本方案描述了一种两相酸-溶剂萃取法，用于从少量小鼠粪便样本中分离短链脂肪酸，且无需进行衍生化处理。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种利用两相酸-溶剂提取策略从小鼠低输入量粪便样本中提取短链脂肪酸（SCFAs）的实验方案。该方法适用于单个粪便样本输入量约为20–50 mg的情况，采用稀盐酸和乙酸乙酯实现无需衍生化的相分离。本方案包括粪便匀浆、酸化、有机溶剂分配和低温离心等步骤，可使用科研实验室中常见的标准实验设备完成。提取后的短链脂肪酸适用于常规气相色谱平台进行下游分析。成功实施该方案的标志是在背景噪音之上检测到清晰分辨的短链脂肪酸峰，其保留时间具有特征性，如从小鼠单个粪便样本中检测到的主要粪便短链脂肪酸（包括乙酸、丙酸和丁酸）所示。本方案通过为有限样本材料提供标准化的粪便短链脂肪酸提取流程，解决了小型动物研究中常见的操作难题，同时保持与常规分析流程的兼容性。
引言
本实验方案旨在实现从少量小鼠粪便样本中提取短链脂肪酸（SCFAs），并适用于常规基于气相色谱（GC）的分析。短链脂肪酸是一类碳原子数少于六个的挥发性有机脂肪酸，主要包括乙酸、丙酸和丁酸，主要由肠道微生物群通过发酵不可消化的膳食纤维产生1。在小动物研究中，常需对单只小鼠的代谢物进行定量分析，而此类研究中的粪便样本量通常有限，且样本需与行为学、代谢或生理表型相关联2,3,4,5,6。因此，建立一种实用的低样本量提取流程，对于依赖个体动物SCFA测量的实验设计至关重要。
现有的粪便短链脂肪酸（SCFA）分析方法存在若干方法学上的局限性。由于短链脂肪酸具有挥发性、丰度低以及生物基质复杂等特点，在粪便样本中对其进行定量分析在分析上仍具挑战性7。常规实验流程通常需要衍生化步骤、较大的样本体积以及自动化液体处理系统、专用均质化平台或固相萃取柱等专业设备8,9,10,11。这些要求可能限制方法的可及性和可扩展性，尤其在小鼠研究中，每只动物的粪便排泄量极少，且常需进行纵向采样或基因型特异性采样12,13,14。因此，目前仍缺乏一种能够在不进行衍生化的情况下从小量粪便样本中提取SCFA，并兼容常规气相色谱分析流程的实验方法。
本方案通过采用稀盐酸和乙酸乙酯的两相酸-溶剂萃取策略，填补了这一空白。该流程包括粪便样品的均质化、酸化、有机溶剂分配以及低温离心，设计适用于较小质量的粪便样本输入。与需要额外化学衍生化步骤或专用样品前处理平台的衍生化方法不同，本方案可直接提取短链脂肪酸（SCFAs），所得产物可直接用于常规气相色谱（GC）分析，并兼容标准实验室设备2。
该方法适用于需要从有限数量的小鼠粪便样本中提取短链脂肪酸（SCFA）的研究，尤其适用于需要个体水平检测或样本量受限的研究设计。该方法适用于粪便样本中常见短链脂肪酸（C2–C6）的气相色谱（GC）分析，但不适用于需要衍生化依赖性检测、超出气相色谱检测灵敏度的超痕量定量，或系统性短链脂肪酸浓度评估的应用。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
美国马萨诸塞州波士顿市马萨诸塞总医院布里格姆医疗系统（MGB）动物实验伦理委员会批准了上述动物实验方案，该方案设计旨在尽量减少动物使用数量。本方案遵守美国国立卫生研究院（NIH）的指导原则和相关规定。本手稿的撰写遵循ARRIVE指南。方案流程图见图1，所需材料列于材料表中。
图 1：实验方案示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。
1. 粪便样本的采集与制备
- 在单独的 1.5 mL 微量离心管中收集新鲜粪便（约 30 mg）样品。记录每个样品的准确粪便投入质量，以便对短链脂肪酸（SCFA）浓度进行精确归一化。
注意：确保每个样品均使用洁净的离心管、手套和镊子进行采集。所有玻璃器皿和仪器在使用前必须经过高压灭菌。本方案已验证适用于每份样品约 20–50 mg 的粪便投入量，其中以约 30 mg 作为代表性投入量。在此范围内保持提取体积恒定。 - 根据样品数量，准备相应数量的离心管并做好标记。
- 通过将浓盐酸（12 M，ACS 试剂级）缓慢加入超纯水中，配制稀释的盐酸溶液（0.5 M；pH 1–2）。
警告：盐酸具有腐蚀性，可导致皮肤、眼睛和呼吸道严重灼伤。吸入有害。 - 将样品在室温下解冻 30–45 分钟，或直至完全解冻。
2. 样品均质化与酸化
- 向每个离心管中加入 255 µL 的 0.5 M HCl 溶液。
- 取一个新管，装入 70% 乙醇用于清洁镊子。将镊子浸入乙醇中清洗，然后在干净的纸巾上擦干。
警告：乙醇易燃，可能刺激皮肤和眼睛；吸入蒸气可能导致头晕。 - 通过将研杵放入容器中，并加入 70% 乙醇直至完全浸没所有研杵，以建立乙醇浸泡环境。
- 从样品盒中取出正确的样品。打开管盖，取出一份粪便样品（约 30 mg）。
- 将粪便样品放入对应的离心管中。
- 当所有样品均放入相应的离心管后，从乙醇浸泡容器中取出一支研杵，用干净的纸巾将其擦干。
注意：每个样品应使用新的研杵。 - 使用研杵充分研磨并溶解粪便样品，参见 图 2。持续研磨粪便样品，直至获得肉眼观察均匀的悬浮液，无可见固体碎片。
图2：使用研杵研磨粪便样品。 新鲜采集的粪便样品经研磨以获得均匀一致的质地，用于短链脂肪酸（SCFA）分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 将使用过的研杵放入空盒中，以备后续清洗。
- 使用脉冲式涡旋混合器在最大转速下涡旋样品 10 秒，试管需盖紧盖子。
注意：确保离心管盖紧，防止混合液溅出。
3. 短链脂肪酸提取与相分离
- 将样品在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 10 分钟，确保离心机配平正确。
- 启动离心机后，为新的离心管标记与样品对应的标签。离心完成后，从离心机中取出样品。
- 将 200 µL 移液器调至 120 µL。离心后小心吸取 120 µL 水相上清液，避免扰动沉淀。将上清液转移至新标记的离心管中，并弃去沉淀。
- 向含有上清液的新标记离心管中加入等体积（120 µL）的乙酸乙酯。对所有样品重复此步骤。
