本实验方案旨在通过在牙龈表面局部应用不同分子量的荧光标记葡聚糖，对小鼠牙龈上皮屏障的完整性进行定量评估，提供一种标准化的方法。 体内，随后 离体 使用单光子显微成像系统进行成像。
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摘要
摘要
牙龈上皮屏障在口腔免疫和稳态中起着关键的前线防御作用。完整的上皮屏障能有效阻止口腔环境中有害物质的侵入，而其破坏则与牙周炎和口腔扁平苔藓等疾病的发生发展密切相关。本文建立了一种基于局部应用的方法，用于评估小鼠牙龈上皮屏障的完整性。首先，将含有不同分子量（40 或 70 kDa）荧光标记葡聚糖的混合物溶于 2% 羧甲基纤维素钠溶液中，局部涂抹于磨牙区唇侧牙龈表面。经过 30 分钟孵育后，分离上颌骨并固定于定制的样品 holder 中，立即使用单光子显微成像系统进行成像。该方法可实现对不同大小示踪剂穿越上皮各层情况的可视化与定量分析，为研究口腔炎症、伤口愈合及疾病模型中的牙龈上皮屏障功能完整性提供了有效的功能检测手段。
引言
牙龈上皮屏障构成了口腔内一个关键的防御界面，通过选择性调控物质转运并防止微生物侵入，从而维持组织完整性1。该动态结构由复层鳞状上皮组成，细胞间通过紧密连接复合体相互连接，精确调控细胞旁通透性，以限制微生物、大分子和溶质的非选择性穿透2。多种因素可破坏牙龈屏障的完整性。口腔是人体内多样性位居第二的微生物群落栖息地，已有超过700种细菌定植于牙齿表面、牙龈沟及口腔黏膜3,4。牙龈组织内衬的上皮细胞持续暴露于这一密集的微生物环境中5。
牙周致病菌（如Porphyromonas gingivalis）分泌的毒力因子，包括脂多糖，已被证实可破坏上皮屏障功能，从而触发牙龈组织中的炎症反应并推动病理进展6,7。炎症介质和机械应力进一步加剧屏障功能障碍，增加口腔疾病易感性8。口腔益生菌可能通过促进牙龈上皮屏障的稳定性，有助于预防牙周病。然而，微生物与牙龈上皮细胞在调节屏障功能过程中的生物学相互作用仍 largely 未被阐明9。因此，建立可靠的上皮屏障功能评估方法具有重要意义。
单光子激光扫描显微镜因其高分辨率和成熟的检测系统，已被证明在研究中具有重要价值 离体 组织样本10先进的成像方法显著提升了对牙龈屏障特性的评估能力。牙龈组织结构表浅，上皮细胞位于表面下约100 µm处，因此非常适用于此类成像技术。我们的研究已建立了一种 离体 利用不同分子量的荧光标记葡聚糖作为细胞旁通透性示踪剂的评估技术。结合单光子激光扫描显微镜，该方法可精确量化牙龈上皮屏障功能，为牙周病的发病机制及潜在治疗干预提供见解。
本研究建立的实验方案结合了局部凝胶介导的示踪剂递送与三维ex vivo成像技术，专门针对牙龈上皮屏障评估中的独特挑战进行了优化。首先，现有的静脉内示踪剂注射方法（表1）无法精确评估外部物质对局部微小上皮区域的通透性11。其次，传统的组织学方法需要进行脱钙和切片处理，这会破坏组织结构，且耗时耗力12,13,14。相比之下，本方案采用高黏附性凝胶，可在复杂的局部表面有效滞留示踪剂。此外，通过三维图像，可对示踪剂在牙龈上皮内的穿透深度和分布情况进行精确、非破坏性的定量分析，从而完整保留组织的空间结构。因此，该方法特别适用于在复杂且空间受限的口腔环境中，对牙龈上皮屏障功能进行高分辨率的时空动态评估。
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方案
所有实验操作均经北京大学医学部动物研究伦理委员会批准，并遵循《实验动物护理与使用指南》（NIH 出版物编号 85-23，1996 年修订版）。在实验过程中，对实验动物进行了精心处理，以最大程度减少其疼痛与不适。
下文描述了在小鼠牙龈上皮中进行体内通透性评估的每一步操作细节（图1A）。本文以结扎诱导和牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）诱导的小鼠牙周炎模型为例，展示了上皮屏障功能的检测方法。所有操作人员均接受了实验室动物福利和无菌技术的全面培训。
1. 动物操作
- 在整个研究过程中，动物在标准的无特定病原体（SPF）条件下饲养，保持12小时光照/12小时黑暗循环，并自由提供食物和水。 随意摄取.
