使用荧光示踪剂评估小鼠龈上皮屏障的功能性

摘要

该方案的目标是通过在 体内将不同分子大小的荧光标记右转外转涂敷在龈表面，随后使用单光子显微镜系统进行 体外 成像，从而提供一种标准化方法，定量评估小鼠牙龈上皮屏障的完整性。

摘要

牙龈上皮屏障是口腔免疫和稳态的关键前线防御。完整的上皮屏障有效防止有害物质从口腔环境中渗透，而其破坏与牙周炎和口腔扁平苔藓等疾病的发病机制密切相关。本研究中，我们建立了一种基于局部应用的方法，用于评估小鼠龈上皮屏障的完整性。首先，将不同分子量（40或70 kDa）的荧光标记右旋转变混合液，置于2%的羧甲基纤维素钠中，局部涂抹于磨牙区的唇龈表面。经过30分钟的潜伏期后，上颌骨被剥离并固定在定制支架中，以便使用单光子显微镜系统进行即时成像。该方法能够可视化和定量不同大小的示踪剂，提供牙龈上皮屏障完整性的功能性读数，适用于口腔炎症、伤口愈合和疾病建模的研究。

引言

牙龈上皮屏障构成口腔内关键的防御界面，通过选择性调节物质运输保持组织完整性，同时防止微生物^入侵1。该动态结构由分层鳞状上皮通过紧密连接复合物相互连接，精确控制细胞旁通透性，限制微生物、大分子和溶质的非选择性穿透。多种因素可能损害牙龈屏障的完整性。口腔内拥有人体第二多样化的微生物群落，超过700种细菌定殖于牙齿表面、牙龈裂隙和口腔黏膜^3,4。覆盖牙龈组织的上皮细胞持续暴露在这种密集的^{微生物环境中5}.

牙周病原体（如卟卟啉卟单胞胎）分泌的毒力因子，包括脂多糖，已被证明能破坏上皮屏障功能，从而触发牙龈组织的炎症反应并推动病理进展 ^6,7。炎症介质和机械应激因素进一步加剧屏障功能障碍，增加患口腔疾病的易感性^8.口服益生菌可能通过促进牙龈上皮屏障的稳定性来预防牙周病。然而，微生物与龈上皮细胞在调节屏障功能中的生物相互作用仍大多未被阐明。因此，开发可靠的方法来评估上皮屏障功能至关重要。

单光子激光扫描显微镜以其高分辨率和成熟的检测系统而闻名，在检测体外^{组织样本方面}尤为有价值。先进的影像学方法显著提升了对牙龈屏障特性的评估。牙龈组织的表浅特性，其上皮细胞位于距表面约100微米处，非常适合此类成像方法。我们的研究建立了一种体外评估技术，利用不同分子量的荧光标记右旋转作为细胞旁通透性示踪剂。结合单光子激光扫描显微镜，该方法能够准确量化牙龈上皮屏障功能，为牙周病机制及潜在治疗干预提供见解。

本研究确立的方案结合了局部凝胶示踪剂递送与三维体外成像，专门针对评估龈上皮屏障的独特挑战进行了优化。首先，现有的静脉示踪剂注射方法（见表1）无法精确评估局部微小上皮部位对外部因子的渗透性¹¹。其次，传统组织学方法需要脱钙和切片，这会破坏组织结构，且劳动密集且耗时 12,13,14。相比之下，我们的方案采用高粘性凝胶，以在复杂局部表面实现有效的示踪剂保留。此外，通过三维图像，它确保了示踪剂在牙龈上皮内穿透深度和分布的精确、无损量化，从而完全保留了组织的空间结构。因此，该方法特别适合在复杂且受限的口腔环境中，高分辨率时空评估牙龈上皮屏障功能。

方案

所有实验程序均经北京大学健康科学中心动物研究伦理委员会批准，并符合《实验动物护理与使用指南》（NIH出版物编号85-23,1996年修订）。在过程中，实验动物被仔细对待，以尽量减少它们的疼痛和不适。

小鼠龈上皮 体内渗透性 评估的每个工作步骤细节如下（图1A）。本研究中，我们举例说明在连接型和由 牙龈卟啉 紫性单胞菌（P. gingivalis）诱导的小鼠牙周炎模型中，检测上皮屏障功能。所有员工均接受了实验室动物福利和无菌技术的全面培训。