警告：乙酸乙酯易燃，可能刺激皮肤、眼睛和呼吸系统。避免吸入蒸气及长时间接触。 - 再次将样品放入离心机。确保离心机已正确配平且转子盖已紧固。在 4 °C 条件下以 2,374 × g 离心 20 分钟。
- 离心结束后，小心吸取 120 µL 上层有机相，避免扰动下层水相。将含有短链脂肪酸（SCFA）的提取上清液转移至新的、已标记的离心管中。
注意：所收集的体积可能少于 120 µL。若两相界面存在乳化层，可延长离心时间或将样品置于冰上冷却，直至实现清晰的相分离。可选择性地平行处理不含粪便材料的程序空白样品，作为质量控制步骤，用于评估试剂或操作过程中引入的背景水平 SCFA。 - 检查之前的离心管，确保未误吸取底层液体。
注意：涉及酸添加和有机溶剂操作的步骤应迅速进行，并尽可能保持管盖密闭，以尽量减少挥发或蒸发损失。
4. 提取物的处理与储存
- 找到并正确标记提取盒，然后将提取的样品放入其中。
注意：在收集有机相后，可将提取物置于密封管中于−20 °C保存最多24小时，之后转移至−80 °C进行长期保存，此步骤可安全暂停。 - 将盒子放入−80 °C超低温冰箱中，等待短链脂肪酸（SCFA）分析。
注意：由于乙酸乙酯和短链脂肪酸（SCFA）均具有高挥发性，提取样品在−80 °C储存后应尽快进行分析。长期储存时间过长可能影响样品完整性。
5. 气相色谱分析
- 使用氢、空气和氮气的流速分别为 30、300 和 20 mL/min，通过配备游离脂肪酸固定相的熔融石英毛细管柱，采用气相色谱法分析提取的短链脂肪酸（SCFAs）。取 1 µL 有机提取物进样进行分析。
- 对于定量分析，加入内标物和校准程序（例如 2-乙基丁酸），具体方法如前所述2。
注意：详细的仪器特异性设置见参考方法14。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
上述方案将获得与粪便样本数量相对应的120 µL短链脂肪酸（SCFA）提取液。提取方案成功执行的标志是在特征保留时间处出现清晰分辨的SCFA峰，且信号强度高于背景噪声。按照所述方法操作时，该方案可获得适用于后续样本间定量比较的粪便SCFA谱。我们定量了八种SCFA：乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸和2-乙基丁酸（内标）（图3）2。
图3：采用两相酸-溶剂法提取后粪便短链脂肪酸的定量结果。 来自AD、ADWT（暴露于...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案包含多个关键步骤，可确保从小体积小鼠粪便样本中高效且可重复地提取短链脂肪酸（SCFAs）。该方案采用两相酸-溶剂萃取体系，使用确定体积的稀释盐酸和乙酸乙酯，针对短链脂肪酸作为低分子量弱有机酸的理化特性进行优化。酸化处理使短链脂肪酸转化为质子化形式，减少其与粪便基质之间的离子相互作用，从而促进后续相分离过程中的分配。通过低温离心和标准化涡旋振荡，有效促进相分离，同时最大限度降低这些化合物可能发生的挥发损失。充分的均质化处理结合可控的涡旋混合，确保样品均匀分散，这对于释放基质结合的短链脂肪酸并实现样本间一致的提取效果至关重要。此外，固定微体积转移操作以及对特定有机相的收集，可在无需衍生化或专用仪器的条件下，减少操作者依赖性带来的变异。上述步骤构成了本方案的操作核心，并直接影响所提取短链脂肪酸组分的质量。
多个实验步骤对操作者依赖性变异特别敏感，因此需要格外注意。不完全的均质化可能导致短链脂肪酸（SCFA）从粪便基质中释放不均，从而引起信号强度降低或重复样本间变异增大。通过肉眼确认形成均匀悬浮液、无可见固体碎片，是该步骤的一个实用终点。酸化是另一个关键因素：由于SCFA是弱酸，其p...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们衷心感谢美国国立卫生研究院（NIH）通过授予Yiying Zhang的R21AG065606和R21AG08176项目为本研究提供的资金支持，同时也感谢Borten家族基金会以及Tang家族向Yiying Zhang提供的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 离心机 | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge" |
| 离心管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 微量离心管架 | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| 乙酸乙酯 | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC 级，≥99.5% |
| 绿色研钵杵 | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS 认证（10 N，储备液）；使用时稀释至 0.5 M |
| 1000 μL 移液器 | USA Scientific | 7110-1000 | |
| 1000 μL 移液器吸头 | USA Scientific | 1111-2821 | |
| 乙醇 | Fisher Scientific | BP82011 | 分子生物学级，70% 溶液 |
| 200 μL 移液器 | USA Scientific | 7100-2200 | |
| 200 μL 移液器吸头 | USA Scientific | 1110-1800 | |
| 镊子 | ThermoFisher | 046638.KT | |
| 涡旋振荡器 | Fisher Scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Miniature Vortex Mixer, Purple Cup" |
参考文献
