 多种 | — | 无菌操作 仪器类 |
| BioTool 2.0 | 布鲁克道尔顿公司 | — | 质谱图与肽段可视化工具 类别：软件 |
| Bradford 试剂 | 默克 | B6916 | 蛋白质定量 化学类 |
| CAMPR4 | 印度理工学院孟买分校 | — | 抗微生物肽的收集 类别：软件 / 数据库 |
| 离心机，Eppendorf 5415R 制冷微量离心机 | Eppendorf | — | 微量离心 仪器类别 |
| 离心机，Thermo Scientific Megafuge 8R | Thermo Fisher Scientific | — | 大体积离心 仪器类别 |
| 色谱柱（玻璃） | 多种 | — | 离子交换层析 类别：玻璃器皿 |
| CM-Sepharose 树脂 | 默克 | CEF100 | 阳离子交换树脂 类别：化学（树脂） |
| 棉签 | 多种 | — | 细菌接种 类别：塑料器皿 |
| 比色皿，石英 | Hellma Analytics | — | 紫外分光光度法 类别：玻璃器皿 |
| DBAASP | 俄罗斯生物有机化学研究所 | — | 抗菌活性与肽结构数据库 类别：软件 / 数据库 |
| DEAE-Sepharose 树脂 | 默克 | DEFF100 | 阴离子交换树脂 类别：化学（树脂） |
| 锥形瓶，100 mL | 多种 | — | 藻类培养 类别：玻璃器皿 |
| 500 mL 锥形瓶 | 多种 | — | 藻类培养 类别：玻璃器皿 |
| Escherichia coli TISTR 074 | 泰国TISTR | — | 测试微生物 类别：生物材料 |
| ExPASy ProtParam | 瑞士生物信息学研究所 | — | 用于计算蛋白质理化性质的在线工具 类别：软件 / 数据库 |
| 甲醛 | 默克 | 1.04002 | 银染 类别：化学 |
| 冷冻柜（-20 °C) | 多种 | — | 样品保存 仪器类 |
| 凝胶电泳系统（Mini-PROTEAN Tetra） | 伯乐实验室 | — | SDS-PAGE 仪器类 |
| 玻璃试管（16 × 150 mm | 派热克斯 / 德兰 | — | 样品处理 类别：玻璃器皿 |
| 丁腈手套 | 多种 | — | 个人防护 类别：塑料器皿 |
| 蛋白酶抑制剂混合物（100倍浓缩液） | Thermo Fisher Scientific | 87786 | 蛋白酶抑制 化学类 |
| 培养箱 | 多种 | — | 细菌培养 仪器类 |
| 摇床培养箱 | 多种 | — | 藻类培养 仪器类 |
| 接种环 | 任何实验室供应商 | — | 微生物转移 类别：耗材 |
| KCl | 默克 | P5405 | 缓冲液制备 类别：化学 |
| MALDI-TOF 质谱仪（Reflex IV） | 布鲁克·达洛尼克公司 | — | 蛋白质鉴定 仪器类别 |
| MASCOT | Matrix Science | — | 通过质谱数据鉴定蛋白质的搜索引擎 类别：软件 / 数据库 |
| MASCOT 2.2 | Matrix Science | — | 蛋白质鉴定 类别：软件 |
| 量筒 | Pyrex | — | 体积测量 类别：玻璃器皿 |
| 微量离心管（1.5 mL） | - | — | 样品处理 类别：塑料器皿 |
| 微量离心管（2.0 mL） | - | — | 样品处理 类别：塑料器皿 |
| 微量移液器（100–1000 µL) | - | — | 液体处理 仪器类别 |
| 微量移液器（1–10 µL) | - | — | 液体处理 仪器类 |
| 微量移液器（1–5 µL) | - | — | 液体处理 仪器类 |
| 微量移液器（1–5 mL | - | — | 液体处理 仪器类 |
| 微量移液器（20–200 µL) | - | — | 液体处理 仪器类别 |
| 酶标仪 | BioTek | — | OD600 测量 仪器类别 |
| 穆勒–欣顿琼脂/肉汤 | 多种 | — | 抗菌活性检测 类别：培养基 |
| Nanodrop / Biodrop 分光光度计 | 多种 | — | 蛋白质测定 仪器类别 |
| NCBInr 数据库 | 国家生物技术信息中心 | — | 非冗余蛋白数据库 类别：软件 / 数据库 |
| 营养琼脂 | - | — | 细菌培养 类别：培养基 |
| 纸片（6 mm） | 沃特曼 No.42 | — | 纸片扩散法 类别：塑料器皿 |
| 培养皿 | 多种 | — | 微生物培养 类别：塑料器皿 |
| pH计 | Mettler Toledo | — | pH 调节 仪器类别 |
| 磷酸盐缓冲液（10 mM，pH 7.0） | - | — | 色谱缓冲液 类别：缓冲液 |
| Probe Sonicator (VCX500) | Sonics & 材料公司 Inc. | — | 细胞破碎，500 W，20 kHz，使用探头 仪器类 |
| 冰箱（4 °C) | 多种 | — | 样品保存 仪器类别 |
| 硝酸银 | Sisco Research Laboratories | 94118 | 银染 化学类 |
| 氯化钠 (NaCl) | 默克 | S9888 | 洗脱缓冲液 化学类 |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | 伯乐实验室 | 11667289001 | 裂解与聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 类别：化学 |
| 分光光度计 | 岛津 | — | 吸光度测定 仪器类 |
| 离心沉淀 | Eppendorf | — | 快速离心 仪器类别 |
| 金黄色葡萄球菌 TISTR 746 | TISTR，泰国 | — | 测试微生物 类别：生物材料 |
| 链霉素 | 默克 | S9137-25G | 阳性对照 化学类 |
| Tetraspora sp. CU2551 | KMITL 藻种保藏中心 | — | 藻株 类别：生物材料 |
| Tris乙酸盐磷酸盐（TAP）培养基 | - | — | 藻类培养 类别：培养基 |
| Tris-HCl | 默克 | — | 缓冲液制备 类别：缓冲液 |
| 游标卡尺 | 多种 | — | 区域测量 仪器类 |
| 水浴 | 多种 | — | 温度控制 仪器类别 |
| XMASS | 布鲁克道尔顿公司 | — | MALDI-TOF 质谱软件 类别：软件 |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA） | Bruker Daltonics | — | MALDI基质 化学类别 |
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