- 麻醉剂和示踪剂的制备与给药
- 在整个实验过程中保持无菌条件，并使用经75%乙醇清洁的工具。
- 使用8-10周龄的雄性野生型（WT）C57BL/6J小鼠进行实验。将小鼠分为三组：对照组（未处理）和两个实验组（结扎组和 P. gingivalis诱导的小鼠牙周炎模型）
注意：分组时应选择体重和周龄相近的小鼠，以减少年龄和体重对牙龈上皮通透性的影响。结扎诱导及 P. gingivalis诱导型小鼠牙周炎模型是常用的牙周炎小鼠模型。有关详细的建模方案，请参考结扎诱导的相关文献15 和 P. gingivalis诱导的16 小鼠牙周炎模型 - 选择光谱不重叠的荧光示踪剂，例如异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖（40 kDa；FD40）和罗丹明B标记的葡聚糖（70 kDa；RD70），以确保使用相应的FITC和罗丹明滤光片能够清晰分辨信号。
- 稀释示踪剂。按照本方案，将FD40（1 g/L）和RD70（1 g/L）溶于2%羧甲基纤维素凝胶中，混匀后于4 °C保存。
- 腹腔注射1.25%三溴乙醇（200 mg/kg体重，15–17 µL/g体重）以麻醉小鼠，或按照相关机构推荐的指南进行麻醉 本地机构
注意：三溴乙醇溶液对光敏感。 叔丁基戊醇是一种易燃、挥发性且具有刺激性的有机溶剂。所有涉及其配制、操作和使用的步骤均须在化学通风橱内或通风极良好的区域中进行，并严格远离任何点火源。操作人员必须佩戴适当个人防护装备（PPE），包括手套、防化学飞溅护目镜和实验服。废液处理：三溴乙醇废液， 叔-戊醇以及所有受污染的物品（如注射器、移液器吸头、手套）必须收集并按照您所在机构的环境健康与安全（EHS）关于易燃和有毒化学品的法规与规程，作为危险化学废物处理。
- 麻醉期间，使用反馈控制的加热垫将核心体温维持在 37 ± 0.5 °C。涂抹眼用润滑剂以防止角膜干燥。
- 使用开口器保持口腔张开，并施加一个 5 μL 至 50 μL 两种或多种不同分子量的细胞旁路通透性示踪剂混合物，局部施加于磨牙区的唇侧牙龈表面（图1B）。静置30分钟。如果动物吞下混合物，需重新涂抹。
- 牙齿及牙周组织的分离
- 应用通透性示踪剂30分钟后，通过颈椎脱位法处死小鼠。将小鼠固定在纸板上，呈仰卧位，并用胶带固定其四肢。
- 固定后，打开口腔以分离上颌牙齿及牙周组织。轻轻清除周围组织，并用PBS彻底冲洗标本。
- 将牙齿和牙周组织置于载玻片上，两侧放置 modeling clay 以帮助盖玻片在样本上方稳固固定。
2. 单光子显微镜装置设置
- 将解剖好的小鼠牙齿及牙周组织小心地放置在定制设计的样品台上，确保成像时位置稳定。
- 使用配备25×/NA 1.0水浸物镜的直立单光子显微镜获取图像，聚焦于牙齿及牙周组织下方的支架区域。
注意：去除示踪凝胶后，荧光信号应立即可见。
3. 上颌牙齿及牙周组织成像
- 在第二磨牙颊面选定感兴趣区域后，立即开始成像。
- 以1 µm为步长，从上颌牙龈表面开始，获取深度为100–200 µm的Z轴层扫图像，用于三维（3D）重建。
- 进行Z系列成像以评估牙龈上皮屏障的通透性。在参考软件中将软件参数设置如下：
- 在 文件 菜单中，创建一个新文件夹，并为该数据集指定一个描述性名称。
- 在……之下 采集 标签，设置 XY 格式 到 512 × 512 与一个 分辨率 的 0.99 µm/像素.
- 设置 缩放倍数 到 1.
- 将激发波长设置为488 nm（FD40）和561 nm（RD70），对应的发射波长范围分别为500-550 nm和570-620 nm。
注意：增益值分别设置为 50（488 nm）和 60（561 nm）。 - 对于Z轴序列和三维成像，选择 ND采集模式设置 Z步进 到 1 µm （根据需要进行调整）。
- 参数配置完成后，选择 活体 模式用于在成像窗口内可视化牙龈区域的单个及合并荧光通道。
- 点击 立即运行 在参数配置完成后开始采集。
4. 通透性测量
- 将FD40和RD70的荧光强度分配至不同通道。无需进行背景扣除，合并Z轴层切图像。随后使用ImageJ软件计算荧光强度，以评估通透性并反映上皮屏障功能。
- 点击 文件 并选择 打开 打开在单光子显微镜下拍摄的上颌图像。
- 前往 图像 菜单中将图像类型更改为8位格式以进行分析。
注意：荧光显微镜和共聚焦系统捕获的图像通常为 RGB 格式，不能直接用于荧光强度测量。需要将图像拆分为单独的通道，或直接导入单色图像。 - 打开 分析 菜单，选择 设置测量参数，并检查 面积，平均值，以及 IntDen. 通过点击确认 好的.