1. 动物处理

1. 在整个研究过程中，在标准的无病原体（SPF）条件下，12小时明暗循环，并自由提供食物和水。
2. 麻醉剂和示踪剂的制备与给药
   1. 在整个方案中保持无菌环境，并使用75%乙醇清洁的工具。
   2. 实验中使用成熟成年8-10周的雄性野生型（WT）C57BL/6J小鼠。将小鼠分为三组：一组对照组（未治疗组）和两组实验组（连接型和 牙龈啉啉诱导的小鼠牙周炎模型）。
      注意：分组时应选择体重和周龄相近的小鼠，以减少年龄和体重对龈上皮通透性的影响。结扎诱导和 牙龈啉啉诱导的小鼠牙周炎模型是常用的小鼠牙周炎模型。有关详细建模方案，请参阅连接诱导¹⁵ 和 牙龈啉弓诱导小鼠^牙 周炎模型的文献。
   3. 选择具有不重叠光谱的荧光示踪剂，如FITC标记的右旋糖酐（40 kDa;FD40）和带罗丹胺B标记的右旋糖酐（70 kDa;RD70），以确保使用对应的FITC和罗丹胺滤波器进行信号检测。
   4. 稀释示踪剂。遵循该方案，将FD40（1克/升）和RD70（1克/升）混合在2%羧甲基纤维素凝胶中，并在4°C下储存。
   5. 腹腔内注射1.25%三溴乙醇（200 mg/kg体重，15-17 μL/g体重）以麻醉小鼠。
      注意：溴乙醇溶液对光敏感。 四戊醇是一种易燃、挥发且刺激性的有机溶剂。所有涉及准备、作和施药的作必须在化学烟雾罩或极其通风良好的区域进行，严格远离任何点火源。工作人员必须佩戴适当的个人防护装备（PPE），包括手套、化学防溅眼镜和实验服。废物处理：废弃三溴乙醇溶液、 三戊醇及所有受污染物资（如注射器、移液器头、手套）必须严格按照贵机构的环境健康与安全（EHS）法规和易燃有毒化学品规程收集并作为有害化学废物处置。
3. 麻醉期间，使用反馈控热敷片将核心体温保持在37±0.5°C。涂抹红黴素眼膏以防止角膜干燥。
   注意：在整个研究过程中，为所有动物提供适当的护理。
4. 手术后，确保动物单独安置在温暖安静的恢复笼中，直到完全能活动。每天两次监测动物48小时，并在完全恢复后，根据正常姿势、活动和觅食行为评估，重新将它们放回家庭笼子。
5. 用口塞保持口腔打开，并将两种或多种不同分子量的细胞旁通透性示踪剂混合物，局部涂抹在臼齿区的唇龈表面（见图1B）。离开30分钟。如果动物吞下了混合物，请重新涂抹。
6. 上颌骨分离
   1. 涂抹30分钟渗透示踪剂后，将老鼠固定在纸板上，使其仰卧，并用胶带固定四肢。
   2. 固定后，打开口腔以隔离上颌骨。轻柔地清除周围组织，并用PBS彻底冲洗标本。
   3. 将上颌骨放在玻璃载玻片上，两侧放置塑形粘土，便于在样品上牢固安装盖玻片。

2. 单光子显微镜装置

1. 仔细将剥离的小鼠上颌骨放置在定制样品架上，确保成像时位置稳定。
2. 使用配备25×/NA 1.0水浸物镜的直立单光子显微镜拍摄图像，聚焦于上颌骨下方的固定支撑区域。
   注意：取出示踪凝胶后应立即可见荧光信号。

3. 上颌成像

1. 在选择上颌第二磨牙颊面的关注区域后，立即开始影像检查。
2. 从上颌牙龈面到100-200微米深度，获取步长为1微米的Z堆栈图像，用于三维（3D）重建。
3. 进行Z系列成像以评估上颌骨的上皮屏障渗透性。在参考软件中配置软件参数如下：
   1. 在 文件 菜单中，创建一个新文件夹，并为数据集分配描述性名称。
   2. 在 采集 标签页中，将 XY格式 设置为 512×512 ， 分辨率 为 0.99 μm/像素。
   3. 将 缩放因子 设为1。
   4. 将激发波长设定为488 nm（FD40）和561 nm（RD70），发射窗口分别为500-550 nm和570-620 nm。
      注：增益值分别设置为50（488纳米）和60（561纳米）。
   5. 对于Z系列和3D成像，请选择 ND采集模式。将 Z步 长设置为 1微米 （根据需要调整）。
4. 参数配置完成后，选择 实时 模式，在成像窗口内分别显示单个和合并荧光通道中的牙龈区域。
5. 点击 “立即运行 ”，参数配置后开始采集。