- Koh, A., De Vadder, F., Kovatcheva-Datchary, P., Bäckhed, F. From dietary fiber to host physiology: short-chain fatty acids as key bacterial metabolites. Cell. 165 (6), 1332-1345 (2016).
- Zhang, Y., et al. Transmission of Alzheimer's disease-associated microbiota dysbiosis and its impact on cognitive function: evidence from mice and patients. Mol Psychiatry. 28 (10), 4421-4437 (2023).
- Sun, Y., et al. PYY-mediated appetite control and obesity alleviation through short-chain fatty acid-driven gut-brain axis modulation by Lacticaseibacillus rhamnosus HF01 isolated from Qula. J Dairy Sci. 108 (8), 7960-7978 (2025).
- He, J., et al. Short-chain fatty acids and their association with signalling pathways in inflammation, glucose and lipid metabolism. Int J Mol Sci. 21 (17), 6356(2020).
- Fock, E., Parnova, R. Mechanisms of blood-brain barrier protection by microbiota-derived short-chain fatty acids. Cells. 12 (4), 657(2023).
- Kachoueiyan, F., et al. Butyrate: a key mediator of gut-brain communication in Alzheimer's disease. Metab Brain Dis. 40 (5), 189(2025).
- Kim, K. S., Lee, Y., Chae, W., Cho, J. Y. An improved method to quantify short-chain fatty acids in biological samples using gas chromatography-mass spectrometry. Metabolites. 12 (6), 525(2022).
- Ueyama, J., et al. Freeze-drying enables homogeneous and stable sample preparation for determination of fecal short-chain fatty acids. Anal Biochem. 589, 113508(2020).
- Papanicolas, L. E., et al. Bacterial viability in faecal transplants: which bacteria survive. EBioMedicine. 41, 509-516 (2019).
- Yao, L., et al. Quantitative analysis of short-chain fatty acids in human plasma and serum by GC-MS. Anal Bioanal Chem. 414 (15), 4391-4399 (2022).
- Zhang, C., Liu, A., Zhang, T., Li, Y., Zhao, H. Gas chromatography detection protocol of short-chain fatty acids in mice feces. Bio Protoc. 10 (13), e3672(2020).
- Zha, X., et al. Microbiota-derived lysophosphatidylcholine alleviates Alzheimer's disease pathology via suppressing ferroptosis. Cell Metab. 37 (1), 169-186.e9 (2025).
- Li, L. J., et al. Neuronal double-stranded DNA accumulation induced by DNase II deficiency drives tau phosphorylation and neurodegeneration. Transl Neurodegener. 13 (1), 39(2024).
- Zhou, H., et al. Glia-to-neuron conversion by CRISPR-CasRx alleviates symptoms of neurological disease in mice. Cell. 181 (3), 590-603.e16 (2020).
- Zhao, G., Nyman, M., Jönsson, J. A. Rapid determination of short-chain fatty acids in colonic contents and faeces of humans and rats by acidified water-extraction and direct-injection gas chromatography. Biomed Chromatogr. 20 (8), 674-682 (2006).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