- 选择要分析的通道并调整阈值：前往 图像 | 调整 | 阈值系统将自动应用默认值和算法，通常使用红色来标示选定区域。
注意：由于荧光图像通常具有黑色背景，也请选择 暗背景 选项 - 设置测量参数：前往 分析 并选择 设置测量参数在对话框中，选中 平均灰度值 和 限定至阈值最后，单击 好的.
注意：建议进行检查 显示标签 因此，图像名称会显示在结果表中，便于识别实验组。 - 执行测量：选择 自由选择 工具。使用光标手动精确勾画牙龈组织侧荧光信号区域的轮廓。点击 分析 | 测量结果表格将显示，其中 IntDen 表示荧光强度。
- 将结果复制到电子表格中进行计算，并导入用于绘图。
- 相对荧光强度的计算：首先，计算 平均荧光强度 对照组的平均值。然后，将每个实验组的荧光强度值除以对照组的平均值，得到相对荧光强度。
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结果
根据标准化方案，将小鼠的上颌牙齿及牙周组织（包括牙龈、牙周膜、牙槽骨和牙骨质）安装到定制的支架上（图1C）。显微观察显示，在牙龈组织中存在绿色（FD40）和红色（FD70）荧光信号，表明示踪剂已穿透上皮屏障。在目镜下确定感兴趣区域后，使用软件采集图像。在对照组中，两种荧光示踪剂主要局限于牙龈表面。仅有少量FD40和RD70穿透牙龈上皮，清晰勾勒出微观结构特征。而在结扎组和P. gingivalis处理组中，均观察到FD40和RD70大量渗入牙龈上皮（图2A），表明示踪剂跨牙龈上皮屏障的转运显著增加，证明牙龈上皮屏障功能在牙周炎期间受到破坏。对荧光强度进行半定量分析，结果显示示踪剂通透性增强，对应屏障完整性受损，从而进一步支持上述发现（图2B）。三维成像进一步显示，在结扎组和P. gingivalis处理组中，示踪剂荧光在牙龈血管周围分布更广泛且弥散程度更高（图2C）...
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讨论
牙龈上皮是抵御细菌侵入的重要物理屏障，而口腔微生物则通过毒力因子破坏屏障完整性或促进其维持，表现出双重调控能力。这些生物学相互作用最终决定了组织稳态的维持或疾病的进展17,18。在此基础上，我们建立了一种创新的方法学体系，以进一步研究这些机制。该技术结合了表面示踪剂应用与单光子显微成像，构建出一种可定量评估小鼠牙龈上皮屏障功能的实验系统。标准化操作流程与定量分析方法的应用显著提高了口腔黏膜屏障研究的精确性与可重复性。
该方法包含若干关键的实验步骤。首先，核心操作流程始于精确的示踪剂制备，即在2%羧甲基纤维素钠凝胶中配制40 kDa的异硫氰酸荧光素标记葡聚糖（FD40）和70 kDa的罗丹明标记葡聚糖（RD70）。由于凝胶中的荧光示踪剂具有抗洗脱特性，我们开发了这一简化的实验方法，可减少操作步骤的重复，并实现对牙龈上皮屏障通透性更可靠的评估。随后是解剖学定位准确的局部应用步骤，使用口腔撑开器将示踪剂凝胶精确地作用于磨牙区唇侧牙龈表面，持续30分钟。接下来，标准化的样本...
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致谢
本研究得到国家自然科学基金（项目编号 32030010、31972908、81991500、81991502）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 40 kDa FITC标记的葡聚糖 | Sigma Aldrich | 78331 | |
| 70 kDa 罗丹明B标记的葡聚糖 | Sigma Aldrich | R9379 | |
| 钝性组织分离镊（镍制） | Bejinghuabo Company | NZW28 | |
| 羧甲基纤维素 | MREDA | M049898 | |
| 一次性无菌注射器 | Zhiyu Company | 1 mL | |
| ImageJ 软件 | 美国国立卫生研究院 | ||
| 微量离心管 | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL |
| NIS-Elements AR 图像软件 | Nikon | ||
| 1×磷酸盐缓冲液 | Servicebio | G4207-500 | |
| 尼康A1 MP+单光子显微镜 | Nikon | ||
| 组织剪刀 | Bejinghuabo Company | M286-05 |
参考文献
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