4. 渗透率测量

1. 将FD40和RD70的荧光强度分为不同通道。无需背景减法;合并Z轴切片。然后，使用ImageJ软件计算荧光强度，以评估渗透率并指示上皮屏障功能。
   1. 点击 文件 并选择 打开 ，打开单光子显微镜下拍摄的上颌照片。
   2. 进入 图片 菜单，将图片类型改为8位格式以便分析。
      注意：荧光显微镜和共軛焦系统拍摄的图像通常为RGB格式，不能直接用于荧光强度测量。它们需要拆分成单独的通道，或者直接导入单色图像。
   3. 打开 分析 菜单，选择 “集合测量”，勾选 面积、平均值和 国际测量。点击 确定确认。
   4. 选择要分析的通道并调整阈值：前往 图片 |调整 |门槛。系统会自动应用默认值和算法，通常使用红色来表示所选区域。
      注意：由于荧光图像通常采用黑色背景，请选择 “暗色背景 ”选项。
   5. 设置测量参数：前往 分析 并选择 “集合测量”。在对话框中，勾选 平均灰色值 并选择 限制至阈值。最后，点击 确定。
      注意：建议检查 显示标签 ，使图像名称出现在结果表中，便于识别实验组。
   6. 进行测量：选择 “自由手选” 工具。用光标手动且精确地描绘牙龈组织侧荧光信号区域的轮廓。点击 分析 |测量。结果表将显示，其中 IntDen 表示荧光强度。
2. 把结果复制到电子表格进行计算，然后导入以便绘制图表。
3. 相对荧光强度计算：首先，计算对照组 的平均荧光强度 。然后，将每个实验组的荧光强度值除以对照组均值，得到相对荧光强度。

结果

根据标准化协议，包含牙龈组织的小鼠上颌骨被安装在定制设计的支架上（见图1C）。显微镜检查显示牙龈内有绿色（FD40）和红色（FD70）荧光信号，显示示踪剂穿透上皮屏障。确定了人工晶状体下感兴趣的区域后，使用软件拍摄图像。对照组中，两种荧光示踪剂主要局限于牙龈表面。少量FD40和RD70渗透于牙龈上皮，清晰地勾勒出其微观结构特征。在连接组和牙 龈卟啉病治疗组中，FD40和RD70均显著渗入牙龈上皮（见图2A），表明示踪蛋白在牙龈上皮屏障上的易位显著增加，并表明牙周炎期间牙龈上皮屏障功能受破坏。对荧光强度进行半定量分析，反映示踪剂通透率增强，导致屏障完整性受损，从而证实了这些发现（见图2B）。三维成像进一步显示，连接组和牙 龈卟啉病治疗组在龈血管周围的示踪荧光分布更为广泛且弥漫（见图2C）。结果表明，4...

讨论

牙龈上皮作为防止细菌入侵的重要物理屏障，而口腔微生物则通过破坏带毒因子的屏障完整性或促进其维持，展现出双重调控能力。这些生物相互作用最终决定了组织的稳态或疾病进展^17,18。在此基础上，我们开发了创新的方法论方法，进一步研究这些机制。该技术结合局部示踪剂应用与单光子显微成像，构建了一个能够定量评估小鼠牙龈上皮屏障功能的实验系统。标准化作程序和定量分析方法的实施，显著提升了口腔黏膜屏障检测的精度和可重复性。

该方法包含几个关键的协议步骤。首先，关键的程序序列从精确示踪剂制备开始，包括在2%钠羧甲基纤维素凝胶中制备40 kDa的FITC右旋糖（FD40）和70 kDa的罗丹胺-右旋糖（RD70）。由于凝胶中荧光示踪剂对洗涤具有抗性，我们开发了这一简化方法，最大限度地减少了作迭代，并实现了更可靠的龈上皮屏障通透性评估。随后进行解剖学精确的局部涂抹，使用口塞将示踪凝胶固定在臼齿区的唇龈表面，持续30分钟。因...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
40 kDa FITC标记右旋糖酐	Sigma Aldrich	78331
70 kDa 罗丹明B标记右旋糖酐	Sigma Aldrich	R9379
Blunt 组织分离镍	北京华博公司	NZW28
羧甲基纤维素	MREDA	M049898
一次性无菌注射器	智裕公司		1 mL
ImageJ 软件	国家卫生研究院
微管	Axygen	MCT-150-C	1.5 mL
NIS-Elements AR 图像软件	尼康
磷酸盐缓冲盐水 1x	Servicebio	G4207-500
单光子显微镜 Nikon A1 MP+	尼康
组织剪刀	北京华博公司	M286-05